银翘散配方颗粒与传统汤剂在抗炎、抗菌及镇痛药效的差异比较

Comparison of anti-inflammatory, antibacterial and analgesic activities of formulated granules versus traditional decoction of Yinqiao Powder

摘要

目的 比较银翘散颗粒和传统汤剂的抗炎、抗菌、镇痛的药效差异。 方法 采用脂多糖（LPS）诱导巨噬细胞RAW 264.7构建炎症模型，并给予银翘散（200、400、800 μg/mL），利用实时荧光PCR、Western blotting评价药物抗炎效果；采用3 dpf斑马鱼分别构建硫酸铜、尾鳍横切、LPS和Poly （I∶C）显微注射斑马鱼炎症模型，并给予银翘散（200、400、800 μg/mL），利用中性粒细胞观察和HE染色等评价药物抗炎效果；采用LPS气管滴注构建急性肺损伤小鼠模型，并给予银翘散（10、15、20 g/kg），通过计算肺湿干质量比、HE染色、酶联免疫吸附法、Western blotting等实验评价药物抗炎效果。采用微量肉汤稀释法评价银翘散颗粒及其汤剂的抗菌效果。采用热板和冰醋酸腹腔注射构建小鼠疼痛模型，并给予银翘散（10、15、20 g/kg），通过计算小鼠热板痛阈值和醋酸扭体次数评价药物镇痛效果。 结果 与模型组相比，银翘散能降低细胞内炎症因子TNF-α、IL-6、IL-1β的水平（P<0.01）和p-STAT3（Tyr 705）蛋白表达水平；银翘散能抑制斑马鱼中性粒细胞的聚集（P<0.001）；银翘散可改善肺组织损伤，下调肺湿干质量比值、p-STAT3（Tyr 705）蛋白的表达、炎症因子TNF-α、IL-6的含量（P<0.05）；银翘散在15.63、31.25 mg/mL起到抑菌作用；银翘散能减少小鼠的扭体次数，提高痛阈值（P<0.05）。 结论 银翘散配方颗粒和传统汤剂均具有抗炎、抗菌、镇痛的作用，两者除在细胞水平上抑制TNF-α、IL-6、IL-1β的mRNA表达有差异外，在其他体内外多个实验评价中药效无明显差异。

Abstract

Objective To compare the anti-inflammatory, antibacterial and analgesic effects of Yinqiao Powder (YQS) formulated granules and decoction. Methods We first evaluated the anti-inflammatory effects of the two dosage forms of YQS in a LPS-induced RAW 264.7 cell model using RT-qPCR and Western blotting. We further constructed zebrafish models of inflammation by copper sulfate exposure, caudal fin transection, or LPS and Poly (I:C) microinjection, and evaluated anti-inflammatory effects of YQS granules and decoction by examining neutrophil aggregation and HE staining findings. In a mouse model of acute lung injury (ALI) induced by intratracheal LPS instillation, the effects of YQS gavage at 10, 15, and 20 g/kg on lung pathologies were evaluated by calculating lung wet-dry weight ratio and using HE staining, ELISA and Western blotting. The microbroth dilution method was used to evaluate the antibacterial effect of YQS. Mouse pain models established by hot plate and intraperitoneal injection of glacial acetic acid were used to evaluate the analgesic effects of YQS at 10, 15, and 20 g/kg. Results Both YQS granules and decoction significantly reduced TNF-α, IL-6, and IL-1β expressions and p-STAT3 (Tyr 705) phosphorylation level in LPS-induced RAW 264.7 cells, and obviously inhibited neutrophil aggregation in the zebrafish models. In ALI mice, YQS granules and decoction effectively ameliorated lung injury, lowered lung wet-dry weight ratio, and reduced p-STAT3 (Tyr 705) expression and TNF-α and IL-6 levels. YQS produced obvious antibacterial effect at the doses of 15.63 and 31.25 mg/mL, and significantly reduced body torsion and increased pain threshold in the mouse pain models. Conclusion The two dosage forms of TQS have similar anti-inflammatory, antibacterial and analgesic effects with only differences in their inhibitory effect on TNF-α, IL-6 and IL-1β mRNA expressions in LPS-induced RAW 264.7 cells.

Graphical abstract

关键词

银翘散 / 中药配方颗粒 / 药物等效性

Key words

Yinqiao Powder / formulated granules of traditional Chinese medicine / pharmacological equivalence

中药配方颗粒，作为中药现代化的创新成果，是将传统单味汤剂通过先进的科技工艺转化而成的颗粒状制剂。该剂型便于直接冲服，省去繁琐的煎煮过程，实现了药物质量的严格把控与药效的精准释放^［1］。近年来，随着其在临床应用的推广，中药配方颗粒使用量显著增长，并赢得了患者日益增长的青睐与认可^{［2， 3］}。然而，在中药配方颗粒蓬勃发展的同时，亦暴露出一些亟待解决的问题。其中，最为突出的是单品种质量标准不够完善，包括成分含量的标准化、等量性以及等效性方面仍需进一步验证^{［4， 5］}。尤其是当多种单味药材颗粒组合成复方颗粒冲剂时缺少了传统汤剂药物间“共煎”过程中可能产生的化学与物理变化，其综合药效的发挥是否等同于传统汤剂^［6］，尚缺乏充分的科学证据支持。

银翘散是常用的辛凉解表剂，该方首见于清代医书《温病条辨·卷一·上焦篇》，“太阴风温、温热、瘟疫、冬温，初起恶风者，桂枝汤主之；但热不恶寒而渴者，辛凉平剂银翘散主之”^［7］。该方由金银花、连翘、苦桔梗、薄荷、牛蒡子、竹叶、荆芥穗、淡豆鼓、生甘草、芦根等十种药材组成。银翘散在病毒性感冒和流感的治疗中具有显著疗效^{［8， 9］}。近几年，新冠病毒（COVID-19）迅速在全球范围内大流行，再加上每年的流感高发季节，清热解毒类药物的临床使用量大幅上升，其中也包括了银翘散及其衍生的多种产品^{［10， 11］}。但目前银翘散中药配方颗粒及其传统汤剂是否药效一致，极大地影响了该药物配方颗粒的临床用药。

在银翘散的研究中，虽然已明确其具有解热^{［12，13］}、止痛^［14］、抗炎^{［12， 15］}、抗菌^［16］、抗病毒^{［17，18］}等药理作用。但现有研究存在一定局限性，对于银翘散不同剂型，如中药配方颗粒与传统汤剂，在体内外多种药效方面的对比研究很少，缺乏系统且深入的探究，无法为临床合理选用剂型提供充分的理论支撑。本研究通过对银翘散中药配方颗粒及其传统汤剂的体内外抗炎、抗菌、镇痛活性展开探讨，对比两者在不同实验条件下的药效表现，从而明确二者在药效上的差异。为临床根据不同病症、患者需求选用银翘散剂型提供科学依据，助力提升银翘散在临床应用中的有效性与安全性。

1 材料和方法

1.1 动物与细胞

BALB/c雄性小鼠（18~22 g）购于南方医科大学实验动物管理中心，动物实验已通过南方医科大学伦理委员会审核（伦理批号：NO.SMUL202312021、NO.SMUL202410040）。转基因斑马鱼（MPO-eGFP、corolla： GFP； lyz： Dsred）、野生型斑马鱼（Wild-Type），其中转基因品系斑马鱼的中性粒细胞标记为绿色或红色荧光蛋白，均由南方医科大学人类疾病斑马鱼模型和药物筛选实验室提供。小鼠单核巨噬细胞（RAW 264.7）购于北京中源合聚生物科技有限公司。

1.2 药物及试剂

银翘散组成：金银花（30 g）、连翘（30 g）、淡豆豉（15 g）、生甘草（12 g）、荆芥穗（12 g）、淡竹叶（12 g）、牛蒡子（18 g）、芦根（30 g）、薄荷（18 g）、桔梗（18 g）（康美药业），由南方医科大学晁志教授鉴定。银翘散汤剂的制备方法：按比例称取以上药材，除薄荷和荆芥穗外，其余药材加入12倍量的水浸泡30 min，用武火煎煮至沸腾后转用文火，保持微沸状态煎煮10 min，再将薄荷和荆芥穗倒入共煎5 min，滤过，取续滤液，45 ℃下旋蒸至所需浓度，将原液保存至-80 ℃冰箱24 h，使用冷冻干燥机将其制成冻干粉，4 ℃保存，使用时以沸水预热，1周内使用。以上药材对应的配方颗粒，由广东一方制药有限公司提供，按生药量的配比将十种颗粒混合加入，热水充分溶解，4 ℃保存备用。脂多糖（LPS，Sigma）；聚肌胞苷酸Poly （I：C，InvivoGen）；地塞米松注射剂（天心制药）；PrimeScript^TM RT Master Mix试剂盒、TB Green^® Premix Ex TAq^TM Ⅱ试剂盒（Takara）；小鼠IL-6、TNF-α ELISA试剂盒（达科为生物）。

1.3 仪器

BA110S电子分析天平（赛多利斯）；Biotek多功能酶标仪（宝特伯藤）；5804R低速台式离心机（艾本德）；N-1200B旋转蒸发仪（EYELA）；LightCycler^®96实时荧光定量PCR仪（罗氏）；Leica-RM2025型石醋切片机、EG1160型包埋仪，烘片机（徕卡）；冷冻干燥机（LABCONCO FreeZon）；KF-PRO-005型数字病理切片扫描仪（江丰生物）；IX 53倒置生物显微镜（奥林巴斯）。

1.4 方法

1.4.1 噻唑蓝（MTT）法测定细胞毒性

设置CON组、梯度浓度（0~1 mg/mL）的银翘散汤剂（YQS YP）、银翘散颗粒（YSQ KL）给药组，每组平行设置6个复孔。取生长状态良好的RAW 264.7细胞，以1×10⁴ /mL的细胞密度接种于96孔板，培养24 h。给予银翘散，继续培养24 h。加入10 μL/孔的MTT溶液，培养4 h。弃细胞上清，每孔加入100 μL的DMSO溶解细胞结晶产物，摇晃使其充分溶解，酶标仪检测每孔吸光值A_{570 nm}。细胞存活率%=A_给药组/A_空白组×100%。

1.4.2 LPS诱导RAW 264.7细胞构建炎症模型

取生长状态良好的RAW 264.7细胞，以3×10⁵/孔的细胞密度接种于6孔板，于37 ℃、5% CO₂培养箱中培养24 h。弃去上清，加入新培养基2 mL/孔，造模组加入LPS（1 mg/mL）2 μL/孔，银翘散配方颗粒和汤剂组按设置好的低、中、高剂量组给药（分别相当于生药200、400、800 μg/mL），于培养箱中培养24 h后收样。

1.4.3 实时荧光定量PCR（RT-qPCR）

弃去培养基上清，每孔加入1 mL Trizol^® Reagent，裂解细胞提取胞内RNA。使用逆转录试剂盒将mRNA逆转录成cDNA。参照Takara PrimeScriptIM RT Master Mix （Perfect Real Time）试剂说明书操作，使用两步法 PCR 扩增标准程序进行反应：预变性95 ℃30 s，共1次循环；PCR反应95 ℃5 s，60 ℃30 s，共40个循环；融解曲线95 ℃5 s，65 ℃60 s，95 ℃1 s，共1次循环，4 ℃放置。以β-actin作为内参基因，根据-2^△△Ct算法计算TNF-α、IL-6、IL-1β mRNA表达量，引物由上海生工生物工程有限公司合成，引物序列见表1。

1.4.4 斑马鱼急性毒性实验

挑选状态良好的3 dpf斑马鱼幼鱼，随机分配成11组（n=20）。除CON组外，将YQS YP、YQS KL分别设置5个浓度100、200、400、800、1000 μg/mL给药组。将斑马鱼和药物加入到0.02%亚甲基蓝的培养水里培养。24 h/次更换培养水和药物，连续3 d，观察斑马鱼是否有出现心包肿大、畸形、死亡的情况。

1.4.5 斑马鱼硫酸铜炎症膜型

挑选状态良好的3 dpf斑马鱼幼鱼，随机分为9组（n=30）。设为CON组、模型组、DEX组、YQS（YP、KL：200、400、800 μg/mL）组。除CON组外，每组斑马鱼加入含25 μmol/L硫酸铜溶液的培养水，同时加入药物DEX、YQS。给药培养2 h后采用0.03%三卡因对斑马鱼进行麻醉，利用体式荧光显微镜观察斑马鱼神经丘细胞区域的中性粒细胞状态和数量，并进行拍照和统计分析。

1.4.6 斑马鱼横切尾鳍炎症模型

挑选状态良好的3 dpf斑马鱼幼鱼，采用0.03%三卡因对斑马鱼进行麻醉，将麻醉状态的斑马鱼置于盖玻片上，用刀横切尾鳍后置于培养水待复苏。将复苏后的斑马鱼，随机分配成8组（n=20），除CON组（尾鳍正常斑马鱼）外，其他分组同1.4.5。给药培养4 h后，麻醉斑马鱼，利用体式荧光显微镜观察斑马鱼尾鳍区域的中性粒细胞状态和数量，并进行拍照和统计分析。

1.4.7 斑马鱼卵黄囊显微注射LPS或Poly （I∶C）炎症模型

挑选状态良好的3 dpf斑马鱼幼鱼，采用0.03%三卡因对斑马鱼进行麻醉，将麻醉状态的斑马鱼置于琼脂板上，显微注射2 nL LPS（1 mg/mL）于斑马鱼的卵黄囊中。将复苏后的斑马鱼，随机分配成8组（n=20），除CON组（注射PBS）外，其他分组同1.4.5。给药培养12 h后，麻醉斑马鱼，利用体式荧光显微镜观察斑马鱼卵黄囊的中性粒细胞状态和数量，并进行拍照和统计分析。Poly （I∶C）（1 mg/mL 2 nL）炎症模型方法同上。

1.4.8 斑马鱼病理组织变化检查

将固定好的斑马鱼放入自来水中，清洗多聚甲醛。将斑马鱼用擦镜纸包好，按顺序依次放入梯度酒精、二甲苯、石蜡中进行脱水、透明、浸蜡、包埋等操作。待组织蜡块冷却凝固后，切出4 μm厚度的组织切片。待切片烤干后进行HE染色，树脂封片晾干，显微镜下观察斑马鱼卵黄囊组织病理情况。

1.4.9 抗炎作用动物实验分组与给药

将BALB/c小鼠随机分配为9组（n=8），分别为空白组（CON）、脂多糖组（LPS 3 mg/kg）、地塞米松组（DEX 5 mg/kg）、银翘散汤剂低、中、高剂量组（YQS YP分别相当于生药量10、15、20 g/kg）、银翘散配方颗粒低、中、高剂量组（YQS KL分别相当于生药量10、15、20 g/kg）。DEX组：腹腔注射给药（0.1 mL/10 g）和灌胃等体积生理盐水；YQS给药组：灌胃给药（0.1 mL/10 g）和腹腔注射等体积生理盐水。CON组和LPS组：灌胃生理盐水（0.1 mL/10 g）和腹腔注射等体积生理盐水；1次/d，连续7 d。第7天给药1 h后，气管滴注LPS造急性肺损伤模型，8 h后取材。

1.4.10 小鼠急性肺损伤（ALI）模型构建

小鼠给药后1 h，开始腹腔注射1.5%（60 mg/kg）的戊巴比妥钠进行麻醉。麻醉后小鼠通过牙齿固定在细线上呈吊挂垂直状态。用镊子将小鼠舌头往外轻拉，暴露气道。用静脉留置针轻轻插入气管口后缓慢滴注LPS（3 mg/kg，1 μL/g），小鼠呼吸平稳后可取下放入温暖环境中等待麻醉苏醒。

1.4.11 肺组织采集和肺湿干质量比测定

造模8 h后，将小鼠麻醉后脱臼处死，全肺取出，用PBS清洗表面的血液，右肺前叶称质量，记为湿质量（W），再放入60 ℃烘箱干燥72 h，称质量，记为干质量（D），计算肺组织湿干质量比值（W/D）。剩余右肺匀浆用于炎症因子和Western blotting的检测；左肺置于4%多聚甲醛中固定24 h以上用于切片HE染色。

1.4.12 肺泡灌洗液（BALF）的收集

造模8 h后，将小鼠麻醉后脱臼处死，固定小鼠四肢，剪开颈部皮肤，剥离组织和肌肉，分离气管。用眼科剪在气管靠近头部处开小口，将静脉留置针从开口插入气管，用细线扎紧气管与静脉留置针。然后将1 mL注射器连接于静脉留置针，缓慢推注1 mL预冷PBS，回抽PBS并将其收集，共2次，1 mL/次。

1.4.13 动物组织病理学变化检查

将固定好的肺组织放入自来水中，清洗多聚甲醛。将肺组织用擦镜纸包好，其他步骤同实验方法“1.4.8”。

1.4.14 酶联免疫吸附法（ELISA）

将收集的BALF离心（500×g，4 ℃，15 min），取上清。取新鲜小鼠肺组织充分匀浆，离心（12 000×g，4 ℃，15 min）取上清。严格根据ELISA试剂盒说明检测上清中TNF-α、IL-6的含量。

1.4.15 Western blotting

提取ALI小鼠的肺组织和RAW 264.7细胞的总蛋白和核蛋白，使用BCA试剂盒测定蛋白浓度。将蛋白定量和变性，使用10%聚丙烯酰胺凝胶对蛋白进行电泳分离。分离后的蛋白转移至PVDF膜上，使用5%的牛奶封闭1 h。孵育STAT3（Tyr 705）（1∶1000）、p-STAT3（Tyr 705）（1∶1000）和β-actin（1∶3000）一抗4 ℃过夜，TBST洗膜10 min 3次。孵育小鼠二抗（1∶3000）和兔二抗（1∶5000），4 ℃ 2 h，TBST洗膜10 min 3次，ECL化学显影和拍照。

1.4.16 镇痛作用动物实验分组与给药

将BALB/c小鼠随机分配为8组（n=16）。分别为CON组（模型组：1%冰醋酸10 mL/kg）、双氯芬酸钠组（SLFSN 0.05 g/kg）、银翘散低、中、高组（YQS YP、YQS KL：10、15、20 g/kg）。除CON组和冰醋酸模型组外，SLFSN组和各给药组：灌胃给药，1次/d，连续7 d，第7天给药1 h后将小鼠置于55 ℃热板仪上或腹腔注射冰醋酸观察小鼠舔足和扭体反应。

1.4.17 热板测试与扭体计数

将小鼠置于55±0.5 ℃热板仪中，观察并记录小鼠第一次舔后足的时间，该时间即为小鼠的痛阈值。筛选痛阈值在5~30 s内的雄性小鼠，首次给药前，在热板仪上重复测量3次痛阈值，平均值作为各组小鼠的基础痛阈值。于第7天给药后重新记录小鼠的痛阈值，并计算痛阈提高率［痛阈提高率%=（给药后痛阈值-给药前痛阈值）/给药前痛阈值×100%］。将CON组和各给药组小鼠腹腔注射冰醋酸，计算20 min内小鼠的扭体次数。

1.4.18 最小抑菌浓度实验

实验采用大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、肺炎链球菌，于37 ℃ LB肉汤培养基培养24 h。吸取少量菌液用生理盐水稀释至0.5 mol/L麦氏浊度备用。取12根洁净灭菌的2 mL的EP管，标号1~12，每管加入0.5 mL的LB肉汤。1号试管加入0.5 mL的YQS YP（2 g/mL），混合均匀，从1号管中取0.5 mL液体于2号管中，进行对倍稀释直至9号管，第10号作为模型组，11号管加入氨苄青霉素钠作为阳性药组、12号作为空白对照组（YQS KL作相同组分别进行实验）。除12号管外，每管加入10 μL稀释的菌液，置于37 ℃的恒温箱中培养24 h后观察细菌生长情况，观察有无细菌生长与液体浊度，与模型组对比液体浑浊程度，以液体浑浊度开始降低的最小稀释浓度为最小抑菌浓度，即MIC。

1.5 统计学分析

采用GraphPad Prism 8软件对本实验数据进行作图和统计学处理，数据以均数±标准差表示。数据符合方差齐性时，组间比较采用单因素方差分析，两组间比较采用Dunnett检验；若方差不齐，采用秩和检验，P<0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 银翘散配方颗粒及其汤剂对RAW 264.7细胞LPS炎症模型的抗炎药效比较

细胞毒性结果（图1A、B）显示，与CON组相比，银翘散配方颗粒及其汤剂在0~1000 μg/mL的浓度对RAW 264.7细胞在24 h内没有明显毒性（细胞存活率≥90%）。因此后续将采用200、400、800 μg/mL非毒剂量对细胞进行实验。给予不同浓度（200、400、800 μg/mL）的银翘散配方颗粒及其汤剂与LPS共培养24 h后提取细胞蛋白和mRNA，检测STAT3、p-STAT3（Tyr 705）蛋白水平和炎症因子TNF-α、IL-6、IL-1β的含量。蛋白免疫印迹结果（图1C）所示，与CON组对比，模型组细胞中核蛋白的p-STAT3表达明显增多；各给药组能降低p-STAT3蛋白的表达，且相同剂量下配方颗粒降低效果优于传统汤剂；总蛋白中的STAT3表达无明显差异。实时荧光PCR结果（图1D~F），与CON组相比，模型组细胞中TNF-α、IL-6、IL-1β的含量上升（P<0.01，P<0.001）；各个给药组均能降低炎症因子的水平，且在个别相等剂量下配方颗粒降低TNF-α、IL-6、IL-1β的效果更好（P<0.01，P<0.001）。

2.2 银翘散配方颗粒及其汤剂对斑马鱼炎症模型抗炎药效比较研究结果

斑马鱼在银翘散配方颗粒及其汤剂浓度为0~800 μg/mL下无明显毒性反应。在72 h内斑马鱼的发育过程无畸形，心包肿大的情况，且死亡率为0%（表2）。因此选择0~800 μg/mL作为非毒性给药剂量用于后续实验。

病理结果（图2）显示，CON组斑马鱼在卵黄囊注射PBS 12 h后，斑马鱼卵黄囊区域未见明显的中性粒细胞浸润与聚集。与CON组相比，模型组斑马鱼卵黄囊区域浸润的中性粒细胞显著增多；与模型组相比，地塞米松组和各给药组均能抑制中性粒细胞在卵黄囊区域的聚集。

硫酸铜炎症模型结果（图3A、B）显示，与CON组对比，模型组斑马鱼在浸泡硫酸铜溶液2 h后，向侧线神经丘细胞区域迁移的荧光中性粒细胞数量明显增多（P<0.001）；与模型组对比，地塞米松组能降低斑马鱼神经丘细胞区域的中性粒细胞数量（P<0.001），银翘散各给药组也能抑制中性粒细胞向侧线神经丘细胞区域的迁移和聚集（P<0.05，P<0.001）。

横切尾鳍炎症模型结果（图3C、D）显示，与CON组相比，模型组斑马鱼尾鳍横切4 h后，切口处的中性粒细胞数量增加（P<0.001）；与模型组相比，地塞米松组和银翘散各给药组的斑马鱼尾鳍切口处迁移的中性粒细胞明显降低（P<0.05）。显微注射LPS炎症模型结果（图3E、F）所示，与CON组相比，模型组斑马鱼在卵黄囊注射LPS 12 h后，卵黄囊注射区域聚集的中性粒细胞数量增加（P<0.001）；与模型组相比，地塞米松组和银翘散各给药组斑马鱼向卵黄囊注射区域迁移的中性粒细胞数量减少（P<0.05，P<0.01）。显微注射Poly （I∶C）病毒性炎症模型结果（图3G、H）显示，与CON组相比，模型组斑马鱼在卵黄囊注射Poly （I∶C）12 h后，卵黄囊注射区域聚集的中性粒细胞数量增加（P<0.001）；与模型组相比，地塞米松组和银翘散各给药组的斑马鱼向卵黄囊注射区域迁移的中性粒细胞数量减少（P<0.05，P<0.01）。上述4种斑马鱼炎症模型实验结果说明了银翘散配方颗粒及其传统汤剂在浓度为200、400、800 μg/mL下具有抗炎作用，且两种剂型在相同剂量下抗炎效果差异无统计学意义（P>0.05）。

2.3 银翘散配方颗粒及其汤剂对LPS所致小鼠急性肺损伤模型抗炎药效比较研究结果

病理切片结果（图4）显示，CON组肺组织结构完整清晰，肺泡壁无增厚水肿；模型组肺组织损伤充血，肺间隔可见大量炎症细胞，肺泡壁水肿增厚；地塞米松组肺组织无明显充血水肿、间隔增厚等情况；银翘散各给药组均可改善上述病理情况且在相同剂量下对肺组织的保护作用相似，组织充血、水肿减轻，炎症细胞浸润减少。

肺湿干质量比结果（图5A）显示，与CON组对比，模型组小鼠肺组织湿干质量比（W/D）增高（P<0.001）；与模型组相比，地塞米松组、银翘散各给药组均能不同程度降低W/D比值（P<0.001），且在3个相同剂量下对比无明显差异。实验结果（图5B~E）显示，与CON组相比，模型组BALF和肺组织中TNF-α与IL-6的含量升高（P<0.001）；与模型组相比，地塞米松组、银翘散配方颗粒及其汤剂高、中两个剂量均能降低小鼠BALF和组织中TNF-α和IL-6的水平（P<0.05，P<0.01，P<0.001），且相同剂量下作用无明显差异。两低剂量组均能降低IL-6的水平，但对BALF中的TNF-α水平的升高无明显抑制作用。蛋白免疫印迹结果（图5F）显示，与CON组对比，模型组细胞中的p-STAT3（Tyr 705）蛋白表达明显增多，而地塞米松组和银翘散各个给药组均可抑制p-STAT3蛋白的表达，而对STAT3无明显影响。

2.4 银翘散配方颗粒及其汤剂对小鼠两种疼痛模型的镇痛药效比较研究结果

醋酸扭体疼痛模型结果（表3）显示，与CON组（模型组）小鼠对比，双氯芬酸钠组和银翘散各给药组能降低小鼠在20 min内的扭体次数（P<0.001），说明银翘散具有镇痛作用，且相同剂量下两种剂型无明显差异。热板疼痛模型结果（表3）显示，与CON组对比，双氯芬酸钠组和银翘散高、中两种剂量组能延长小鼠出现舔后足的时间，提高其痛阈百分率（P<0.001），两种剂型在药效上无明显差异，且银翘散低剂量无明显镇痛作用。

2.5 银翘散配方颗粒及其汤剂抗菌药效比较研究结果

实验结果（表4）显示，银翘散对大肠杆菌、金黄色葡萄链球菌、肺炎链球菌等3种细菌均具有抑制作用。与CON组相比，模型组含菌肉汤液体浑浊可见白色菌落；与模型组相比，氨苄青霉素钠组肉汤液体澄清透亮，银翘散两种剂型浓度为15.63 mg/mL时，含金黄色葡萄链球菌的肉汤浊度开始降低，对金黄色葡萄链球菌的增殖起到抑制作用，即为最小抑菌浓度（MIC）；浓度为31.25 mg/mL时，含大肠杆菌和肺炎链球菌的肉汤浊度开始降低，对大肠杆菌和肺炎链球菌的增殖起到抑制作用，且相同剂量下抗菌效果无明显差异。

3 讨论

自新型冠状病毒（COVID-19）疫情全球性爆发以来，针对病毒感染及其并发症的治疗策略迅速成为医学研究的重点。在此背景下，具有清热解毒功效的药物类别需求激增。其中，包含连翘、金银花等关键成分的银翘散作为传统中药方剂，其药材饮片的需求量大幅度增长。尽管中药配方颗粒在临床上的接受度和使用频率不断提高，关于其与传统中药汤剂在药效、生物利用度及安全性等方面的等效性问题，仍存在着一定不确定性。例如，刘月圆等^［19］采用黄连解毒汤传统饮片汤剂与配方颗粒治疗慢性胃炎患者发现传统饮片长期药效优于中药配方颗粒。全智慧等^［20］通过小鼠耳肿胀实验发现制川乌配方颗粒等剂量效应较制川乌标准煎剂大。谭婉清等^［21］通过小鼠氨水喷雾引咳试验和酚红排泌祛痰试验发现化橘红配方颗粒和其饮片汤剂的止咳化痰效果相当。因此，对银翘散中药配方颗粒与传统汤剂两种剂型进行系统的药效学研究，不仅对于指导临床合理用药、优化治疗方案具有至关重要的临床意义，而且对于推动中药现代化、提升中药制剂的科学性和标准化水平，亦具有深远的应用价值和学术意义。

本文针对银翘散抗炎、抗菌、镇痛的药理作用等效性进行了探讨，炎症方面采用了斑马鱼的4种炎症模型，包括化学诱导（硫酸铜模型）、物理损伤（尾鳍横切模型）、细菌感染（显微注射LPS模型）^［22］以及病毒感染（显微注射Poly （I∶C）模型）^［23］模型，同时还利用细胞和小鼠模型模拟了由细菌感染引发的炎症过程，多方面评价了药物对不同诱因引起炎症的保护作用。抗炎的结果也表明了银翘散配方颗粒及其汤剂均能在细胞、动物水平发挥抗炎作用，并且对多种诱因导致的炎症均有抑制作用。该作用与抑制促炎因子生成和下调p-STAT3（Tyr 705）蛋白表达密切相关。STAT3是关键的转录因子，它能激活炎症细胞因子如IL-6、TNF-α和IL-1β，加剧炎症反应^［24］。STAT3异常激活与慢阻肺^［25］、炎性肠炎^［26］等慢性炎症疾病紧密相关，通过促进炎症因子产生、调节免疫细胞等机制加剧病情。因此直接抑制STAT3磷酸化、阻断其核转位^［27］等策略，可减少炎症细胞因子产生，降低炎症反应。所以本实验通过检测磷酸化STAT3蛋白的表达初步探讨银翘散的抗炎机制。但需要指出的是，配方颗粒在细胞水平上抑制TNF-α、IL-6、IL-1β的mRNA表达要优于传统汤剂。何再安等^［28］对银翘散配方颗粒与传统汤剂的化学成分研究结果显示提取物的色谱图形及对应色谱峰保留时间基本一致，表明两者化学成分无显著差异，且都含有黄酮类、木脂素类、有机酸类、萜类以及多糖类等主要成分。而束雅春等^［29］发现，银翘散水煎液在不同煎煮时间下，其挥发性成分含量会发生变化。这主要是由于薄荷、荆芥穗和连翘等药材中的挥发性成分对热不稳定，在煎煮过程中减少。由于中药配方颗粒的挥发性成分是在制粒后人工添加^{［30， 31］}，不会发生经煎煮减少这个现象，因此我们推测配方颗粒挥发油含量较高可能是导致其对TNF-α、IL-6、IL-1β抑制作用强的原因之一。但是具体机制还有待进一步研究。此外，我们的研究也发现，银翘散配方颗粒和传统汤剂均具有抗菌、镇痛的作用，且二者的药效无明显差异。

综上所述，本研究证实了银翘散配方颗粒和传统汤剂在抗炎、抗菌、镇痛作用上具有一致性，为中药配方颗粒的研究与应用提供科学的依据与参考，具有较大的临床应用价值。

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