WW结构域E3泛素连接酶1调控卵巢癌肿瘤微环境中的免疫浸润

WW domain-containing ubiquitin E3 ligase 1 regulates immune infiltration in tumor microenvironment of ovarian cancer

摘要

目的 探讨WW结构域E3泛素连接酶1（WWP1）表达与卵巢癌肿瘤微环境（TME）免疫浸润调控的关系。 方法 从TCGA获取卵巢癌患者数据，以中位值为截断值分为WWP1高表达和低表达组。生物信息学方法分析WWP1表达与卵巢癌预后关系；TISCH2比较WWP1在卵巢癌转移和化疗后TME不同免疫细胞亚型的差异；TIMER分析WWP1表达对TME免疫细胞浸润和体细胞拷贝数变异的影响；TIGER分析WWP1表达与卵巢癌不同免疫细胞亚型演化的关系；深度学习模型分析TCGA病理染色图像，确定WWP1对卵巢癌患者TME的影响；WWP1高表达前后的SKOV3细胞进行转录组测序，比较差异基因并进行免疫浸润验证分析；在SKOV3和SKOV3/DDP裸鼠肿瘤组织中采用多色免疫荧光比较分析免疫标志物差异。 结果 WWP1高表达卵巢癌患者的整体生存率低于WWP1低表达患者（P=0.0012）。高表达WWP1、Stage IV 等与卵巢癌不良预后相关（P<0.05）。卵巢癌转移或化疗后，TME中恶性肿瘤细胞、肿瘤相关成纤维细胞比例明显升高，WWP1表达比例亦明显增高（P<0.05）。WWP1表达与TME中促肿瘤免疫抑制性细胞正相关（r=0.1323~0.3955，P<0.05），与抑制肿瘤的免疫浸润细胞负相关（r=-0.1949~-0.1333，P<0.05）。CD8⁺T细胞浸润水平与WWP1的深度缺失和染色体水平缺失有关，中性粒细胞浸润水平与WWP1高度扩增有关（P<0.05）。随着WWP1 表达升高，TME中CD8⁺、NK T细胞比例逐渐减少，髓样细胞和B细胞逐渐演化为不同细胞亚型。TCGA患者病理标本HE染色、高表达WWP1的SKOV3细胞转录组测序和裸鼠肿瘤组织多色免疫荧光分析确认了与生信分析相似的TME免疫细胞浸润结果。 结论 WWP1可能是卵巢癌的一个预后预测因子和潜在的TME免疫调控靶点。

Abstract

Objective To explore the association of the expression of WW domain-containing ubiquitin E3 ligase 1 (WWP1) with immune infiltration in tumor microenvironment (TME) of ovarian cancer. Methods Ovarian cancer patient data from The Cancer Genome Atlas (TCGA) were used to analyze the association of WWP1 expression with patient prognosis. TISCH2 was utilized to analyze the changes in immune cell subtypes in TME of metastatic tumor and after chemotherapy. The impact of WWP1 on immune cell infiltration, somatic copy number alterations of WWP1 and evolution of immune cell subtypes was evaluated using TIMER and TIGER pseudo-time analysis. A deep learning model was used to analyze TCGA pathological images to investigate the effect of WWP1 on TME of ovarian cancer. RNA-seq analysis was conducted to identify the differentially expressed genes in WWP1-overexpressing SKOV3 cells and validate immune infiltration. Multicolor immunofluorescence assay was used to analyze the immune markers in SKOV3 and SKOV3/DDP cell xenografts in nude mice. Results The patients with high WWP1 expression levels had significantly lower overall survival rate (P=0.0012). High WWP1 expression levels and Stage IV disease were both associated with a poor prognosis (P<0.05). In metastatic ovarian cancer or after chemotherapy, the percentages of malignant tumor cells and tumor-associated fibroblasts increased in the TME, accompanied by elevated WWP1 levels. WWP1 expression level was positively correlated with pro-tumorigenic immunosuppressive cells (r=0.1323-0.3955, P<0.05) and negatively with tumor-inhibiting immune cells (r=-0.1949- -0.1333, P<0.05). Specific copy number alterations of WWP1 also influenced CD8⁺ T cell percentage and neutrophil infiltration levels in the TME. RNA-seq analysis of WWP1-overexpressing SKOV3 cells and immunofluorescence assay of the tumor-bearing mice yielded findings consistent with those of bioinformatics analysis. Conclusion WWP1 may serve as a prognostic biomarker and a potential target for immune regulation in the TME of ovarian cancer.

Graphical abstract

关键词

卵巢癌 / WW结构域E3泛素连接酶1 / 免疫浸润 / 肿瘤微环境

Key words

ovarian cancer / WW domain-containing ubiquitin E3 ligase 1 / immune infiltration / tumor microenvironment

卵巢癌（OC）是妇科肿瘤中死亡率最高的恶性肿瘤，其中90%为上皮性高级别浆液性癌。基因组研究和临床数据分析证实，卵巢癌具有较高的晚期（III和IV期）疾病发病率，且多存在局部或远处转移，5年生存率约为40%左右^{［1， 2］}。卵巢癌的治疗面临着诸多挑战，铂类方案为主的化疗仍是晚期或手术风险高的卵巢癌患者的标准治疗方案^［3］。近年的研究发现，铂类化疗可通过抑制凋亡相关通路、加工和交叉呈递肿瘤抗原等方式诱导卵巢癌耐药和免疫逃逸，导致患者化疗失败^［4］。因此，探究卵巢癌化疗耐药和免疫逃逸相关机制，并探寻相关的潜在治疗靶点是当前亟待解决的重要研究课题。

TME是支撑肿瘤生长、侵袭和转移的复杂动态环境，其中存在肿瘤相关成纤维细胞（CAF）、肿瘤相关巨噬细胞（TAM）和调节性T细胞（Treg）等免疫抑制性细胞^［5］。这些免疫抑制性细胞会显著抑制细胞毒性淋巴细胞的浸润和功能，导致肿瘤继续生长，是化疗耐药和免疫逃逸的重要机制之一^［6］。针对TME的抗肿瘤策略通过改变或利用这个微环境来抑制肿瘤生长、促进免疫系统对抗肿瘤细胞以及提高传统治疗方法的疗效。例如，免疫检查点抑制剂、调控TME中的免疫细胞和/或细胞因子等^［7］。然而，针对TME的治疗也面临一系列挑战，包括如何找到最有效的靶点、如何开发选择性调控TME且没有明显副作用的药物等。

近年的研究发现，WWP1在包括心血管系统疾病、新冠肺炎和肿瘤等疾病中均具有重要作用^［8-10］。WWP1敲除的小鼠中，重力诱导的心脏重塑可以明显缓解^［8］。WWP1通过与新冠病毒的刺突蛋白结合并促进其泛素化降解而发挥抗新冠病毒作用，是一个潜在的新冠肺炎治疗靶点^［9］。在乳腺癌裸鼠模型中，抑制WWP1可以增强PI3K抑制剂的抗肿瘤活性^［10］。此外，WWP1介导的PTEN多聚泛素化在促进乳腺癌骨转移过程中发挥了重要作用^［11］。目前，关于WWP1在卵巢癌疾病进展中的作用尚不清楚。有研究发现，WWP1可以通过调节免疫细胞的功能，使肿瘤细胞逃避免疫系统的清除^［12］。WWP1通过直接或间接调节免疫相关基因的表达，如细胞程序性死亡受体-配体1（PD-L1）、白介素-6（IL-6）等，影响肿瘤细胞与免疫细胞的相互作用，促进免疫耐受的形成^{［13， 14］}。因此，WWP1是肿瘤中一个重要的免疫调节因子，可能成为肿瘤免疫治疗的新的靶点。

为深入探究WWP1在卵巢癌中的潜在预后价值及其对TME免疫调控的影响，本研究采用生物信息学方法，从多种卵巢癌公共数据库中筛选出与WWP1表达相关的免疫基因，分析其在卵巢癌中的功能和意义。同时，我们利用转录组测序的技术，在WWP1高表达卵巢癌细胞系中验证生物信息学分析结果，揭示WWP1对卵巢癌TME的影响。本研究旨在为卵巢癌的免疫治疗提供新的思路和依据。

1 材料和方法

1.1 实验材料、试剂

293T细胞、SKOV3细胞、顺铂耐药SKOV3/DDP细胞、优级胎牛血清、RPMI 1640培养基（浙江美森细胞科技有限公司）；BALB/cA-nu雌性裸鼠（河南斯克贝斯生物科技有限公司，许可证号SCXK2020-0005）。WWP1高表达质粒（和元生物技术（上海）股份有限公司）；VAHTS Universal V6 RNA-seq Library Kit for MGI（南京诺唯赞生物科技股份有限公司）；酪胺信号放大（TSA）荧光染料、DAPI染色试剂、组织自发荧光淬灭剂、FAP、CD8、CD4、CCR8兔抗和HRP标记羊抗兔或羊抗鼠二抗（武汉赛维尔生物科技有限公司），WWP1鼠抗（武汉三鹰生物技术有限公司）。

1.2 患者数据获取

从基因组数据公共数据（TCGA）门户网站（https：//portal.gdc.cancer.gov）下载卵巢癌基因组图谱RNA-seq数据集和临床数据（2023.8.30版本），删除WWP1表达数据或临床分期信息缺失患者。所有表达值以每百万转录本数（TPM）进行标准化处理，WWP1表达数据以中位值为截断值分为高表达和低表达组，比较WWP1表达与卵巢癌进展、主要治疗结局、年龄等的相关性。

1.3 患者生存率比较

采用Shiny在线工具（https：//shiny.hiplot.cn/ucsc-xena-shiny/）将上述RNA-seq标准化数据，以生存时间为横坐标，进行Kaplan-Meier （KM） Plotter生存期分析，计算log-rank P值。

1.4 Cox回归分析

在Rstudio软件（RStudio 2023.09.0+463版）中加载上述标准化数据，利用survival（3.3.1版）包的coxph函数建立COX比例风险回归模型，分析WWP1表达与卵巢癌的预后关系，进行Logrank test统计检验获得预后显著性。

1.5 单细胞测序数据验证WWP1在肿瘤化疗和转移中的变化

采用肿瘤免疫单细胞数据库（TISCH2）在线工具（http：//tisch.comp-genomics.org）评估WWP1在肿瘤化疗和转移过程中的改变^［15］。选择卵巢癌单细胞测序数据OV_GSE115007（原发肿瘤，未化疗，PMID：29967419）、OV_GSE130000（原发肿瘤，未化疗转移，PMID：34992217）、OV_GSE158722（原发肿瘤，化疗，PMID：34031395），以WWP1为分层基因，比较卵巢癌转移和化疗后WWP1表达和不同细胞亚型的变化。

1.6 免疫浸润分析

在TIMER 2.0网站（http：//timer.cistrome.org）的免疫分析模块中，选择TCGA卵巢癌和WWP1分层基因，筛选B细胞、CD4⁺ T细胞、CD8⁺ T细胞、中性粒细胞、TAM、树突状细胞等不同的免疫细胞亚群，获取WWP1基因表达与卵巢癌免疫细胞亚群的相关性数据，在线评估卵巢癌中WWP1表达与肿瘤免疫细胞亚群的相关性。

1.7 体细胞拷贝数变异分析

Timer 2.0网站的体细胞拷贝数变异（sCNA）模块预先定义了深度缺失、染色体水平缺失、二倍体、染色体水平扩增和高度扩增4种类型。设定肿瘤类型为TCGA卵巢癌和WWP1分层基因，分析卵巢癌中WWP1表达的sCNA状态与B细胞、CD8⁺ T细胞、CD4⁺ T细胞等免疫浸润的关系。

1.8 拟时序分析

采用肿瘤免疫治疗基因表达数据库（TIGER）在线工具^［16］拟时序分析模块，选择文献发表的卵巢癌单细胞测序数据^［17］，分析WWP1在不同免疫浸润细胞演化中的变化。

1.9 临床病理标本HE染色验证

从TCGA网站下载WWP1高表达和低表达的病理标本HE染色图像，采用基于深度学习的HD Staining软件分析^［18］，比较WWP1对肿瘤组织免疫浸润的影响。

1.10 转录组测序验证

用WWP1高表达质粒转染至293T细胞产生的慢病毒感染SKOV3细胞，用puromycin筛选，构建WWP1高表达的SKOV3-highWWP1细胞株。SKOV3作为对照组，SKOV3-highWWP1作为处理组。提取总RNA，VAHTS Universal V6 RNA-seq Library Kit for MGI纯化mRNA并构建文库。使用 Qubit 2.0 荧光计（美国赛默飞生命科学有限公司）和安捷伦 2100 系统（美国安捷伦公司）评估文库的质量和大小。建库样品在武汉菲沙基因生物信息技术有限公司 MGI-SEQ 2000 平台进行测序。采用SOAPnuke（2.1.0版）对测序数据进行过滤获得 clean reads，使用HISAT2（2.1.0版）将 clean reads 与参考基因组进行比对，利用bowtie2（2.3.5版）将质控后序列比对到参考转录本序列。将数据进行TPM标准化处理，采用edgeR（4.0.15版）进行差异分析，immunedeconv（2.1.3版）进行免疫微环境和免疫浸润分析，clusterProfiler（4.10.0版）进行GSEA富集分析^［19］。

1.11 免疫荧光验证

课题组前期实验证实SKOV3/DDP细胞中WWP1表达相比SKOV3细胞增高^［20］，参考文献中FAP作为CAF标志物^［21］和CCR8作为Treg标志物^［22］，本研究在裸鼠肿瘤模型中对CD4、CD8、Treg和CAF的表达与WWP1的关系进行验证。经南阳理工学院伦理委员会审查批准后（伦理批号：南理工动伦审2023-004），将4~5周龄BALB/cA-nu雌性裸鼠随机分为2组，每组5只，分别于背部皮下接种浓度为5×10⁶/mL对数生长期的SKOV3和SKOV3/DDP细胞，300 μL/只。15 d后，待肿瘤体积至约100 m³后剥取肿瘤组织，石蜡包埋切片后脱水。抗原修复后将CD4、CD8、CCR8、WWP1和FAP一抗中的一种（稀释比例分别为1∶1000、1∶1000、1∶5000、1∶500和1∶2000）分别4°C孵育过夜，对应的二抗（稀释比例为1∶500）避光室温孵育50 min，TSA荧光染料避光室温孵育10 min，一种蛋白完成一抗、二抗孵育和TSA染色后再孵育另一种抗体，依次进行孵育和染色。DAPI复染细胞核，加自发荧光淬灭剂5 min，抗荧光淬灭封片剂封片。Pannoramic 250FLASH（3DHISTEC）采集图像，CaseViewer软件（版本号2.4）分析图像。

1.12 统计学分析

Wilcoxon秩和检验用于表达差异的统计分析，单因素和多因素Cox回归分析用于预后基因评估，统计分析基于logrank 检验，Spearman法用于相关性分析。以P<0.05表示差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 WWP1高表达是卵巢癌的预后指标

获取有WWP1表达的TCGA卵巢癌病例376例，去除重复和临床分期缺失数据后，剩余372例。经统计分析，卵巢癌分期和主要治疗结局的WWP1高表达与低表达组之间差异有统计学意义（P<0.05，表1）。WWP1高表达患者整体生存率低于WWP1低表达患者（P=0.0012，图1）。

2.2 Cox回归分析结果

Cox单因素回归分析显示，高表达WWP1、带瘤状态、肿瘤残留、年龄均与卵巢癌不良预后相关（P<0.05）。Cox多因素回归分析显示，高表达WWP1 和带瘤状态是一个独立风险因素（P<0.05，表2）。

2.3 单细胞测序数据证实WWP1在卵巢癌化疗和转移中具有重要作用

卵巢癌单细胞测序数据分析后发现，卵巢癌转移（OV_GSE130000）或化疗（OV_GSE158722）后，与原发肿瘤（OV_GSE115007）相比，恶性肿瘤细胞、肿瘤相关成纤维细胞比例明显升高，单核/巨噬细胞比例明显下降，WWP1表达比例明显增高（图2）。

2.4 卵巢癌WWP1表达与免疫浸润相关性

卵巢癌组织WWP1表达与免疫浸润的Treg细胞、组织驻留NK细胞、M2型TAM、单核细胞、内皮细胞、组织驻留CD4细胞、初始B细胞、活化的髓样树突细胞、CAF细胞等促肿瘤免疫抑制性细胞显著正相关（r=0.1323~0.3955，P<0.05），与活化的NK细胞、CD8⁺细胞、Th1细胞、记忆性B细胞、组织驻留髓样树突细胞负相关（r=-0.1949~-0.1333，P<0.05，图3）。

2.5 WWP1对卵巢癌免疫浸润细胞拷贝数变异影响

SCNA分析显示，B细胞浸润水平与WWP1在染色体水平的缺失有关 （P<0.05），CD8⁺ T细胞浸润水平与WWP1的深度缺失和染色体水平缺失有关（P<0.01），中性粒细胞浸润水平与WWP1高度扩增有关（P<0.05，图4）。

2.6 WWP1表达对免疫浸润细胞动态变化的影响

卵巢癌单细胞测序数据的拟时序分析发现，恶性肿瘤细胞、内皮细胞、CD4⁺ T细胞比例随着WWP1表达增加而增多（图5A~D）。CD8⁺ T细胞和NK 细胞比例逐渐减少，其与WWP1表达呈反向变化趋势（图5D）。随着髓样细胞和B细胞演化为不同细胞亚型，WWP1表达呈下降趋势（图5E~H）。

2.7 WWP1表达对卵巢癌病理标本免疫浸润的影响

HD-Staining分析发现，与WWP1低表达的TCGA病理标本相比，WWP1高表达的病理标本肿瘤细胞、淋巴细胞和巨噬细胞比例均明显增多（图6）。

2.8 RNA-seq数据验证

RNA-seq数据的免疫微环境比较结果显示，SKOV3细胞WWP1表达增高后，免疫微环境和免疫评分均增加（图7A）。免疫浸润结果显示，SKOV3细胞WWP1表达增高后B细胞、NK细胞、髓样树突状细胞比例下降，M2型TAM、单核细胞、中性粒细胞、CD4⁺ T细胞和Treg细胞比例均增加（图7B）。SKOV3细胞WWP1表达增高后，RSC1A1、UTP14C、PANXA2、ZACN、GCKR等基因随之表达上调，SHC2、UFM1P1、INHBE、ABCG1、KLHDC7B、CCER1等基因表达下调（图7C）。进一步对差异基因进行GSEA通路分析后发现，高表达WWP1涉及的免疫浸润相关通路包括GSE3982 MEMORY CD4 TCELL VSTH2 DN、GSE3982 MEMORY CD4 TCELL VS TH1 DN、GSE11386 NAIVE VS MEMORY BCELL UP、GSE3982 CENT MEMORY CD4 TCELL VS TH1 DN、GSE3982 EFF MEMORY CD4 TCELL VS TH2 DN等（图7D）。

2.9 免疫荧光验证

裸鼠肿瘤组织的多色免疫荧光检测发现，与SKOV3裸鼠肿瘤组织相比，SKOV3/DDP裸鼠肿瘤组织随着WWP1表达增高，CD4、CAF标志物FAP、Treg标志物CCR8荧光强度增强，CD8荧光强度减弱（图8）。

3 讨论

越来越多的证据表明，化疗在杀灭肿瘤细胞的同时，可能通过改变TME而促了进肿瘤耐药、转移和进展，降低了患者的生存率。TME不仅通过与肿瘤细胞相互作用而促进肿瘤的生长、播散和转移，还会影响常规放疗、化疗和免疫治疗等疗法的效果^{［23， 24］}。一项连续20年的乳腺癌回顾性队列研究发现，初治时出现转移的患者生存率比化疗后转移患者的生存率高两倍^［25］。另有研究发现，新辅助化疗通过转移相关TME介导的机制诱导了乳腺癌的转移，而TME抑制剂可以增强化疗效果^［26］。本研究通过对患者基本资料分析和Cox回归分析发现，卵巢癌组织WWP1高表达患者具有更低的生存率，卵巢癌疾病进展与WWP1具有相关性，高表达WWP1是一个卵巢癌独立风险因素。此外，初始治疗结局在卵巢癌组织WWP1高表达和低表达患者之间，以及疾病进展（PD）与完全缓解（CR）、部分缓解（PR）之间的差异可能在一定程度上与化疗相关。本研究继续对卵巢癌原发肿瘤未化疗、原发肿瘤未化疗转移和原发肿瘤化疗后的单细胞测序数据以WWP1为分层基因进行分析，发现恶性肿瘤细胞、肿瘤相关成纤维细胞、WWP1表达比例均随着转移和化疗而升高，这些结果进一步提示化疗对卵巢癌患者的不良影响，WWP1可能在卵巢癌TME中具有重要作用。

TME中的不同免疫浸润细胞根据功能分为抑制或促进肿瘤免疫逃逸/进展两种类型。这些细胞在肿瘤进展过程中会改变数量和/或功能，帮助肿瘤逃避免疫系统的攻击。Treg、M2型TAM、初始B细胞、内皮细胞、中性粒细胞等通常促进肿瘤生长或免疫逃逸。CD8+ T细胞、NK细胞、记忆性B细胞、DC细胞等具有抑制肿瘤免疫逃逸作用。最新的研究发现，TME通过诱导组蛋白去甲基化酶（JMJD1C）表达，促进PD-1表达，减少干扰素γ（IFN-γ）的产生，增加Treg细胞的数量^［27］。TME通过诱导B细胞增殖，上调肿瘤中的糖基化膜蛋白A4（HSPA4），激活ITGB5/Src/NF-κB 通路，促进恶性肿瘤生长，扮演促炎和免疫抑制等多种角色^［28］。研究显示，端粒长度缩短与T细胞免疫缺陷所致的肿瘤发生，以及初始B细胞比例增加和记忆性B细胞比例下降有关^［29］，提示初始B细胞与记忆性B细胞在促肿瘤和抗肿瘤免疫逃逸中具有不同作用。此外，肿瘤相关的记忆B细胞在抗肿瘤免疫反应和肿瘤患者生存中具有重要作用^［30］。TME中内皮细胞多与肿瘤血管生成、免疫抑制以及抗血管生成疗法的耐药有关^［31］。中性粒细胞进入肿瘤内部后，通过表观遗传重编程以及转录组、蛋白组学修饰，同样具有促进血管生成的作用，促进肿瘤生长^［32］。研究发现，IGFBP2-STAT3-PD-L1信号通路活化促进TME中M2型TAM聚集，直接抑制CD8⁺ T细胞功能，在肿瘤免疫抑制中发挥关键作用^［33］。Smad3信号通路激活促进TME中TAM向成CAF转化，增强肿瘤免疫抑制作用^［34］。

CD4⁺ T细胞在TME中通过影响其他免疫细胞的功能起着双重作用。Th1型CD4⁺ T细胞帮助CD8+细胞通过产生IFN-γ和TNF-a，协同才能产生较为强大的抗肿瘤作用，Th2亚型则分泌具有促肿瘤功能的抗炎介质^［35］。NK细胞不需激活即具有杀伤肿瘤细胞作用，但其被招募进入肿瘤后，因趋化因子和细胞因子（如IFN-γ）生成快速减少致使功能受损，同时失去招募DC细胞的能力，从而失去抗肿瘤作用^［36］。TME中的DC细胞通过吸引和刺激CD8⁺ T细胞，促使其扩增而增强抗肿瘤免疫作用^［37］。因此，TME中NK细胞功能受损直接影响DC和CD8⁺T细胞数量和功能，使这些细胞的抗肿瘤作用减弱或消失。

目前尚无WWP1直接调控TME免疫细胞浸润的报道，但抑制WWP1可以上调与免疫调控相关的磷酸酶和张力蛋白类似物（PTEN），后者与多种肿瘤TME浸润的免疫细胞数量或功能改变相关。研究发现，弥漫大B细胞淋巴瘤PTEN低表达与CD8⁺ T细胞耗竭相关^［38］，非小细胞癌患者PTEN缺失导致CD4⁺ T细胞向Treg细胞分化增加，进而抑制CD8⁺ T细胞功能^［39］。P53突变导致的肝癌进展中，肿瘤干细胞会上调表达IL-34，驱动巨噬细胞脂肪酸代谢的CD36表达，引发巨噬细胞脂肪酸代谢重编程并促进M2型巨噬细胞极化，抑制CD8⁺T细胞免疫功能，导致肿瘤免疫逃逸^［40］。WWP1是P53稳定的重要因子，二者通过形成复合物从细胞核转位至细胞质并进一步聚集^［41］。此外，WWP1通过与急性白血病的预后预测因子1（OPAL1）互作抑制趋化因子受体（CXCR4），进而减少B细胞和增加DC细胞数量^［42］。CXCR4同时参与了对肿瘤CAF细胞、NK细胞和单核细胞等的调控^{［43， 44］}。因此，WWP1可能通过多种途径促进了肿瘤免疫逃逸。本研究以WWP1为分层基因对TCGA卵巢癌RNA-seq数据的免疫浸润分析发现，促进肿瘤生长和免疫逃逸的Treg细胞、M2型TAM、初始B细胞、CD4+ T细胞、内皮细胞、中性粒细胞等与WWP1表达正相关，抑制肿瘤免疫逃逸的Th1细胞、CD8⁺ T细胞、NK细胞、DC细胞、记忆性B细胞与WWP1负相关。sCNA分析结果中，CD8⁺ T细胞浸润水平与WWP1表达缺失有关，中性粒细胞浸润水平与WWP1高度扩增有关，与免疫浸润分析结果一致；而B细胞浸润水平与WWP1在染色体水平的缺失有关，与免疫浸润结果不一致，这可能与sCNA分析未区分初始B细胞和记忆性B细胞有关。卵巢癌单细胞测序数据^［17］的拟时序分析再次印证了WWP1表达与CD4⁺ T细胞分化增加，CD8⁺ T细胞和NK细胞分化减少，以及髓样细胞和B细胞的亚型分化相关。BALB/c裸鼠由于缺乏T细胞介导的免疫排斥，可高效移植人类肿瘤细胞或患者来源的组织，广泛用于肿瘤生长、转移、药物筛选等研究，近年来逐渐用于肿瘤微环境中先天免疫细胞的作用机制研究^{［45， 46］}。与高程度免疫缺陷的NOD-SCID或NSG小鼠（缺乏T、B、NK细胞）相比，在肿瘤微环境研究中可能更具优势。TCGA卵巢癌病理图像、WWP1高表达的SKOV3细胞RNA-seq测序数据的免疫浸润分析和BALB/c裸鼠肿瘤组织的多色免疫荧光分析同样再次观察到了与上述细胞相似的变化趋势。因此，WWP1可能对TME的免疫浸润细胞有间接调控作用。

综上所述，WWP1高表达与卵巢癌不良预后，以及抗肿瘤免疫浸润细胞减少和促肿瘤免疫浸润细胞增加正相关。WWP1可能是卵巢癌的一个预后预测因子和潜在的免疫治疗靶点。然而，仍需更多研究进一步验证WWP1的临床应用价值。

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