调周滋阴方治疗早发性卵巢功能不全的疗效、安全性及作用机制

Tiaozhou Ziyin recipe for treatment of premature ovarian insufficiency: efficacy, safety and mechanism

摘要

目的 基于网络药理学探讨调周滋阴方治疗早发性卵巢功能不全（POI）的作用机制，通过动物实验进行验证，并设计临床对照试验验证调周滋阴方对该病的临床疗效。 方法 利用TCMSP、PubChem、Swiss Target Prediction、Genecards、OMIM等数据库筛选相应靶点，获取核心PPI，进行GO、KEGG富集分析，构建“疾病-通路-靶点-成分-药物”网络，采用AutoDock对核心活性成分和核心靶点进行分子对接验证。通过动物实验，采用Western blotting进一步验证网络药理学结果。设计临床对照试验，对照组予芬吗通治疗，试验组在此基础上加用调周滋阴方，通过观察两组内分泌指标（FSH、LH、E₂、AMH）、窦卵泡数、Kupperman评分、不良反应发生率及妊娠率，验证调周滋阴方治疗该病的临床有效性。 结果 通过网络药理学方法，得到调周滋阴方治疗早发性卵巢功能不全的潜在靶点有163个；核心活性成分主要为山奈酚、β-谷甾醇、木犀草素、槲皮素，核心靶点主要为SRC、TP53、STAT3、PIK3CA、MAPK3等；GO功能富集主要包括细胞运动的正调控、蛋白质磷酸化等；KEGG富集通路主要包括癌症通路、PI3K-Akt信号通路等；分子对接结果显示核心活性成分与核心靶点间均有良好的结合能力。利用动物实验对关键通路进行验证，结果显示，与POI模型组大鼠比较，调周滋阴方可升高POI大鼠卵巢组织中p-PI3K和p-Akt蛋白表达（P<0.05），验证了网络药理学的部分预测结果。临床试验显示，两组E₂较治疗前升高，FSH、LH较治疗前降低，Kupperman评分较治疗前降低（P<0.05），且试验组优于对照组（P<0.05）；两组窦卵泡数较治疗前均升高（P<0.05），试验组AMH较治疗前升高（P<0.05），试验组与对照组间的差异无统计学意义（P>0.05）；治疗结束4周后，试验组治疗效果优于同期对照组（P<0.05）。 结论 调周滋阴方具有多成分、多靶点、多途径的治疗特点，其中激活PI3K/Akt通路是其作用机制之一，从而改善POI患者卵巢储备功能，缓解临床症状，提高临床疗效，具有良好的临床应用前景。

Abstract

Objective To assess the efficacy and safety of Tiaozhou Ziyin (TZZY) recipe for treatment of premature ovarian insufficiency (POI) and explore the possible mechanisms. Methods We used bioinformatics analyses and network pharmacology to identify the main active ingredients in TZZY recipe and their core targets, which were verified by Western blotting. We tested the efficacy and safety of the recipe in 60 POI patients, who were randomized into control group (n=30) with Femoston treatment and TZZY group (n=30) with additional TZZY recipe treatment for 3 menstrual cycles. Results The core active ingredients of TZZY recipe included kaempferol, β-sitosterol, luteolin, and quercetin. The core targets included SRC, TP53, STAT3, PIK3CA, and MAPK3, which were involved in positive regulation of cell movement and protein phosphorylation, the cancer pathways and the PI3K-Akt signaling pathway. Molecular docking showed that the core active ingredients had good binding ability with the core targets. In female rat models of POI, TZZY recipe treatment significantly up-regulated ovarian expressions of p-PI3K and p-Akt proteins. In the clinical trial, treatment with Femoston and Femoston plus TZZY recipe both significantly increased E₂ levels and reduced FSH and LH levels and Kupperman scores of the patients, and the combined treatment produced significantly stronger effects. Both treatments increased the number of antral follicles of the patients, but the combined treatment also significantly increased the levels of AMH. Conclusion The therapeutic mechanism of TZZY recipe for POI involves multiple active ingredients, multiple therapeutic targets and multiple pathways, and activating the PI3K /Akt pathway is one of its main mechanisms of action, to improve ovarian reserve function, alleviate clinical symptoms, and enhance clinical efficacy in POI patients.

Graphical abstract

关键词

早发性卵巢功能不全 / 调周滋阴方 / 网络药理学 / 实验验证 / 临床观察

Key words

Premature ovarian insufficiency / Tiaozhou Ziyin recipe / Network pharmacology / Experimental verification / clinical observation

早发性卵巢功能不全（POI）是指女性未满40岁出现卵巢功能衰退，以月经异常、卵泡刺激素（FSH）明显升高、雌激素水平（E₂）波动性下降为主要临床表现^［1］。POI多以月经异常为先兆，同时可伴有生育力下降以及潮热汗出、烦躁失眠、阴道干涩、性欲低下等绝经过渡期症状，且并发心血管疾病、骨质疏松症的风险增高，严重影响了女性的身心健康^［2］。近年来，POI发病率呈年轻化及上升趋势。目前，POI病因及发病机制仍未完全明确，缺乏有效的根治手段和预防措施，西医治疗POI多采用激素替代疗法以改善患者症状、提高生活质量，但疗效欠佳且风险并存。因此，寻求有效且较为安全的治疗方案成为临床研究的重点。

基于国医大师夏桂成教授调整月经周期节律法，谈勇教授提出“滋阴补阳方序贯法”，且前期研究证明滋阴补阳方序贯法可能通过调节细胞增殖以及甾体激素合成代谢过程等一系列环节部分解除生殖节律紊乱，从而优化女性生殖内分泌环境，改善卵巢功能，具有调经助孕的功效^［3-6］。结合现代社会发展需求，谈勇教授^［6］进一步提炼滋阴补阳方序贯法，形成调周滋阴方，该方由滋阴补阳方序贯法中的滋阴方精简而来，具有滋补肝肾、滋阴养血、调周助孕的功效，临床疗效确切，然其治疗机制尚未完全阐明，值得深入探究。本研究旨在通过网络药理学系统性探讨调周滋阴方治疗POI的潜在作用机制，并通过动物实验进一步验证调周滋阴方治疗POI的信号通路，通过临床对照试验验证其临床疗效，以期为后续的临床应用提供理论依据。

1 资料和方法

1.1 网络药理学及分子对接研究

1.1.1 调周滋阴方活性成分的收集与筛选

使用TCMSP数据库（http：//lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php）且以药物口服生物利用度（OB）≥30%、药物相似性（DL）≥0.18为筛选条件，收集调周滋阴方（熟地黄、白芍、山茱萸、菟丝子、丹参、砂仁）的主要活性成分。通过PubChem数据库（https：//pubchem.ncbi. nlm.nih.gov/）获得活性成分的SMILES字符串。

1.1.2 调周滋阴方作用靶点的收集

将查询到的活性成分的SMILES字符串导入到Swiss Target Prediction数据库（http：//www.swisstargetprediction.ch/），物种限定为人，以probability>0为筛选条件，获得活性成分作用靶点，即上述中药的潜在靶点基因。

1.1.3 疾病靶点预测

以“Premature ovarian insuffi-ciency”为关键词在GeneCards数据库（https：//www.genecards.org/）和OMIM数据库（https：//www.omim.org）进行检索，获得与POI相关的基因靶点。将活性成分靶点与疾病靶点导入Draw Venn Diagram网站（https：//bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/）取交集，获得调周滋阴方潜在治疗POI的作用靶点，绘制韦恩图。导入Cytoscape3.9.1软件（https：//cytoscape.org/），进行网络风格化显示。

1.1.4 构建靶基因PPI网络

将1.1.3项获得的药物-疾病交集靶基因导入STRING数据库（http：//www.string-db.org/），以“Homo Sapiens”为物种限定、“highest confidence”（0.9）为阈值，构建靶点PPI网络图。将导出的tsv格式文件导入至Cytoscape3.9.1软件并使用CytoNCA插件进行分析，通过度中心性（DC）、介数中心性（BC）、接近中心性（CC）以及特征向量中心性（EC）4个参数进行筛选排序，获得最终前10核心靶点。

1.1.5 GO、KEGG分析

通过Metascape网站（https：//metascape.org/gp）对交集靶基因进行GO富集分析及KEGG通路富集分析，分析阈值设置为最小重叠靶点为3、P<0.01、最小富集因子Enrichment为1.5。通过微生信在线绘图网站（www.bioinformatics.com.cn）绘制GO富集三合一图及KEGG通路富集气泡图。

1.1.6 疾病-通路-靶点-成分-药物网络构建

将疾病-通路-靶点-成分-药物网络文件导入至Cytoscape3.9.1软件构建网络，更清晰直观地展示调周滋阴方在治疗POI的多通路-多成分-多靶点的作用特点。

1.1.7 分子对接验证

将1.1.3中degree值排名靠前的核心活性成分与1.1.4中degree值排名靠前关键靶点进行分子对接，以期进一步验证网络药理分析结果的准确性。通过PubChem数据库获取活性成分的2D结构sdf格式，Chem3D软件获取活性成分的3D结构mol2格式；使用RCSB PDB数据库（http：// www.rcsb.org/）获取关键靶点3D分子结构pdb格式。运用PyMOL2.3.2软件对关键靶点去除水分子及残基。运用Auto Dock Tools 1.5.7软件将活性成分和关键靶点基因的分子结构转换为pdbqt格式，通过AutoDock Vina 1.1.2软件依次进行分子对接，Affinity（kcal/mol）值代表两者结合能。使用PyMOL软件将部分分子对接结果进行可视化分析。

1.2 动物实验

1.2.1 实验材料

调周滋阴方（熟地黄10 g、白芍12 g、山茱萸10 g、菟丝子10 g、丹参8 g、砂仁3 g）购于江苏省中医院。芬吗通（Abbott Healthcare Products B.V.，注册证号H20150345）。Tris-base（AMRESCO）；NaCl（sigma）；Tween-20（国药集团化学试剂有限公司）；Glycine（biosharp）；SDS（sigma）；5x蛋白上样缓冲液（天根生化科技（北京）有限公司）；脱脂奶粉（BioFroxx）；PI3K、Akt、二抗（proteintech）；p-PI3K、p-Akt（Absin）；β-actin抗体（Abcam）。

1.2.2 动物

SPF级雌性SD大鼠60只，2月龄。实验动物由南京中医药大学附属医院实验动物中心提供，本实验经南京中医药大学附属医院实验动物伦理委员会批准（伦理批号：2022DW-051-03）。

1.2.3 动物模型及干预方法

60只SPF级雌性SD大鼠，按随机数字表法分为6组（n=10）：空白组、模型组、中药低剂量组、中药中剂量组、中药高剂量组、西药组。适应性喂养7 d后，空白组给予生理盐水10 mL/kg^{体质量单次腹腔注射，除空白组外，其余各组予环磷酰胺配液（10 mg/mL）10 mL/kg体质量单次腹腔注射，进行造模。造模成功后开始给药，连续给药28 d，具体给药剂量如下：空白组及模型组给生理盐水灌胃，中药组给予中药煎剂10 mL/（kg·d） 灌胃（中药低剂量组2.78 g/kg，中药中剂量组5.56 g/kg，中药高剂量组11.12 g/kg），西药组按5 d/周期序贯给芬吗通，前3 d予以芬吗通红片（含雌二醇2 mg/片）配液，第4、5天用黄片（每片含雌二醇2 mg+地屈孕酮10mg）配液每片溶入100 mL生理盐水，灌胃剂量10 mL/（kg·d）。大鼠末次给药后，取卵巢组织-80 ℃保存，用于后续实验研究。}

1.2.4 Western blotting检测 PI3K、Akt蛋白表达

取各组大鼠卵巢组织，加入裂解液提取总蛋白，电泳、转模、封闭后，加入一抗（1∶2000，1∶1000）4 ℃孵育过夜，TBST洗涤3次，二抗（1∶10000）室温孵育2 h，TBST洗涤3次，曝光，显影。以β-actin为内参，应用Image J软件对各条带进行定量分析。

1.3 调周滋阴方的临床疗效研究

1.3.1 一般资料

选取2021年6月~2023年6月于江苏省中医院生殖医学科就诊的POI患者共60例，采用随机数字表法分为两组，对照组及试验组各30例。本试验通过南京中医药大学附属医院伦理委员会审批（伦理批号：2018NL-121-02）。

1.3.2 早发性卵巢功能不全诊断标准

参照2017年颁布的《早发性卵巢功能不全的临床诊疗中国专家共识》^［1］，具体内容包括：年龄<40岁；月经稀发或者停经≥4个月；至少2次血清基础FSH>25 mIU/mL（间隔>4周）。

1.3.3 纳入标准

符合诊断标准；年龄20~39岁育龄期妇女；具有良好的依从性，签订知情同意书。

1.3.4 排除标准

生殖系统解剖异常者，如子宫发育异常、子宫粘连等；合并其他内分泌疾病者，如甲状腺功能异常、糖尿病、高泌乳素血症等；合并有严重原发性疾病者，如心血管、肾、肝、造血系统疾病、自身免疫性疾病、恶性肿瘤及精神病等；医源性POI（包括放化疗、卵巢手术史）；近3个月内曾经使用过激素类药物者；输卵管不通者；合并有男方不育因素者；对调周滋阴方所含中药或芬吗通过敏、未按照规定用药、观察期间使用其他药物、资料不全或无法判断疗效等影响疗效或安全性判断者。

1.3.5 治疗方法

对照组：给予芬吗通治疗。月经周期第2天始服用红片，1片/d，服用14 d，然后服用黄片，1片/d，服用14 d，固定时间服药，若漏服需在12 h内补服。停药后等待月经来潮，下次月经的第2天开始新的周期序贯用药，若7 d内月经未来潮，则在停药第7天开始新的周期序贯用药，连续使用3个月经周期。

试验组：在对照组的基础上加用调周滋阴方（熟地黄10 g、白芍12 g、山茱萸10 g、菟丝子10 g、丹参8 g、砂仁3 g），调周滋阴方从月经周期第4天开始服用，经期停服。中药与芬吗通服药间隔≥1 h。

1.3.6 观察指标

内分泌指标：分别于治疗前、后及治疗结束4周后，月经周期第2~4天抽取静脉血，检测雌二醇（E₂）、卵泡刺激素（FSH）、黄体生成素（LH）及抗缪勒氏管激素（AMH），闭经者，就诊当日采血；分别于治疗前、后及治疗结束4周后，月经周期第2~4天阴道B超测量卵巢体积及基础窦卵泡计数（AFC），闭经者，就诊当日检查；Kupperman评分：分别于治疗前、后及治疗结束4周后，采用kupperman评分表评估临床症状，包括潮热出汗、失眠、抑郁等13个项目，总积分0~63分，分值越高表明症状越严重；治疗前完成子宫内膜、乳腺、肝肾功能及血栓风险评估，治疗后复查肝肾功能、凝血功能，记录治疗期间不良反应（阴道不规则流血、恶心、呕吐、皮疹等）及停药后3月内的妊娠情况。

1.3.7 统计学分析

本研究采用SPSS27.0软件行数据统计分析。计量资料以均数±标准差表示，若符合正态分布组间比较使用t检验，若不符合正态分布则使用非参数秩和检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 网络药理学及分子对接结果

2.1.1 调周滋阴方活性成分

通过TCMSP数据库进行检索，结合“DL≥0.18”与“OB≥30%”为条件筛选进一步得到调周滋阴方中6味中药包含121个可被口服吸收的有效活性成分，去重后得到111个活性成分。通过PubChem查找111个活性成分的SMILES字符串，得到有SMILES字符串的活性成分共87个。

2.1.2 调周滋阴方活性成分靶点预测结果

将87个有效活性成分逐一输入Swiss Target Prediction网站进行检索，获得相应成分对应的基因靶点。其中，MOL001921、MOL000492、MOL005360、MOL007068、MOL007071、MOL007151、MOL007152、MOL007059、MOL007070、MOL007150未预测到相关靶点，而MOL005531所获得的靶点Probability均为0，故将上述11个活性成分剔除，剩余76个有效活性成分有对应基因靶点（表1），导出数据Excle整理，共4031个成分靶点，去重后剩余770个调周滋阴方成分靶点。

2.1.3 早发性卵巢功能不全靶点预测结果

以“Premature ovarian insufficiency”为关键词，通过Genecards数据库进行检索，以相关性打分（Relevance score）≥10为筛选条件，得到902个疾病靶点，通过OMIM数据库进行检索，得到211个疾病靶点，合并后共得到1113个疾病靶点，进行去重后最终获得1061个疾病靶点。将770个活性成分靶点和1061个疾病靶点通过Draw Venn Diagram网站在线分析、取交集，获得调周滋阴方治疗POI的靶点163个，绘制韦恩图（图1）。

2.1.4 中药-有效成分-疾病靶点网络

借助Excel表格整理“中药-有效成分-疾病靶点”对，导入至Cytoscape3.9.1软件，进行网络风格化显示（图2）。该网络共有节点245个，边1312条，其中6个节点代表调周滋阴方中药成分，76个节点代表调周滋阴方活性成分，163个节点代表调周滋阴方治疗POI的靶点。其中A1（MOL000359）为熟地、白芍、山茱萸的共同活性成分，B1（MOL000449）为熟地、山茱萸、砂仁的共同活性成分，C1（MOL000358）为白芍、山茱萸、菟丝子、砂仁的共同活性成分，D1（MOL000422）为白芍、菟丝子的共同活性成分，E1（MOL001771）为山茱萸、丹参、砂仁的共同活性成分（表1）。

2.1.5 PPI网络构建和核心基因预测

将调周滋阴方和早发性卵巢功能不全共同靶点导入到String数据库，以“Homo Sapiens”为物种限定、“highest confidence”（0.9）为作用阈值，获得调周滋阴方治疗早发性卵巢功能不全靶点PPI网络图（图3）。该PPI网络中节点数为163，边数为813，平均节点度为9.98，平均局部聚类系数为0.504，其中ABCC1与ABCG2两者间有相互作用，与其他靶点间未发生相互作用。后导入Cytoscape3.9.1软件，使用CytoNCA插件进行分析，然后通过DC、BC、CC、EC4个参数进行筛选，筛选出大于每个参数中位数以上的靶点，构建核心靶点的筛选策略图，按DC排序，选择前10个靶点为核心靶点，分别为SRC、TP53、STAT3、PIK3CA、MAPK3、HRAS、PIK3R1、MAPK1、HSP90AA1、PTPN11（图4，表2）。节点越大、颜色越深表明度值越高，节点间连线表示各靶点之间存在的相互作用关系。

2.1.6 GO功能富集分析

通过Metascape网站对调周滋阴方治疗早发性卵巢功能不全的163个靶点进行GO富集分析，包括生物过程（BP）、细胞成分（CC）及分子功能（MF）共3个模块的分析，各自按P值由小到大排序，展示排名为前10的相关富集条目。本研究结果显示，生物过程主要富集在细胞运动的正调控、细胞迁移的正调控、蛋白质磷酸化、磷酸化的正调控等，细胞成分主要富集在膜筏、膜微区、受体复合体、细胞基底结等，分子功能主要富集在蛋白激酶活性、磷酸转移酶活性、蛋白酪氨酸激酶活性等（表3）。使用微生信在线网站绘制GO富集BP CC MF三合一图（图5）。

2.1.7 KEGG通路富集分析

通过Metascape网站对调周滋阴方治疗POI的163个靶点进行KEGG通路富集分析，共获得190条信号通路，按P值由小到大排序，展示排名前20的主要信号通路，包括癌症通路、PI3K-Akt信号通路、癌症中的蛋白聚糖、前列腺癌症、脂质与动脉粥样硬化、内分泌抵抗、Rap1信号通路、Ras信号通路、MAPK信号通路等（表4）。使用微生信在线网站绘制KEGG通路富集气泡图（图6）。

2.1.8 疾病-通路-靶点-成分-药物网络构建

通过Cytoscape3.9.1构建了疾病-通路-靶点-成分-药物复杂网络（图7），该网络包括266个节点和2002条边。黄色节点（1个）表示疾病POI，紫色节点（20个）表示与POI相关的KEGG通路，绿色节点（163个）表示调周滋阴方治疗POI的靶点，粉色节点（76个）表示调周滋阴方中有效成分，浅绿色节点（6个）表示调周滋阴方中6味中药。该网络显示，调周滋阴方中的6种中药通过多个靶点、多个信号通路途径共同协同治疗POI。

2.1.9 分子对接验证

4种核心活性成分山奈酚、β-谷甾醇、木犀草素、槲皮素与5种核心靶点SRC、TP53、STAT3、PIK3CA、MAPK3分别进行分子对接。一般认为，结合能<-4.25 kcal/mol提示配体小分子与受体蛋白间有一定的结合活性，结合能<-5.0 kcal/mol提示有较好的结合活性，而结合能<-7.0 kcal/mol提示两者间有强烈的结合活性。结合能越低，表明配体、受体之间结合越稳定、越紧密。分子对接结果显示（表5），核心活性成分与核心靶点两两之间结合能均小于-4.25 kcal/mol，且山奈酚与TP53、STAT3、MAPK3，木犀草素与TP53、STAT3、MAPK3，槲皮素与SRC、TP53、STAT3、MAPK3两两之间的结合能均小于-7.0 kcal/mol，提示两者具有强烈的结合活性。通过PyMOL软件绘图，选取部分对接结果进行可视化分析（图8）。

2.2 实验验证结果

与空白组比较，模型组p-PI3K、p-Akt蛋白表达下降（P<0.01）；与模型组比较，中药中、高剂量组及西药组p-PI3K蛋白表达均上升（P<0.05，P<0.01），中药低、中、高剂量组及西药组p-Akt蛋白表达均上升（P<0.05，P<0.01，图9）。

2.3 临床研究结果

2.3.1 患者年龄、病程比较

两组患者在年龄、病程等方面差异无统计学意义，具有可比性（P>0.05，表6）。

2.3.2 治疗前、后及治疗结束4周后性激素水平比较

治疗前，两组AMH、E₂、FSH、LH水平比较差异无统计学意义（P>0.05）。治疗后，两组E₂较治疗前升高，FSH、LH较治疗前降低（P<0.05）；试验组AMH较治疗前升高（P<0.05）。治疗后，试验组E₂高于对照组，FSH、LH均低于对照组（P<0.05）。而治疗结束4周后，试验组E₂、FSH、LH较本组治疗前仍有好转（P<0.05），且优于同期对照组（P<0.05），AMH无统计学差异（P>0.05），而对照组AMH、E₂、FSH、LH较本组治疗前差异均无统计学意义（P>0.05，表7）。

2.3.3 两组治疗前、后及治疗结束4周后窦卵泡数及Kupperman评分比较

治疗前，两组窦卵泡数、Kupperman评分比较无明显差异（P>0.05）。治疗后，两组窦卵泡数均高于治疗前（P<0.05），两组Kupperman评分均较治疗前降低（P<0.05），且试验组Kupperman评分低于对照组（P<0.05）。而治疗结束４周后，试验组窦卵泡数、Kupperman评分较本组治疗前仍有好转（P<0.05），且优于同期对照组（P<0.05），而对照组窦卵泡数、Kupperman评分较本组治疗前差异无统计学意义（P>0.05，表8）。

2.3.4 两组患者安全性及妊娠情况比较

治疗期间，两组患者肝肾功能、凝血功能均无明显异常，两组患者不良反应发生率比较，差异无统计学意义（P>0.05）。停药后3月内试验组妊娠率6.7%，对照组妊娠率3.3%，差异无统计学意义（P>0.05，表9）。

3 讨论

POI发病率呈日益上升趋势，然而其病因复杂，包括遗传、代谢、感染、免疫、医源、环境及基因突变等多种因素。POI的发病机制及有效治疗手段一直是研究的热点及重点。近年来，中医药治疗POI的潜力逐渐受到关注及重视。

本研究网络药理学分析发现，SRC、TP53、STAT3、PIK3CA、MAPK3可能是调周滋阴方治疗POI的主要核心靶点，PI3K-Akt信号通路、MAPK信号通路等信号通路可能是其治疗POI的关键通路。研究发现，SRC蛋白分布于原始卵泡的颗粒细胞膜及卵质膜，表达水平随着原始卵泡的生长而增加，且通过PI3K-PKC-ERK1/2通路对原始卵泡的激活和生长起重要调控作用^［7］。TP53与FSH/LH比值相关，是35岁以下基线FSH水平低于10IU/L且FSH/LH比<2.3的患者IVF结果的潜在预测遗传标志^［8］，TP53增加了女性卵巢储备低的发生率，可作为不孕患者卵巢储备低的遗传标记^［9］。STAT3在哺乳动物卵泡发育的卵巢颗粒细胞（GC）中发挥重要作用，可抑制细胞凋亡并促进细胞增殖^［10］。PIK3CA是PI3K家族中唯一存在肿瘤特异性突变的基因，PIK3CA在人体各个组织中均有表达，可激活PI3K/Akt信号通路，PI3K-Akt-mTOR通路在调节代谢中起着至关重要的作用。MAPK3属于MAPK家族，与GC的增殖及凋亡有关，与卵巢和卵泡发育状态及胚胎发育密切相关，MAPK通路能负反馈调节PI3K通路^{［11，12］}。POI治疗通路较为复杂，其中较为重要且已被证实的主要通路包括PI3K-Akt信号通路。本研究通过动物实验验证上述网络药理学结果，Western blotting实验发现，调周滋阴方可显著升高POI大鼠卵巢组织中p-PI3K和p-Akt蛋白表达，表明调周滋阴方可激活PI3K/Akt通路的磷酸化，结合以上网络药理学的分析结果，提示PI3K/Akt通路可能在调周滋阴方治疗POI中发挥重要作用。

POI患者多表现为性激素异常、生育力下降及绝经过渡期等症状，我们设计临床对照试验验证调周滋阴方对POI的临床疗效。本研究结果显示，较对照组相比，试验组在改善性激素水平、Kupperman评分方面效果更明显，且妊娠率较对照组有升高趋势。可见调周滋阴方可改善POI患者的内分泌紊乱状态，改善卵巢储备功能，缓解临床症状，提高临床疗效。结合网络药理学分析，调周滋阴方主要核心成分包括山奈酚、β-谷甾醇、木犀草素、槲皮素。研究表明，山奈酚是天然衍生的黄酮类化合物，呈现雌激素样活性，可以减少活性氧（ROS）的产生，有抗氧化、抗细胞凋亡、抗炎等作用^［13-15］；能够促进等级前卵泡颗粒细胞的增殖，促进FSHR和ERα mRNA的表达，进而促进等级前卵泡向等级卵泡的发育^［16］；且可改善受精卵母细胞老化后的不良妊娠结局，有助于提高试管婴儿和ICSI的成功率^［17］。β-谷甾醇为四环三萜类化合物，与17β-雌二醇的结构有较高的相似性，可作为雌激素激动剂，有抗氧化、免疫调节等作用^［18-20］；可调节性激素平衡，改善子宫内膜容受性，可能与调控肠道微生物群结构有关^［21］；还可抑制凋亡，促进颗粒细胞增殖，可能与调控PI3K/AKT信号通路有关^［22］。木犀草素是黄酮类化合物，具有抗氧化、调节糖脂代谢等多种生物学作用，在生物化学上起到抗氧化剂或促氧化剂的作用，可调控PI3K/Akt信号传导^{［23， 24］}。槲皮素是黄酮类化合物，有抗炎、抗氧化等多种功效^{［25， 26］}；可通过逆转线粒体功能障碍和通过PGC1-α途径激活线粒体生物发生，保护卵巢储备免受CTX诱导的卵巢损伤，改善卵巢功能，被认为是治疗POI的潜在药物^［27］。故综合网络药理学分析结果及研究结果，推测调周滋阴方的主要活性成分可能是通过抗氧化、抗细胞凋亡等达到治疗POI的作用的。分子对接结果显示，核心活性成分山奈酚、β-谷甾醇、木犀草素、槲皮素均能与核心靶点SRC、TP53、STAT3、PIK3CA、MAPK3稳定结合，初步揭示了调周滋阴方可通过多靶点，多通路治疗POI。

综上所述，本研究通过网络药理学与分子对接对调周滋阴方治疗POI的复杂网络关系进行探索，阐明了调周滋阴方具有多成分、多靶点、多途径的治疗特点。通过动物实验研究，在分子水平上证实了调周滋阴方对POI可能的作用通路。并通过临床试验证实调周滋阴方治疗POI临床疗效确切。本研究可为调周滋阴方治疗POI的临床应用提供理论基础和科学依据，为后续机制研究探究提供研究思路及参考方向。

参考文献

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