绒毛样蛋白VILL通过与LMO7蛋白相互作用抑制鼻咽癌细胞的增殖

Villin-like protein VILL suppresses proliferation of nasopharyngeal carcinoma cells by interacting with LMO7 protein

摘要

目的 探索绒毛样蛋白VILL抑制鼻咽癌增殖的分子机制。 方法 收集136例鼻咽癌和67例鼻咽非癌组织，采用免疫共沉淀（CO-IP）、质谱、Western blotting、免疫荧光和GST pull down实验在鼻咽癌细胞株中筛查并验证VILL相互作用丰度最高蛋白。采用转基因实验，在体外（鼻咽癌细胞株）和体内（裸鼠）验证VILL与靶蛋白对鼻咽癌增殖的调控作用。采用免疫组化实验在临床组织标本中验证VILL与靶蛋白表达水平与鼻咽癌临床特征的相关性。 结果 在鼻咽癌细胞（HONE1 EBV、S18）中，VILL与E3泛素连接酶LMO7相互作用的丰度最高，二者共定位于细胞浆，直接相互作用。过表达LMO7部分逆转VILL对鼻咽癌细胞增殖的抑制作用。与67例鼻咽非癌组织比较，VILL表达在136例鼻咽癌组织中下调（P<0.0001）且与临床T分期（P=0.04）、N分期（P=0.01）和M分期（P=0.013）显著相关，而LMO7在鼻咽癌普遍高表达。 结论 VILL可能通过抑制LMO7的促癌功能而抑制鼻咽癌增殖。

Abstract

Objective To elucidate the molecular mechanism by which villin-like protein VILL (VILL) inhibits proliferation of nasopharyngeal carcinoma (NPC) cells. Methods Co-immunoprecipitation (CO-IP) assay, mass spectrometry, Western blotting, immunofluorescence staining, and GST pull-down assay were employed to identify and confirm the protein interacting with VILL that had the highest abundance in NPC cell lines. Transgenic experiments were conducted in both NPC cell lines and nude mice to validate the regulatory role of VILL and its target protein in NPC proliferation. Immunohistochemistry was utilized to assess the correlation of the expression levels of VILL and its target protein in clinical tissue specimens of NPC with the clinical features of the patients. Results In NPC cell lines (HONE1 EBV and S18), VILL was found to interact most abundantly with the E3 ubiquitin ligase LMO7, and both proteins co-localized in the cytoplasm with direct interactions. Overexpression of LMO7 partially counteracted the inhibitory effect of VILL on NPC cell proliferation. The expression of VILL was significantly downregulated in 136 NPC tissue samples compared to 67 non-cancerous nasopharyngeal tissues (P<0.00001) with close correlation with clinical T stage (P=0.04), N stage (P=0.01), and M stage (P=0.013), whereas LMO7 was highly expressed in all the NPC tissues. Conclusion VILL overexpression inhibits NPC proliferation probably by suppressing the oncogenic function of LMO7.

Graphical abstract

关键词

鼻咽癌 / VILL蛋白 / LMO7蛋白 / 蛋白相互作用 / 增殖

Key words

nasopharyngeal carcinoma / villin-like protein VILL / LMO7 protein / protein interaction / cell proliferation

鼻咽癌（NPC）是一种常见的恶性肿瘤，好发于咽上壁和咽隐窝等部位^［1］。NPC在北非、东南亚以及我国南方地区高发^［2，3］。由于NPC早期症状不明显，超过70%的NPC患者就诊时已是中晚期。早期NPC的5年存活率超过90%且生活质量高，而中晚期的5年存活率只有50%~70%且生活质量低^［1］。因此，发现NPC早期驱动基因并阐明其发病机制，为NPC早期诊治提供靶标具有重要意义。

目前已发现的NPC驱动基因包括CDKN2A^［1］、RASSF1A^［4］、PDGFB^［4］、ZNF582^［5］、USP44^［6］、TEAD4^［7］、WTAP^［8］、IGF2BP3^［9］、USP7^［10］、HDAC4^［11］、miR-874-3p^［12］、circRILPL1^［13］和TGFBR2^［14］等，这些驱动基因在NPC发生发展的各个阶段发挥重要作用。以上均是看家基因，在多种组织细胞中发挥重要功能^{［1， 4， 14］}，靶向这些基因会带来严重的副作用。因此，当前研究重点是寻找组织特异性表达的癌症关键驱动基因^［15］。

DNA甲基化检测已成为癌症早筛的研究热点^［16］，甲基化检测可比影像学诊断提前约半年发现癌症^［17］。为此，我们从6例NPC患者和4例健康人的血液中提取游离DNA，进行全基因组甲基化测序（数据上传至国家遗传资源数据库GSA，编号：HRA000621）。同时，与中山大学马骏教授团队发表的48例NPC组织和对照的甲基化芯片数据（GSE52068）^［18］进行整合分析。结果筛选到5个NPC特异性甲基化连锁区域（MHB）^［19］，其中只有MHB5区域定位于候选抑瘤基因（VILL）^［20］的启动子。VILL定位于染色体3p21-22，该染色体区域拷贝数丢失是公认的NPC早期事件^［1］。因此在NPC早期，VILL可能发生拷贝数丢失的同时伴随启动子甲基化。本团队前期研究显示，VILL过表达显著抑制NPC细胞（HONE1-EBV和S18）增殖，VILL过表达显著抑制NPC细胞成瘤，提示VILL是候选NPC抑瘤基因。

绒毛样蛋白VILL（Villin-like）结构上包含6个重复的凝溶胶样结构（GEL）和1个头盔结构（VHP），进化上高度保守^［20］。蛋白质组数据库检索显示，VILL在人的鼻咽、呼吸道和胃肠道的粘膜中特异性表达^［21］。目前，关于VILL的基因功能知之甚少。在果蝇的卵子发生过程中，VILL蛋白是滋养细胞中肌动蛋白交联所必须^［22］。在青鳉鱼中沉默VILL表达抑制细胞表面微绒毛的形成^［23］。至于人VILL基因的功能则未见报道。因此，本研究拟进一步探讨VILL抑制NPC增殖的分子机制。

1 材料和方法

1.1 临床样本、细胞系和实验动物

从中山市人民医院病理科收集136例NPC和67例鼻咽非癌组织的石蜡切片。用含有10%胎牛血清（vigonob）和1640培养基（vigonob）培养NPC细胞系（S18、SUNE1、HONE1和HONE1 EBV）。20只雄性Nod-SCID小鼠（江苏集萃药康生物科技股份有限公司），体质量15~25 g、3~4周龄，饲养于屏障动物房中，小鼠自由饮水以及摄食，室温22 ℃，自动光控（明12 h，暗12 h），饲养2周后进行实验。本研究经长沙市中医医院伦理委员会批准通过［伦理批号：长沙市中医医院基地（伦）审第（2022111006）号］。

1.2 质粒和转染

VILL+Flag过表达慢病毒载体及其对照和LMO7过表达慢病毒载体及其对照（上海权阳生物科技有限公司）。采用Lipofectamine 2000试剂盒（Invitrogen），将慢病毒载体与包装质粒psPAX2 （Addgene）和穿梭质粒pMD2.G（Addgene）共转染至HEK293T细胞。48 h后，通过离心和0.45 μm PVDF滤器过滤（Millipore）收集慢病毒颗粒，感染NPC细胞（HONE1 EBV和S18）。用0.5 μg/mL嘌呤霉素（碧云天）筛选稳转细胞。Western blotting实验验证转染效率。

1.3 免疫共沉淀（CO-IP）和质谱检测

采用CO-IP试剂盒（万类生物），按照说明书进行CO-IP实验：预处理、去除非特异性杂蛋白、抗体孵育、免疫沉淀和洗脱。然后进行Western blotting验证。诱饵蛋白分别为FLAG（康体生命）、LMO7（Affinity）、VIM（碧云天）和DHX9（proteintech）。IP产物进行质谱检测LC-MS/MS（广州辉骏生物科技股份有限公司）。

1.4 Western blotting

提取NPC细胞中的总蛋白经细胞裂解液（碧云天），再经蛋白变性、电泳和转膜。封闭后的膜与一抗［DHX9（1∶1000），β-actin（1∶5000）（proteintech），VIM、 Flag（1∶1000，康体生命）、VILL（1∶1000，BBI）、LMO7（1∶1000，Bioss）、WDR33（1∶1000， Abclonal）、HNRNPK（1∶1000，BBI）］和二抗［辣根酶标记山羊抗兔/鼠IgG（H+L），1∶1000，碧云天］孵育。最后进行底物显色和图片采集。

1.5 免疫荧光染色

NPC细胞爬片经固定与破膜后，再经封闭、一抗VILL（1∶100，Abclonal）和LMO7（1∶200，Affinity）和二抗［山羊抗兔IgG H&L（Alexa Fluor 488和Alexa Fluor 647）（1∶500，碧云天）］孵育后，最后经DAPI（2 μg/mL，碧云天）对细胞核进行染色和激光共聚焦显微镜采集图片。

1.6 CCK-8实验

取对数生长期NPC细胞接种到96孔细胞培养板中，调整细胞密度为1000/孔。贴壁后（12 h）加入10 μL/孔的CCK-8溶液，37 ℃孵育2 h，酶标仪检测吸光度值A_{450 nm}。检测时间点为12 h、1 d、2 d、3 d、4 d、5 d。检测结束后，绘制生长曲线。

1.7 裸鼠成瘤实验

分别将转染VILL、LMO7、VILL+LMO7或空载体的S18细胞（1.0×10⁷）皮下注射裸鼠的左侧下腹部。小鼠5只/组，每3 d检测肿瘤生长和体积，40 d后通过颈椎脱位法对小鼠实施安乐死，并称量肿瘤组织的质量、计算肿瘤体积。

1.8 免疫组织化学法

取组织切片在60 ℃恒温箱中烘烤30 min，置于二甲苯中脱蜡并与分级乙醇系列水合，在微波炉里高火加热0.01 mol/L柠檬酸钠缓冲溶液（pH 6.0）至沸腾后将组织切片放入20 min。10%血清（TBS配制）封闭30 min；一抗VILL（Sigma，1∶100）或者LMO7（Affinity，1∶100）孵育过夜；用PBS冲洗3次，5 min/次。在室温下，加入二抗，室温孵育60 min；37 ℃孵育30 min。DAB 染色，苏木素染色，脱水封片，染色玻片扫描。将染色强度分成-、+、++、+++4个等级；+++和++定义为高表达，+和-定义为低表达。

1.9 统计学分析

使用R软件4.3.1版进行统计分析和数据可视化。计量数据以均数±标准差表示，采用卡方检验或Fisher精确检验分析VILL和LMO7表达水平在不同组别的差异，采用Pearson法检测结果与人口学和临床特征的相关性，其余组间比较采用独立样本t检验。所有假设检验均为双侧检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 LMO7与VILL在NPC细胞中相互作用

在两株不表达VILL的NPC细胞株（HONE1-EBV、S18）中过表达VILL+Flag（图1A），以S18细胞中Flag为诱饵蛋白进行CO-IP实验，将得到的IP产物进行质谱检测，得到与VILL相互作用的候选蛋白（表1）。除了细胞骨架蛋白外，已知LMO7、DHX9和VIM、WDR33和HNRNPK在肿瘤的发生发展中起重要作用。

Western blotting检测发现VILL与LMO7、DHX9和VIM相互作用，而不与WDR33和HNRNPK相互作用（图1B）。CO-IP实验结果显示（图1C），当以LMO7为诱饵蛋白时，IP产物VILL的丰度最高。利用纯化的GST-VILL重组蛋白和LMO7的纯化蛋白，进行GST pull-down 实验，证实二者直接相互作用（图1D）。免疫荧光实验进一步证实了VILL和LMO7在NPC细胞株（HONE1、SUNE1）的细胞浆中共定位（图1E）。

2.2 VILL通过LMO7抑制NPC细胞增殖

在不表达VILL的NPC细胞株（HONE1-EBV和S18）中分别过表达VILL、LMO7以及二者联合过表达（图1A，图2A、B），CCK-8实验结果显示（图2C、D），过表达VILL抑制NPC细胞（HONE1-EBV、S18）增殖（P<0.001），过表达LMO7则促进NPC增殖；同时过表达VILL和LMO7，可部分逆转VILL对NPC细胞增殖的抑制作用（P<0.001）。

裸鼠皮下成瘤实验结果显示（图3），过表达VILL的NPC细胞（S18）成瘤最小，而过表达LMO7的NPC细胞成瘤最大（P<0.001）；同时过表达VILL和LMO7的NPC细胞成瘤能力则处于中间（P<0.05）。

2.3 在NPC中，VILL表达下调且与TNM分期相关，而LMO7则一致高表达

免疫组化分析结果显示（表2，图4A、B），VILL在67例非癌组织中全部高表达（42例强度为+++，25例强度++），在136例NPC组织中仅有27.2%高表达（37例强度为++，73例强度为+，26例强度为-），VILL在NPC组织中表达下调（P<0.0001）。VILL表达与肿瘤T分期（P=0.04）、颈部淋巴结转移（P=0.01）、远处转移（P=0.013）以及临床分期（P=0.027）等显著相关（表3，图4C、D）。LMO7在NPC组织中一致高表达，其表达水平与VILL的表达高低无关（图5）。

3 讨论

本研究基于CO-IP联合质谱筛查VILL的相互作用蛋白，证实LMO7是其主要直接相互作用蛋白。过表达LMO7促进NPC增殖，联合过表达VILL和LMO7部分逆转了VILL的抑瘤功能，因此，VILL通过LMO7调节NPC增殖。临床样本免疫组化也显示，VILL低表达与NPC发生发展相关，而LMO7则一致高表达，因此，VILL的表达下调失去了对LMO7的调节作用，导致NPC增殖不受控。LMO7基因，即LIM域7基因。LIM结构域与蛋白质相互作用相关。LMO7在多种组织器官中表达，具有蛋白结合、金属离子结合和泛素连接酶等活性，参与细胞分化、迁移、粘附和免疫调控等过程。LMO7参与多种癌症的发生发展^［24］。

在非小细胞肺癌中，LRIG蛋白家族（LRIG1、LRIG2和LRIG3）通过与LMO7相互结合，负调控受体酪氨酸激酶，而发挥肿瘤抑制作用^［25］。在胰腺癌中，LMO7参与调控胰腺癌细胞的细胞周期阻滞和凋亡，从而调节胰腺癌细胞的增殖、侵袭和转移^［26］。我们先前的研究表明，过表达VILL导致NPC细胞的细胞周期阻滞和凋亡，抑制NPC细胞的增殖、侵袭和转移（正在投稿）。因此，VILL是否通过与LMO7相互结合来实现这个功能，值得进一步研究。

LMO7主要以泛素连接酶的身份参与癌症的发生发展。例如，作为E3泛素连接酶，LMO7与STING结合，通过泛素化STING而激活STING通路，进而激活抗癌T细胞，杀死癌细胞。肿瘤抑制蛋白激酶DAPK3通过磷酸化LMO7，激活STING-IFN-β通路，驱动肿瘤固有免疫^［27］。同样地，LMO7在胰腺癌细胞中高表达，通过泛素化降解Foxp1，解除其对TGF-β/CCL5的直接抑制，从而促进胰腺癌细胞分泌TGF-β和CCL5等细胞因子。这些细胞因子进一步促进Treg细胞的分化和趋化，抑制抗肿瘤免疫反应，从而促进胰腺癌免疫逃逸^［28］。因此，VILL与LMO7的结合是否也与LMO7的泛素化功能相关，值得进一步研究。

综上所述，本研究发现LMO7是NPC抑癌基因VILL的主要结合蛋白。LMO7在多种肿瘤中，通过蛋白相互作用，以泛素连接酶的形式发挥癌基因功能。未来我们将具体阐明VILL-LMO7轴调控的信号通路，为NPC的早期诊断和治疗提供靶标。

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基金资助

湖南省自然科学基金(2023JJ30068)

长沙市自然科学基金(kq2208490)

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