冠心病（CHD）是全球死亡率最高的疾病之一
［1］。根据《中国心血管健康与疾病报告2021摘要》，我国约有1139万CHD患者，给社会带来了巨大的经济负担
［2］。既往研究表明，异常DNA甲基化参与了炎症反应、血管重构以及动脉粥样硬化相关基因的表达，与CHD的风险因素相关，对CHD的发生发展至关重要
［3-5］。一项大型前瞻性研究纳入了美国和欧洲9个人群队列共计11461名研究对象，平均随访11.2年，发现全血中52个CpG位点的异常甲基化与CHD或心肌梗死（MI）发生风险增加相关
［6］。然而，该关联尚未在中国人群中得到验证。
DNA甲基化研究主要关注基因启动子区域，目前有研究发现内含子区域甲基化与基因表达间也存在重要联系
［7］。因此，我们将从Agha等
［6］发现的52个CpG位点入手，筛选位于内含子区域的位点，采用定量核酸质谱技术在中国人群中探索这些位点及其所在基因的甲基化水平与CHD、CHD亚型的关系。
1 资料和方法
1.1 研究对象
选择2018~2019年在中国人民解放军总医院就诊的CHD患者86例为病例组，其中伴有心力衰竭（HF）症状的有84例，确诊为心肌梗死（MI）的患者44例。病例组纳入标准：经冠状动脉造影结合其他临床检查（如肝肾功能、血糖、血脂、心肌酶学、肌钙蛋白等）确诊为CHD；18岁≤年龄<90岁；临床数据完整；DNA量比较充裕。排除标准：先天性心脏病、恶性肿瘤、严重肝肾功能异常、急性感染及各种凝血功能异常性疾病的患者。选择于中国人民解放军总医院同期健康体检者95例为对照组。对照组纳入标准：无CHD病史、无肿瘤病史，且肝肾功能正常；18岁≤年龄<90岁；与病例组的年龄和性别频数匹配；临床数据完整；DNA量比较充裕。本研究通过中国人民解放军总医院伦理委员会批准（伦理批号：S2018-298-02），所有研究对象均签署知情同意书。
1.2 样本采集和处理
使用EDTA管采集两组的外周血样本，离心后储存于-80 ℃备用。使用DNA提取试剂盒（南京腾辰生物科技）处理外周血样本。使用EZ DNA Methylation-Gold Kit（Zymo Research Corporation）对已提取的DNA进行亚硫酸氢盐转化，整个操作过程平行处理两组血液样本。
1.3 候选基因筛选流程
将文献［
6］中52个CpG位点输入UCSC网站中的“human GRch37/hg19”数据库中，查询到有20个CpG位点位于相应基因的内含子区域，分别为：
BNC2（cg14185717）、
PTPN5（cg10307345）、
PSME4（cg13822123）、
TSSC1（cg23245316）、
GTF2I（cg24977276）、
ADAMTS2（cg02683350）、
MLPH（cg06639874）
、MAD1L1（cg05892484）、
PTPRN2（cg25497530）、
IGF1R（cg06596307）、
FGGY（cg10702366）、
SLCO3A1（cg26467725）、
CYFIP1（cg22871797）、
MPPED1（cg20545941）、
TNXB（cg19935845）、
CDH23（cg19227382）、
HPCAL1（cg03467256）、
PRRG4（cg17556588）、
GUCA1B（cg14010194）和
SFTA3（cg20000562）。然后使用EpiDesigner软件（Agena）对包含这20个CpG位点的序列设计了甲基化特异性引物，首先排除引物、目的CpG位点和扩增片段位于重复序列区域的3个基因（
CYFIP1、
PRRG4、
HPCAL1），然后排除引物区域和扩增片段内CpG位点有SNPs的7个基因（
PTPN5、
GTF2I、
MAD1L1、
PTPRN2、
FGGY、
SLCO3A1、
CDH23）。排除BLAST比对失败的
ADAMTS2基因，以及甲基化PCR扩增失败的
PSME4基因。利用定量核酸质谱检测各目的基因扩增片段上CpG位点的甲基化程度，发现4个基因（
GUCA1B、
SFTA3、
MPPED1、
TNXB）目的位点所在片段质量超出检测范围；2个基因（
BNC2、
IGF1R）扩增片段上CpG位点整体呈超低或超高甲基化状态（甲基化水平小于0.1或大于0.9），数据不可靠，故排除这6个基因。最终，
TSSC1和
MLPH基因纳入下一步分析流程。
TSSC1基因正向引物：aggaagagagGGATTTTGGGATTTTTTATTTGTTT；反向引物：cagtaatacgactcactatagggagaaggctCCTACTA CAAAAACCCTACCAAACT。
MLPH基因正向引物：aggaagagagGGTAGAGAAGATTTTATTTGGGGAG；反向引物：cagtaatacgactcactatagggagaaggctATACTCC CATCTCAACCTAATTTCC。大写字母表示引物序列中特异性区域，小写字母为非特异性标识。
1.4 DNA甲基化水平检测
采用文献［
8,
9］报道的Agena基质辅助激光解析电离飞行时间质谱（MALDI-TOF MS）（Agena Bioscience）定量评估候选基因CpG位点的甲基化程度。
MassARRAY系统在TSSC1基因扩增子（477bp）中检测到10个CpG位点，在MLPH基因扩增子（351bp）中检测到6个CpG位点。在质谱检测过程中，MLPH_CpG_2和MLPH_CpG_7所在片段具有相同质量，系统报告相同数值，因此简化表示为MLPH_CpG_2.7。
1.5 统计学分析
使用SPSS 25.0、GraphPad Prism 8和R 4.0.5软件进行统计分析与绘图。定量数据使用中位数（四分位间距）表示，并采用Mann-Whitney秩和检验比较组间差异。计数资料采用卡方检验比较组间差异。P<0.05为差异有统计学意义。采用Spearman相关系数和列联系数评估甲基化水平与年龄、性别之间的相关性。检验水准α=0.05。
2 结果
2.1 基本情况比较
CHD组中吸烟人数、高血压以及糖尿病患者人数均多于对照组，TC和LDL-C水平低于对照组（
P<0.05，
表1）。
2.2 TSSC1和MLPH基因甲基化与CHD的关系
对照组
MLPH以及
TSSC1基因的甲基化水平有低于CHD组的趋势（
表2），但是显著性差异有待通过进一步的分析来挖掘。
2.3 TSSC1和MLPH基因甲基化与CHD亚型的关系
MI组中
MLPH基因扩增片段整体甲基化水平高于对照组，其中4个位点显示差异有统计学意义（MLPH_CpG_2.7：
P=0.045；MLPH_CpG_3/cg06639874：
P=0.049；MLPH_CpG_5：
P=0.019，
表3A），绝对甲基化差值由1%升高至3%~4%（表
2、
3A）。
TSSC1基因扩增片段上仅CpG_17显示出差异有统计学意义（
P=0.033，
表3A）。此外，两个基因扩增片段均未显示出与HF的相关性（
表3B）。
2.4 年龄、性别与TSSC1、MLPH基因甲基化水平的相关性
CHD组中MLPH_CpG_3/cg06639874和MLPH_CpG_4甲基化水平与年龄呈负相关（
r=-0.335，
P=0.002；
r=-0.275，
P=0.012，
图1A、B）；对照组中，MLPH_CpG_4甲基化水平则与年龄呈正相关（
r=0.217，
P=0.035，
图1A~D）。年龄<65岁时，CHD组
MLPH基因呈高甲基化状态（MLPH_CpG_2.7：
P=0.014；MLPH_CpG_4：
P=0.001，
表4）；年龄≥65岁时，两组甲基化水平无差异。两个年龄组均未发现
TSSC1基因甲基化与CHD的相关性。
相关性分析显示，仅MLPH_CpG_3/cg06639874在CHD组与男性呈现一定的相关性（
C=0.557，
P=0.023，
图1D）。性别分层分析发现，在女性中，仅CHD组的TSSC1_CpG_8甲基化水平高于对照组（
P=0.014，
表5）。而在男性中，CHD组MLPH_CpG_2.7和MLPH_CpG_3/cg06639874甲基化水平高于对照组（MLPH_CpG_2.7：
P=0.004；MLPH_CpG_3/ cg06639874：
P=0.044，
表5）。
3 讨论
血液中异常DNA甲基化在心血管疾病的发生发展中有着重要作用
［10， 11］。本研究发现在MI型CHD患者、年龄<65岁群体和男性群体中，血液中
MLPH基因高甲基化和CHD风险升高相关。
MLPH基因位于染色体2q37.3编码黑素亲和素，主要参与了黑素小体的转运
［12］，有研究发现
MLPH基因3'UTR区域甲基化参与了微管跟踪
［13］，此外，
MLPH基因高表达与前列腺癌患者总体生存率低相关
［14］。
TSSC1基因位于染色体2p25.3编码癌症相关成纤维蛋白，受到
RUNX2基因的负向调控，能抑制乳腺癌骨转移
［15］。本研究发现MI型CHD患者的
MLPH甲基化程度升高，但是HF型CHD患者却未显示出统计学差异。这提示
MLPH异常甲基化与心肌梗死亚型相关，并且可能随着病情的严重程度而变化。但是我们未观察到
TSSC1基因（包括cg23245316）甲基化改变和CHD的相关性。本研究结果和Agha等
［6］的报道存在差异，可能是因为DNA甲基化水平会受到不同种族的影响
［16］，加之样本量的限制，所以此结果需要在不同种族以及多中心人群中进一步验证。
年龄和性别也是CHD患病风险的重要影响因素。既往研究表明，随着年龄的增长，CHD的患病风险在升高，且男性CHD发病率高于女性
［17］。本研究发现仅在年龄<65岁时，CHD组
MLPH基因（MLPH_CpG_2.7和MLPH_CpG_4）甲基化水平升高。相关性分析显示CHD组中
MLPH基因甲基化水平与年龄呈负相关，而在对照组中则呈正相关，这或许可以解释在<65岁时CHD组
MLPH基因甲基化水平高于对照组，而在≥65岁时两组甲基化水平相近。Liu等
［18］在一项巢式病例对照研究中发现，仅在<65岁时，脑卒中组和对照组的外周血
ACTB基因甲基化水平存在差异。Schott等
［19］也发现
HYAL2基因甲基化水平仅在对照组中与年龄呈负相关，而在胰腺癌组中未表现出相关性。性别分层分析发现，在男性样本中，CHD组MLPH_CpG_2.7甲基化水平高于对照组。上述结果表明年龄、DNA甲基化与疾病之间可能存在复杂的联系，在评估DNA甲基化和CHD关联时应充分考虑年龄等多种因素的影响。CHD患病风险在两性间存在差异，可能与性激素、性染色体携带不同基因、表观遗传修饰等因素有关
［20］。本研究中，女性平均年龄为66岁，最低年龄为50岁，且对照组和CHD组女性平均年龄分别为64岁、68岁，最低年龄分别为55岁、50岁。据报道，亚洲妇女平均绝经年龄约为49周岁
［21］，鉴于病例组和对照组女性年龄均大于49周岁，故基本可以排除雌激素对这两个基因甲基化水平的影响。因此，我们推测
MLPH基因甲基化水平存在性别差异可能是性染色体上携带不同基因以及表观遗传修饰等因素共同作用所致。
当前心血管疾病的预防主要基于个体层面的风险预测，传统的临床预测指标 （如年龄、性别、血脂水平、血压等）存在灵敏度不高、早期预警性不足的问题
［22］。在Framingham队列中，以血清胆固醇水平260 mg/dL作为截断值，仍无法判别2/3的CHD患者
［23］。此外，有研究发现很大一部分CHD事件发生在中风险甚至被判定为低风险的个体中，这表明心血管风险评估的灵敏度较低
［24］。目前全基因组关联研究（GWAS）已发现超过150个与CHD风险相关的单核苷酸多态性 （SNPs），这些SNPs主要位于与脂质代谢、炎症、转录调节、细胞增殖、NO信号传导和血管重构相关的基因上
［25］。然而，GWAS研究中发现的变异只解释了不到10%的遗传度，表明CHD的“缺失遗传度”有待进一步研究
［26-28］。
DNA甲基化是环境相关和生活方式相关疾病的重要生物标志物，如高血压、糖尿病和脂质代谢等
［29-31］。近年来，很多研究表明DNA甲基化广泛参与了CHD的发生发展机制
［32-35］。但是目前在中国人群中关于DNA甲基化与CHD的研究还比较少。因此，探索外周血DNA甲基化水平变化与CHD的相关性有助于阐明其发病机制，提高CHD风险预测的能力。本研究使用的MALDI-TOF MS技术是一种可靠高效的DNA甲基化定量分析法，基因甲基化水平能够以百分比的形式表示，检测具有高灵敏度、高准确性和高重复性
［36］。
综上，本研究发现外周血
MLPH基因部分位点在MI亚型CHD患者、年龄<65岁群体和男性群体中显示出差异。本研究也存在一些不足：两组之间的吸烟情况、高血压状态等基线资料存在一定差异，同时样本量较小、环境因素收集不够全面。未来需要在多中心大样本人群以及前瞻性队列中收集更多数据来验证和拓展本研究的结果。除了Agha等
［6］发现血液中
MLPH （cg06639874）和
TSSC1（cg23245316）高甲基化与CHD发生风险降低相关，我们尚未看到关于这两个基因与心血管疾病的其他研究报道。由于缺乏新鲜样本，本研究也很遗憾未能进行基因表达和蛋白质水平的研究，因而难以评估DNA甲基化改变的下游事件。探索这两个基因的甲基化与基因表达，乃至生物学机制研究也是未来可能的研究方向。
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