基于PCR-CRSIPR/Cas12a的DNMT3A R882H/C可视化检测方法

摘要

目的 开发一种基于聚合酶链式反应(PCR)和成簇的规律间隔短回文重复序列(CRISPR)及其相关蛋白(Cas12a)系统的DNMT3A R882H(c.2645G>A)/C(c.2644C>T)可视化检测系统。方法 选取2023年9月～2024年9月于烟台毓璜顶医院收集的34例疑似急性髓系白血病患者的骨髓样本。针对DNMT3A R882H/C突变位点序列,首先设计PCR-Cas12a核酸检测系统所需的特异性扩增引物和CRISPR RNA(crRNA)。通过琼脂糖凝胶电泳筛选出扩增性能较好的引物对,并利用Cas12a蛋白切割邻近荧光探针产生的荧光强度,基于突变型和野生型信号的差异筛选出切割效果最好的crRNA,构建PCR-Cas12a核酸检测系统。随后将野生型人基因组DNA和DNMT3A R882H/C突变质粒按不同比例混合,模拟不同突变率,评价PCR-Cas12a的最低检测限。最后,使用PCR-Cas12a检测已通过高通量测序技术验证DNMT3A R882H/C突变率的临床样本,评估方法学的一致性和抗干扰能力。结果 本研究建立的PCR-Cas12a核酸可视化检测系统,能够有效检出突变率为1%的DNMT3A R882H/C临床样本。结论 本研究结合PCR与CRISPR-Cas12a技术,建立了一种检测DNMT3A R882H/C突变位点的可视化方法,具有快速以及特异度、敏感度高的特点,为急性髓系白血病的预后评估提供有力支持。

关键词

CRISPR/Cas12a / DNMT3A R882H / DNMT3A R882C / 急性髓系白血病 / 可视化检测