野生贝壳状革耳的生物学特性及驯化栽培

Biological Characteristics and Domestic Cultivation of Panus conchatus

摘要

对采自西藏农牧学院校园柳树上的一株野生食用菌进行分离，编号为PC01。根据形态学特征和ITS序列聚类分析鉴定为贝壳状革耳（Panus conchatus）。为了充分开发和利用该种食用菌资源，对该种的生物学特性和驯化栽培进行了研究。结果表明：贝壳状革耳菌丝生长最佳碳源为麦芽糖，最佳氮源为酵母膏，最适pH为5.0，最适温度为25 ℃，最佳无机盐为K₂HPO₄。正交试验表明，贝壳状革耳菌丝生长的最佳配方为：为麦芽糖20.0 g·L^-1，酵母膏3.0 g·L^-1，pH为6.0，磷酸二氢钾2.5 g·L^-1。驯化结果表明，以棉籽壳为主要栽培料可获得子实体，而以木屑为栽培主料可使贝壳状革耳菌丝在 30 d 左右满瓶，但无法获得子实体。

Abstract

A wild edible mushroom strain PC01 was isolated from willow trees on the campus of Tibet Agricultural and Animal Husbandry University. Based on morphological features and ITS sequence clustering analysis, it was identified as a shell like fungus (Panus conchatus). In order to fully develop and utilize the edible mushroom resources, the biological characteristics and domestication cultivation of this species were studied. The results showed that the optimal carbon source for the growth of shell like fungus hyphae was maltose, and the optimal nitrogen source was yeast extract with the optimal pH 5.0, the optimal temperature 25℃ and the optimal inorganic salt K₂HPO₄. The orthogonal experiment showed that the optimal formula for the growth of shell shaped fungus hyphae was maltose 20.0 g·L^-1, yeast extract 3.0 g·L^-1, pH 6.0, and potassium dihydrogen phosphate 2.5 g·L^-1. The domestication results showed that using cottonseed husks as the main cultivation material could obtain fruiting bodies, while using sawdust as the main cultivation material could make the shell like fungus hyphae fill the bottle in about 30 days, but did not obtain fruiting bodies.

Graphical abstract

关键词

贝壳状革耳 / 生物学特性 / 单因素 / 正交试验 / 驯化栽培

Key words

Panus conchatus / biological characteristics / single factor / orthogonal experiment / domestication cultivation

贝壳状革耳（Panus conchatus）是担子菌门（Basidiomycota）、担子菌纲（Basidiomycetes）、多孔菌目（Polyporals）、多孔菌科（Polyporaceae） 革耳属（Panus）真菌。又名紫革耳^[1-2]，李玉等^[3]、李泰辉等^[4]采用了贝壳状革耳（Panus conchatus）名称。该菌广泛分布于青海、河南、陕西、甘肃、江苏、吉林、安徽、浙江、湖南、广东、广西、海南、西藏和云南等地。群、叠生于混交林、阔叶林腐木。幼时可食，老时质味差，不宜食用。可药用，性温味淡，有追风散寒、舒筋活络之功效。为“舒筋丸”的原料配伍之一，治腰腿疼痛、手足麻木、筋络不适、四肢抽搐^[1-2]。试验抗癌，对小白鼠肉瘤 180 及艾氏癌的抑制率均高达100%。该菌能够产生杜松烷型倍半萜^[5]和麦角硫因^[6]，在抗炎、抗菌、抗衰老和预防各种疾病方面发挥着重要作用。同时，贝壳状革耳还是降解木素的优良白腐菌^[7]，产生的漆酶在毛皮染料废水脱色^[8]、木质素降解^[9]及生物漂白^[10]等方面具有巨大的潜力。至今为止，全世界革耳属报道约40多种，我国已报道了革耳属10多种^[4]。目前，革耳属的研究主要对巨大革耳（Lentinus giganteus）^[11,12]、巴西革耳（Lentinus striguellus）^[13]、新粗毛状革耳（Panus lecomtei）^[14]等进行了生物学特性及驯化栽培研究。关于贝壳状耳的生物学特性及驯化栽培方面，国内外尚未见报道。本研究对1株野生贝壳状革耳进行了分类鉴定、生物学特性及驯化栽培的深入研究，旨在为贝壳状革耳资源的开发利用提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 供试菌株

野生贝壳状革耳子实体采自西藏农牧学院校园柳树（纬度94°34′，经度29°67′，海拔高度为 3 100 m），将野生菌株子实体进行组织分离，编号为PC01，经PDA培养基纯化后置于4 ℃条件下保存备用。

1.1.2 供试培养基

PDA培养基：马铃薯块200 g、琼脂粉20 g、葡萄糖20 g，水1 000 mL，pH自然。用于野生贝壳状革耳菌种分离、菌丝活化和扩繁。

马铃薯综合培养基：马铃薯块 200 g，蛋白胨2 g，磷酸二氢钾 1 g，磷酸氢二钾0.5 g，硫酸镁 0.5 g，琼脂粉20 g，水1 000 mL，pH自然。用于测定贝壳状革耳的生物学特性。

原种配方：优质新鲜青稞65%，木屑15%，棉籽壳15%，麸皮2.5%，石膏1%，过磷酸钙0.5%，糖0.5%，尿素0.5%。

栽培种配方：（1）500 g/瓶，棉籽壳80%，麸皮18%，石膏1%，石灰1%，含水量65%，pH 7.0；（2）木屑77%，麸皮20%，磷酸氢二钾0.1%，石灰1%，石膏1%，麦芽糖1%，水65%，pH 7.0。

1.2 试验方法

1.2.1 形态学鉴定

对采集的贝壳状革耳子实体大小、菌盖形状、颜色、菌褶颜色、菌柄着生方式、质地、孢子印颜色、菌丝颜色等进行测量和记录^[15]。采用盖玻片插片法观察贝壳状革耳的菌丝形态。

1.2.2 分子生物学鉴定

采用CTAB法提取贝壳革耳菌株的DNA，以ITS1（5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′）和ITS4（5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′）通用引物进行PCR扩增，扩增后产物经凝胶电泳检测后送武汉天一辉远生物科技有限公司进行DNA测序，测定的结果在Gen Bank上，运用Blast进行同源性比对。下载相似性序列的ITS区域，用Clustalw进行多序列比对。用MEGA 11.0软件的N-J（Neihbor-Joining）法构建系统发育树^[16]。

1.2.3 单因素试验

1.2.3.1 碳源筛选

以无碳源马铃薯综合培养基为空白对照，分别添加20.0 g·L^-1麦芽糖、蔗糖、乳糖、果糖、木糖的培养基为试验组。采用微生物平板培养法，分别在5种培养基平板上接种，用直径8 mm的打孔器打孔取菌饼1个，菌丝面朝下接种至平板中央，置于25 ℃下恒温暗培养，用十字划线法测量菌落直径，每隔 24 h 测量1次，连续测量10 d，每个处理3次重复。按下式计算菌丝生长速率。

菌丝生长速率（V，cm·d^-1）的计算公式为：V=（d₁-d₀）/D

式中：V 为菌丝生长速率，d₁为最后一次测量时菌落的直径（cm）；d₀为第一次测量时菌落的直径（cm）；D为培养时间（d）。

1.2.3.2 氮源筛选

以无氮源马铃薯综合培养基为空白对照，分别以蛋白胨、酵母膏、牛肉膏、硝酸钾和尿素为供试氮源制作培养基为试验组。接种、培养以及测量方法同1.2.3.1。

1.2.3.3 pH筛选

以PDA培养基为试验培养基，利用1 mol/L 氢氧化钠和1 mol/L 盐酸，将灭菌后的PDA培养基的 pH调为4.0、5.0、6.0、7.0、8.0和9.0，每个处理 3次重复。接种、培养以及测量方法同1.2.3.1。

1.2.3.4 温度筛选

以PDA培养基为试验培养基，设置5个温度梯度，接种完成后分别置于15 ℃、18 ℃、20 ℃、25 ℃、30 ℃的恒温培养箱中进行黑暗培养。每个处理 3次重复。接种、培养以及测量方法同1.2.3.1。

1.2.3.5 无机盐筛选

以PDA培养基为空白对照，分别以氯化钠、磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、氯化钙为供试无机盐制作培养基为试验组。接种、培养以及测量方法同1.2.3.1。

1.2.4 正交试验

以碳源、氮源、pＨ、无机盐为因素，进行L₉（3⁴）4因子3水平正交试验（表1）。接种、培养以及测量方法同1.2.3.1。

1.2.5 驯化栽培

1.2.5.1 原种制作

选择新鲜优质青稞种子做原料。将青稞种子用水浸泡24 h，于锅中小火煮至无白心，切忌煮开花，沥干水分后捞出，用煮青稞种子水拌木屑、棉籽壳、麸皮，最后再一起与青稞粒拌匀。装料量为1/2罐头瓶，便于培养时摇动基料促进丝均匀生长。盖上中间有透气孔的盖子，于高压灭菌锅中126 ℃灭菌2 h，温度降到50 ℃左右将栽培瓶拿出，晃动敲打，使青稞疏松不粘连在一起，放至超净工作台中，冷却至30 ℃以下待接种，接入3块直径为1 cm的一级种菌块。当菌丝长满培养瓶即为原种。

1.2.5.2 栽培种制作

按照1.1.2的栽培种配方称料，将培养料各组分按照配比拌料均匀，使栽培料含水量在 65%左右，用手抓至渗水不滴水。混合好的栽培料装瓶，使瓶中培养料上紧下松，栽培瓶规格为500 mL。于高压灭菌锅中126 ℃灭菌2 h，待栽培瓶温度降至30 ℃左右，放置超净工作台里至室温接入原种，放入25 ℃恒温培养箱暗培养。待丝长满瓶口后，将出菇菌瓶转移至出菇房，在温度为18~20 ℃、空气相对湿度为90%左右打开瓶口进行培养。

1.2.6 数据处理

用Excel软件整理数据，用SPSS 26.0软件进行单因素方差分析。

2 结果与分析

2.1 形态学鉴定

由图1可知，贝壳状革耳子实体中等大，菌盖直径4~13 cm，形状扁平漏斗形至近圆，紫灰色至菱色，边缘内卷，呈波浪状（图1 A）。菌肉近白色，稍厚。菌褶近白色至淡紫色，延生，窄，稍密至较稀（图1B）。菌柄偏生或侧生，菌柄长为1~4 cm，粗0.5~2 cm，有淡紫色至淡灰色绒毛，质韧，内实。孢子印白色。孢子无色，光滑，椭圆形，5.4-6.7×2.8~3.5 µm，囊体无色，棒形，（30~40） um×（7~7.5） um。贝壳状革耳菌株纯化培养后约10 d长满培养基。在PDA培养基中菌落颜色为白色，浓密（图1 C）。菌丝无色，有隔，具有锁状联合，且有分枝（图1 D）。结合宏观形态特征和微观形态特征，参考资料《中国大型菌物资源图鉴》^[3]、《中国大型真菌原色图鉴》^[17]、《西藏大型经济真菌》^[18]和《湖南大型真菌志》^[19]等参考文献，初步鉴定为菌株PC01为贝壳状革耳。

2.2 分子生物学鉴定

将测序结果在NCBI中进行BLAST比对，利用MEGA 11.0软件构建的系统发育树（图2）。通过系统树可以看出，作者自测序列与P. conchatus 聚到一起，且支持率均超过99%，与形态学的鉴定结果一致。由此，结合形态学初步鉴定结果，将该菌株鉴定为贝壳状革耳（P.conchatus）。

2.2 单因素试验结果

2.2.1 碳源对贝壳状革耳菌丝生长的影响

由表2可知，供试5种碳源均可被贝壳状革耳所利用，不同碳源培养基中贝壳状革耳菌株的生长情况存在明显差异。从菌丝的生长速率和长势看，贝壳状革耳的菌丝以麦芽糖为碳源的培养基中生长最佳，生长速率为0.93 cm·d^-1，木糖次之，生长速率为0.91 cm·d^-1，乳糖最差，生长速率为0.31 cm·d^-1。贝壳状革耳菌株对5种碳源的偏好表现为：麦芽糖＞木糖＞果糖＞蔗糖＞乳糖。

2.2.2 氮源对贝壳状革耳菌丝生长的影响

由表3可知，供试6 种氮源中，从菌丝生长速率和长势看，贝壳状革耳的菌丝在以酵母膏为氮源的培养基中生长最佳，生长速率为1.16 cm·d^-1，硝酸钾次之，生长速率为0.91 cm·d^-1，而后依次是硝酸铵、蛋白胨，生长速率分别为0.78 cm·d^-1和0.71 cm·d^-1。在以添加尿素为氮源的培养基中不生长。贝壳状革耳菌株对6种氮源的偏好表现为：酵母膏＞硝酸钾＞牛肉膏＞硝酸铵＞蛋白胨＞尿素。

2.2.3 pH对贝壳状革耳菌丝生长的影响

由表4可知，不同pH培养基中贝壳状革耳的菌丝生长速度存在一定差异。贝壳状革耳在pH为5.0的培养基中菌丝生长最快，生长速率为0.86 cm·d^-1，其次为pH 7.0和pH 6.0，生长速率分别为0.71 cm·d^-1和0.70 cm·d^-1，pH为4.0时，菌丝长势生长最差。表明贝壳状革耳的菌丝更喜欢中性偏酸的环境，过酸过碱均不利于菌丝生长。贝壳状革耳对6种pH的偏好为：pH 5.0＞pH 7.0＞pH 6.0＞pH 8.0＞pH 9.0＞pH 4.0。

2.2.4 温度对贝壳状革耳菌丝生长的影响

通过对贝壳状革耳菌丝的温度试验，发现贝壳状革耳菌丝生长的温度广泛，菌丝在温度为15 ℃到30 ℃时都可以生长，15 ℃和30 ℃时生长较为缓慢，温度为25 ℃的培养基中菌丝生长速度最快，生在速率为1.32 cm·d^-1，其次为20 ℃和18 ℃，生长速率为1.20 cm·d^-1和0.90 cm·d^-1。贝壳状革耳对5种温度的偏好为：25 ℃＞20 ℃＞18 ℃＞15 ℃＞30 ℃。

2.2.5 无机盐对贝壳状革耳菌丝生长的影响

由表6可知，供试的4种无机盐均可促进贝壳状革耳菌丝的生长，和对照相比差异显著（P<0.05）。贝壳状革耳的菌丝添加磷酸二氢钾的培养基中生长最佳，生长速率为0.86 cm·d^-1，其次为氯化钙和氯化钠，生长速率分别为0.78 cm·d^-1和0.75 cm·d^-1，添加磷酸氢二钾菌丝生长速率最慢。贝壳状革耳菌株对4种无机盐的偏好表现为：磷酸二氢钾＞氯化钙＞氯化钠＞磷酸氢二钾。

2.3 正交实验结果

挑选影响较大的碳源、氮源、无机盐和pH 4个因素，通过4因素3水平的正交分析表直观分析（表7）可见，无机盐碳源的极差最大，R=0.16，其次是碳源、氮源和pH。综合考虑菌丝长势和生长速率，确定了贝壳状革耳菌丝生长最优配方为A1B3C2D3。即麦芽糖为20.0 g·L^-1，酵母膏为3.0 g·L^-1，pH为6.0，磷酸二氢钾2.5 g·L^-1。

2.4 驯化栽培结果

试验结果表明，贝壳状革耳菌丝在青稞种子原种培养基中菌丝呈绒毛状且浓密洁白，15 d 左右可满瓶。菌丝在棉籽壳和木屑栽培配方中均能生长，发菌温度为25 ℃，满瓶时间大约30 d。但只有以棉籽壳为培养料时才能形成子实体（图 3）。以木屑为培养料时30 d左右菌丝可以满瓶，但菌丝较稀疏，始终无法形成子实体。与野生子实体（图 1）相比，人工驯化的子实体（图 3）形态特征与野生种明显不同，菌盖呈漏斗形，颜色深，为红紫色，菌盖直径变小，菌柄长。

3 结论

以采自西藏农牧学院校园柳树上的野生贝壳状革耳子实体为对象，通过形态学鉴定及系统发育分析，确定此野生菌株为贝壳状革耳。通过单因素试验试验，确定了贝壳状革耳菌丝体的最佳生长条件为：最适碳源为麦芽糖，最适氮源为酵母膏，最适pH为5.0，最适无机盐为磷酸二氢钾，最适温度为25 ℃。正交试验表明贝壳状革耳菌丝生长的最佳配方为：为麦芽糖20.0 g·L^-1，酵母膏3.0 g·L^-1，pH为6.0，磷酸二氢钾2.5 g·L^-1。以棉籽壳为栽培主料可获得贝壳状革耳子实体。

4 讨论

贝壳状革耳菌丝生长最适碳源为麦芽糖，与孟思灵^[20]等研究的革耳属的真菌野生大革耳有所不同，野生大革耳最适碳源为蔗糖，究其原因可能是由于菌丝体在发育过程中的需求是不同的，所以不同菌种的生理特性和培养特性是不同的。贝壳状革耳最适氮源为酵母膏，与野生大革耳一致。贝壳状革耳菌丝最适pH为5，最适温度为25 ℃，这与常堃等研究的新粗毛状革耳菌丝最适生长温度一致^[14]。贝壳状革耳的氮源单因素试验表明，空白对照培养基中菌丝生长速度最快，分析原因可能贝壳状革耳是高碳低氮需求的食用菌，基础培养基有马铃薯提取汁，存在少量复合氮源，满足了菌丝需求，该结果和脆木耳、絮缘蘑菇菌丝发育相似，脆木耳氮源筛选实验仅见牛肉粉高于空白，且差异不显著^[21]。不同的蘑菇营养需求都不同，丁香蘑菇不加氮源则会停止生长^[22]。

贝壳状革耳在棉籽壳为主料培养基中能形成子实体，出菇过程中应将环境湿度控制在85%～90%，如果湿度低于65%，子实体极易失水硬化。与野生贝壳状革耳子实本相比，人工裁培贝壳状革耳具有子实体柄长、子实体色深以及子实体整体变小等性状，这与裁培过程中光照、温度和湿度等环境因素有关^[14]。贝壳状革耳的驯化尚停留在实验室阶段，栽培配方、催蕾模式、出菇稳定性等方面仍需进一步进行研究。

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基金资助

国家自然科学基金地区基金(31560001)

西藏自治区重点科技项目(XZ202001ZY0019N)