一株野生白黄卷毛菇FAHZ03的分离鉴定及其生物学特性研究

Isolation, Identification and Biological Characteristics of a Wild Floccularia albolanaripes FAHZ03

摘要

从西藏农牧学院校园内采集到一株野生蘑菇，通过形态学特征初步将该菌株鉴定为白黄卷毛菇Floccularia albolanaripes。为了使该菌种得到更好的开发和利用，对其进行了生物学特性研究。采用平板培养法，分析了不同营养因子对该菌株菌丝生长的影响，结果表明：该菌株菌丝生长最适碳源为淀粉；最适氮源为酵母膏；最适温度为25 ℃；最适pH为5.0。

Abstract

A wild mushroom strain was collected from the campus of Tibet Agricultural and Animal Husbandry University, and the strain was initially identified as Floccularia albolanaripes by morphological identification. In order to make better exploitation and use of this strain, the biological characteristics of the strain were studied,and the effect of different nutritional factors on the mycelium of the strain was analyzed by plate culture method. The results showed that the most suitable carbon source for mycelium growth was starch, and the most suitable nitrogen source was yeast extract, but the optimum temperature was 25 ℃, and the optimum pH was pH 5.0.

Graphical abstract

关键词

白黄卷毛菇 / 分离 / 鉴定 / 生物学特性

Key words

Floccularia albolanaripe / isolation / morphology / biological properties

卷毛菇属Floccularia属于担子菌门Basidiomycota、伞菌纲Agaricomycetes、伞菌目 Agaricales 、伞菌科 Agaricaceae ^[1,2]。该属分布于亚洲、欧洲及北美等地区，分布于我国西藏、青海和四川等地，该属真菌生于林地、草原或高山草甸。目前，全球共记录卷毛菇属8种：即Floccularia albolanaripes、Floccularia decorosa、Floccularia fusca、Floccularia luteovirens、Floccularia pitkinensis、Floccularia rickenii、Floccularia straminea、Floccularia subcaligata，在中国报道的有2个种，即白黄卷毛菇F. albolanaripesh和黄绿卷毛菇F. luteovirens。

根据rDNA-ITS 序列系统发育分析发现，黄绿卷毛菇F. luteovirens与白黄卷毛菇F. albolanaripesh最为接近^[3]。黄绿卷毛菇F. luteovirens是一种珍稀的食药用菌^[4]，具有重要的经济价值^[5]和生态功能。黄绿卷毛菇F. luteovirens能够与牧草共生形成菌根菌，可以促进牧草的生长和发育^[6]，含有人体所需18种氨基酸，多种维生素^[7]和多糖成分，还具有多种药理活性：抗肿瘤、免疫调节、抗氧化等^[4]。目前对黄绿卷毛菇F. luteovirens的研究较多^[6]。白黄卷毛菇F. albolanaripesh夏秋季群生于针阔混交的林地上，可形成蘑菇圈，分布于西藏东南部，秦岭西部及北京西北林区等地，可食用^[8]。目前关于白黄卷毛菇F. albolanaripesh的生物学特性研究还未见报道，为了更科学地对白黄卷毛菇F. albolanaripesh进行开发利用，同时也为白黄卷毛菇F. albolanaripesh的物种保护提供基础性资料，为此，笔者从西藏农牧学院校园草坪上采集到1株白黄卷毛菇子实体，采用组织分离法获得其菌丝体，通过形态特征对其进行鉴定^[8-9]，探讨了不同营养因子对该菌株菌丝生长影响，以期为该菌种的开发利用奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 供试菌株

供试菌株子实体采自西藏农牧学院校园草坪（N:94°34′，E:29°67′，海拔3 100 m），现保存于西藏农牧学院大型真菌标本馆。

1.1.2 供试培养基

母种分离培养基采用PDA 培养基^[10]：马铃薯块200 g（去皮切片煮汁），葡萄糖 20 g，琼脂粉20 g，水1 000 mL，pH 6.5。

碳源、氮源测定培养基采用马铃薯综合培养基^[10]：马铃薯块 200 g（去皮切片煮汁），葡萄糖20 g，蛋白胨2 g，磷酸二氢钾 1 g、磷酸氢二钾0.5 g、硫酸镁 0.5 g、琼脂粉20 g，水1 000 mL，pH自然。

温度和pH测定培养基：采用PDA 培养基（同母种分离培养基）。

1.2 试验方法

1.2.1 菌种分离

采用组织分离法^[11,12]进行菌种分离，在超净工作台内将采集到的白黄卷毛菇实体用75 %的酒精将表面进行消毒，将子实体撕开，用解剖刀取柄、盖交界处黄豆粒大小的组织置于PDA平板上，25 ℃恒温培养箱中进行暗培养，菌丝进行多次转接，得到纯培养物（编号FAHZ03）。

1.2.2 形态学鉴定

对采集到的新鲜标本用解剖刀纵切子实体观察其菌盖形状和颜色、菌肉颜色和质地，菌褶形状和着生情况，菌柄着生方式和质地、中实或中空等特征；采用徒手切片的方法，在光学和扫描电镜下观察其分生孢子、担孢子和菌褶等形态特征，参照《中国大型菌物资源图鉴》^[9]进行传统的形态学鉴定。

1.2.4 菌丝体生物学特性研究

1.2.4.1 不同碳源对菌丝生长的影响

以无碳源的马铃薯综合培养基（1.1.2）为空白对照，分别设置7种碳源（葡萄糖、果糖、蔗糖、麦芽糖、乳糖、木糖、淀粉）作为处理组，浓度均为20 g/L。用直径为8 mm打孔器从菌种培养基同一半径处打孔取菌块，有菌丝面朝下接种在8种培养基上，25 ℃恒温培养，当有一个处理菌丝长满时，停止实验，十字交叉法测量菌丝生长直径，每处理 5个重复。按公式得：菌丝生长速度（mm/d）=（最后一次测量菌落直径–第一次测量菌落直径）/培养时间。

1.2.4.2 不同氮源对菌丝生长的影响

以无氮源马铃薯综合培养基（1.1.2）为空白对照，分别设置7种氮源（蛋白胨、酵母浸粉、尿素、 硝酸钠、硫酸铵、牛肉膏、酵母膏）作为处理组，浓度均为20 g/L。其他操作同碳源影响试验。

1.2.4.3 温度试验

设置5个温度梯度（15 ℃、20 ℃、25 ℃、30 ℃、35 ℃），其他操作同碳源影响试验。

1.2.4.4 不同pH对菌丝生长的影响

设置6个pH梯度（4、5、6、7、8、9），其他操作同碳源影响试验。

1.2.6 数据处理

采用DPS软件对所得数据进行Duncan新复极差法进行方差分析。同列内不同小写字母和大写字母分别代表差异显著（P<0.05）和差异极显著（P<0.01）。

2 结果与分析

2.1 形态学鉴定

2.1.1 子实体形态特征

野生担子果生于草地上，子实体中等至稍大，菌盖直径2.7~6.5 cm，初期呈半球形，后期为扁平状，黄色至鲜黄色，边缘一周为白色，中央有明显的褐色突起，表面稍干，其菌盖与菌柄都被有淡褐色的小鳞片。菌肉带有黄色，伤后不变色。菌褶弯生，有菌环，较宽，密，不等长，初期为米白色而后期为淡黄色。菌柄为圆柱形，长为4.5~8 cm，直径0.5~1 cm，内实，顶端靠近菌盖处为白色且光滑，中部及下部为米色至淡黄色并且具有黄色反卷的鳞片（图1-A）。担孢子5.8~7.3×3.8~4.9 µm，光滑、无色，椭圆形，非淀粉质^[9]。无囊状体。与亲缘关系最近的黄绿卷蘑菇F. luteovirens相比，菌株FAHZ03的子实体较小，菌肉偏薄，菌盖颜色偏深，菌盖上的鳞片偏小，孢子不具有小麻点且为非淀粉质。这些形态特征符合《中国大型菌物资源图鉴》^[9]中有关白黄卷毛菇的描述，将该菌株初步鉴定为白黄卷毛菇。

2.1.2 菌株营养菌丝的形态特征

在PDA平板中培养的菌落呈米白色，棉絮状，菌丝多、密且均匀（图1-B）。菌丝体2 d开始扩展。分生孢子2~2.74×4~4.52 µm，椭圆形。在扫描电镜下，菌丝细胞壁较薄，有明显隔膜，无色透明，分枝均匀，菌丝直径2.42~3.42 μm（图1-C）。

2.3 菌丝体生物学特性

2.3.1 不同碳源对菌株FAHZ03菌丝生长速度的影响

不同碳源对菌株FAHZ03菌丝生长速率的影响见表1和图2，菌株FAHZ03在供试7种碳源中均能生长，菌丝生长速率最快的是淀粉，生长速率为4.87 mm/d，菌丝生长速率大于其他碳源，且菌丝洁白浓密、长势旺盛、密生绒毛；其次是木糖、果糖和麦芽糖，菌丝生长速率分别为4.80 mm/d、4.55 mm/d和4.27 mm/d，菌丝偏黄，边缘菌丝呈现轮纹状；菌丝生长速率较差的是蔗糖、葡萄糖以及对照组，菌丝的生长速率分别为4.12 mm/d、4.07 mm/d 和4.03 mm/d；菌丝生长速率最差的是乳糖，菌丝生长速率为2.90 mm/d。综合考虑菌丝生长速度、长势及数据的方差分析，菌株FAHZ03菌丝生长最适宜的碳源是淀粉。

2.3.2 不同氮源对菌株FAHZ03菌丝生长速度的影响

不同氮源对菌株FAHZ03菌丝生长速率的影响见表2和图3，菌株FAHZ03在供试7种氮源中均能生长，有机氮源较无机氮源对菌丝生长更有利，其中以麦芽浸粉为氮源时菌丝生长速率最快，菌丝生长速率达5.03 mm/d，但菌丝生长不均匀、薄呈轮纹状；其次为酵母膏和对照组，菌丝生长速率分别达4.57 mm/d和4.52 mm/d，酵母膏菌丝比对照组菌丝更浓密粗壮；硝酸钠、牛肉膏和蛋白胨作为氮源时，菌丝生长速率分别为4.37 mm/d、4.32 mm/d和3.38 mm/d，菌丝生长较慢，但菌丝生长均匀粗壮；菌丝生长速率较差的是尿素和硫酸铵，菌丝生长速率分别为2.45 mm/d和2.07 mm/d。综合考虑菌丝生长速度、长势及数据的方差分析，菌株FAHZ03菌丝生长最适宜的氮源是酵母膏。

2.3.3 不同温度对菌株FAHZ03菌丝生长速度的影响

设置5个不同的温度梯度15 ℃、20 ℃、25 ℃、30 ℃和35 ℃对菌株FAHZ03菌丝生长速率的影响见表3和图4，除在35 ℃条件下菌株FAHZ03菌丝不能生长，在其它温度条件下菌丝均可生长。其中以25 ℃时菌丝生长速率最快，菌丝生长速率达6.13 mm/d且菌丝生长洁白粗壮，其次为15 ℃和20 ℃，菌丝生长速率分别达6.05 mm/d和5.60 mm/d，30 ℃时，菌丝生长缓慢几乎不生长，菌丝生长速率为1.23 mm/d。综合考虑菌丝生长速度、长势及数据的方差分析，25 ℃更适宜菌株FAHZ03菌丝的生长。

2.3.4 不同pH对菌株FAHZ03菌丝生长速度的影响

设置6个不同的pH梯度pH 4.0 、pH 5.0、pH 6.0、pH 7.0、pH 8.0和pH 9.0对菌株FAHZ03菌丝生长速率的影响见表4和图5，菌株FAHZ03在6不同pH梯度下均能生长。其中pH 5.0和pH 6.0时菌丝生长速率最快，菌丝生长速率分别达6.15 mm/d和6.10 mm/d，且菌丝洁白粗壮、生长均匀、密生绒毛。随着pH偏碱性菌丝的生长速率呈下降趋势，当pH为pH 7.0和pH 8.0，菌丝生长速率分别达4.93 mm/d和4.57 mm/d，在pH 9.0时，菌丝生长较慢，菌丝生长速率为4.35 mm/d。综合考虑菌丝生长速度、长势及数据的方差分析，pH 5.0更适宜菌株FAHZ03菌丝的生长。

3 讨论

生物学特性实验结果表明，白黄卷毛菇菌株(FAHZ03)在不同供试碳源条件下生长适应性较好，并且以淀粉条件下菌丝生长最好，这与刘西周^[6]等黄绿蜜环菌的研究进展中的研究结果一致，朱锦福^[13]等研究发现黄绿卷毛菇菌丝生长最适宜的碳源为红糖，蔡萧^[14]等发现黄绿卷毛菇最适宜生长的碳源为蔗糖。在氮源方面，以麦芽浸粉和酵母膏为氮源添加的培养基中白黄卷毛菇菌丝生长较好，而以尿素和硫酸铵为氮源时生长较差，说明白黄卷毛菇菌株对有机氮源的利用率明显高于无机氮源，这可能是由于有机氮含有更多营养元素，如微量元素、维生素等，可以促进菌丝生长^[15]与朱锦福^[13]等所研究的结果一致，蔡萧等^[14]发现黄绿卷毛菇最适宜生长的氮源为蛋白胨。温度单因素筛选试验显示，白黄卷毛菇固体培养最适温度为25 ℃，中低温条件更适合白黄卷毛菇菌丝的生长。在pH试验中，白黄卷毛菇菌丝体表现出具有较广泛的酸碱环境适应性，但白黄卷毛菇菌丝体更适应在pH 5~6下生长，这与刘西周^[6]等黄绿蜜环菌的研究进展中的研究结果具有一致性。

4 结论

通过形态学鉴定，将菌株FAHZ03鉴定为白黄卷毛菇（F. albolanaripesh）。单因素试验结果表明：菌株FAHZ03菌丝最适生长碳源为淀粉；最适生长氮源为酵母膏；最适温度为25 ℃；最适pH为pH 5.0。

该真菌收录于生态环境部中国科学院发布的《中国生物多样性红色名录-大型真菌卷》名录中，并且被评估为LC等级。本研究对白黄卷毛菇菌株(FAHZ03)只进行了生物学特性的研究，其营养成分、驯化栽培、药理功效、物种保护和生态功能利用方面要做进一步的研究，本试验对后续白黄卷毛菇的开发研究和可持续利用提供了可能。

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基金资助

西藏自治区重点科技项目(XZ202001ZY0019N)

西藏农牧学院研究生创新计划项目(YJS2022-45)