西藏地区牦牛乳源链球菌的分离鉴定及毒力基因检测

Isolation, Identification and Virulence Gene Detection of Milk-derived Streptococcus from Yaks in Tibet

摘要

本次试验采集西藏三个地市牦牛奶样共150份，通过分离鉴定得到110株链球菌。对所得菌株进行血清分群鉴定，发现B群链球菌最多，占比达24.5%，其次为D、C、G群链球菌，占比分别为16.4%、9.1%、2.7%，B群和D群有交叉反应，仅占0.9%，其他菌株未得结果。经毒力基因检测显示：山南市毒力基因lmb检出率最高为8.70%；林芝市glnA检出率最高为22.72%；阿里地区cfb检出率最高为50.0%。综合各地市毒力基因检出率均有不同，但bca、hylB、scpB基因的检出率均为0%。此外，共发现5种毒力基因组合，以lmb+glnA基因组合最多（41.03%），cyl+glnA+cfb、lmb+cyl+bac、lmb+cyl+cfb、lmb+cyl+cfb+bac次之，检出率分别为25.64%、15.38%、10.26%、7.69%。本次试验旨在为后续西藏乳源链球菌的流行病学研究提供基础数据支撑。

Abstract

In this study, a total of 150 yak milk samples were collected from three cities in Tibet., and through isolation and identification, 110 strains of streptococcus were obtained. Serum grouping revealed that Group B streptococcus was the most prevalent, accounting for 24.5% of the strains. This was followed by Group D, C, and G streptococcus, with proportions of 16.4%, 9.1%, and 2.7%, respectively. Cross-reaction was observed between Group B and Group D streptococcus, constituting only 0.9% of the isolates. Results from virulence gene detection indicated that the highest detection rate of the lmb gene was 8.70% in Shannan City, while the highest detection rate of the glnA gene was 22.72% in Nyingchi City. In the Ali region, the cfb gene had the highest detection rate at 50.0%. The overall detection rates of virulence genes varied across different cities, but no detection was observed for the bca, hylB, and scpB genes. Furthermore, five different combinations of virulence genes were identified, with the lmb+glnA gene combination being the most prevalent (41.03%). The other combinations included cyl+glnA+cfb, lmb+cyl+cfb, lmb+cyl+cfb+bac, with detection rates of 25.64%, 15.38%, 10.26%, and 7.69%, respectively. This study aimed to provide foundational data support for future epidemiological research on streptococcus in Tibetan milk sources.

Graphical abstract

关键词

牦牛 / 链球菌 / 分离鉴定 / 毒力基因

Key words

yak / streptococcus / separation and identification / virulence gene detection

牦牛作为青藏高原特色畜种，一般生活在高寒草原等地方，对极寒环境适应性较好，能承受-35 ℃左右的严寒。西藏自治区作为我国牦牛分布最广的地区，约占全国总数的十分之三^[1]，在那曲、山南、阿里、昌都、日喀则、拉萨、林芝七个地市中，牦牛分布最广的是那曲市，约占西藏牦牛总数的36.5％^[2]。牦牛除具有食用价值的牦牛肉外，奶、皮毛、牦牛粪等都是当地牧民不可或缺的生活用品，是青藏高原重要的经济来源。

链球菌是一类常见的化脓性球菌，其生物学性状呈球形或卵圆形，大多数为链状排列，对培养基的选择要求相对较高，普通培养基需加入血液、血清、葡萄糖等才能生长。链球菌属于革兰氏阳性菌，是一种胃肠道共生体^[3]，广泛存在于自然界和动物的上呼吸道、胃肠道等中，可导致许多疾病，如瘤胃酸中毒、腹胀、脑膜炎、细菌性肺炎、丹毒、败血症^[4-5]及乳房炎，目前已有报道表示，链球菌是引起奶牛乳房炎最主要的病原菌之一^[6]，此外，牛链球菌是一种常见的心内膜炎病因，结肠直肠癌的高发病率也与此有关^[7]。

本次试验通过对西藏山南市、林芝市、阿里地区的牦牛乳源样本进行链球菌的分离鉴定，旨在掌握其流行特点，此外，对其毒力特性的研究为后续西藏乳源链球菌相关疾病的防控治疗提供基础数据支撑。

1 材料与方法

1.1 样品

采集来自西藏山南市、林芝市、阿里地区乳源样品各50份。

1.2 主要试剂

哥伦比亚血琼脂基础培养基和革兰氏染色试剂盒购自青岛高科园海博生物技术有限公司；TSB培养基、Solarbio优质胎牛血清、脱纤维绵羊血购自北京索莱宝生物科技有限公司；引物购自上海生工生物工程股份有限公司。

1.3 细菌的分离

纯化取采集的乳样于增菌袋和含有5%胎牛血清的TSB培养液1:5充分混匀，放置37 ℃恒温培养箱培养24 h。灭菌接种环蘸取液体于加有脱纤维绵羊血的哥伦比亚血琼脂培养基上划线接种，同样置于37 ℃恒温箱培养过夜。挑取具有β溶血环的疑似链球菌菌落重复划线于哥伦比亚血琼脂培养基上，置于37 ℃恒温培养箱培养24 h。挑取单菌落进行革兰氏染色，于光学显微镜下观察。

1.4 生化试验

将分离纯化后的疑似菌落重新接种于TSB培养液中培养24 h，然后吸取20 μL置于葡萄糖、果糖、蔗糖、麦芽糖、淀粉、乳糖、棉籽糖、甘露醇、硫化氢、山梨醇8种细菌微量生化反应管中，37 ℃恒温过夜培养，观察结果。

1.5 PCR鉴定检测

1.5.1 DNA提取

参照煮沸裂解法提取DNA，取1 000 μL含有分离菌株的液体于离心管，12 000 r/min离心5 min，弃上清，加入200 uLddH₂O进行吹打洗涤，12 000 r/min离心5 min，弃上清，加入50 uLddH₂O于100 ℃沸水中煮13～15 min，迅速放入-20 ℃冰箱冷却1 min左右，再次12 000 r/min离心5 min，作为PCR反应模板进行扩增。

1.5.2 PCR扩增

引物合成来自于参考文献中相关设计^[8]，设计链球菌的16S rRNA通用鉴定引物和特异性引物，引物序列及条件见表1。反应体系如表2。PCR反应条件：94 ℃预变性5 min，94 ℃变性30 s，退火温度（见表1）30 s，72延伸1 min，共35个循环，72 ℃终延伸10 min，4 ℃保存。PCR扩增产物经1%凝胶电泳检测。将产物送上海生工生物工程有限公司进行序列测定。

1.5 分型

运用PathoDX™ 链球菌分型试剂盒对110株链球菌进行分型。取分离鉴定所得链球菌株与试剂盒的A-G的乳胶凝集诊断试剂作凝集试验，具体步骤按照说明书进行，并设空白对照。

1.6 毒力基因检测

参考已发表的文献^[9]，设计8对毒力基因引物，由上海生工生物工程有限公司合成（见表3）。PCR反应体系如表2；PCR反应条件：95 ℃预变性5 min，95 ℃变性30 s，退火温度（见表3）30 s，72 ℃延伸45 s，共35个循环，72 ℃终延伸10 min，4 ℃保存。PCR扩增产物经1%凝胶电泳检测。

2 结果

2.1 分离鉴定从150份乳样中分离得到110株链球菌，分离率为73.3%。观察分离菌株形态学特征，在哥伦比亚血琼脂培养基上出现表面光滑，菌落周围有明显的β溶血环。菌株革兰氏染色镜检结果呈现蓝紫色的革兰氏阳性小球菌，均符合链球菌形态学特征，结果如图1所示。

2.2 生化鉴定

结果显示：分离菌株对葡萄糖、果糖、蔗糖、麦芽糖、淀粉、乳糖、棉籽糖、甘露醇表现为阳性；对硫化氢、山梨醇表现为阴性，结果详见表4。

2.3 PCR检测

琼脂糖凝胶电泳检测结果显示，分离所得菌株16S rRNA基因片段大小约为1 500 bp，链球菌特异性基因大小约为571 bp，均与预期目的条带大小一致，而后将PCR产物送至上海生工生物工程有限公司测序，将其结果于NCBI上在线比对，发现分离菌与链球菌的相似度高于97%。结果详见图2、图3。

2.4 分型结果

分型结果见表5。

2.5 毒力基因检测

结果显示山南市毒力基因lmb检出率最高为8.70%，cyl次之，检出率为4.35%，而bca、bac、glnA、cfb、scpB、hylB均为阴性，结果如图4所示；林芝市glnA检出率最高为22.72%，cfb、bac、lmb检出率次之，分别为20.45%、13.64%、4.55%，cyl、scpB、bca、hylB均表现为阴性，结果如图5所示；阿里地区cfb检出率最高为50.0%，glnA、lmb、cyl、bac次之，检出率分别为45.0%、40.0%、35.0%、25.0%，bca、hylB、scpB均表现为阴性，结果如图6所示。综合各地8种毒力基因的表达情况，发现各地市检出率最高毒力基因均有不同，但bca、hylB、scpB基因在各地得检出率均为0%。此外，共发现5种毒力基因组合，以lmb+glnA基因组合最多（41.03%），cyl+glnA+cfb、lmb+cyl+bac、lmb+cyl+cfb、lmb+cyl+cfb+bac次之，检出率分别为25.64%、15.38%、10.26%、7.69%，结果如图7所示。

3 讨论与分析

病原体的传染性与细胞表面成分或其分泌的毒力因子有关。链球菌可携带多种与其致病力和持续感染相关的毒力因子，除了M/M样蛋白、荚膜多糖、脂磷壁酸、致热外毒素、链激酶及链道酶是重要的致病因子外^[10-11]，侵袭因子通常也可使链球菌破坏细胞的免疫屏障，进而侵入机体，主要包括透明质酸酶、溶血色素和溶血促进因子等。这些毒力因子（Virulent factor）是病原具有毒力的重要成分，是由毒素和侵袭力构成。据研究，细菌已经进化出各方面适应宿主环境的条件，包括生物膜形成、逃避宿主免疫反应等^[12]。如研究表明，无乳链球菌的毒力因子主要包括定植、侵袭、生物被膜形成和免疫逃避等多个方面的功能^[13]。

本次试验通过对西藏地区乳源链球菌分离得到110株链球菌，分离率为73.3 %，与张兴民^[14]等对四川阿坝州牦牛源牛链球菌的分离率68.9%、马博^[15]等对新疆石河子地区某规模奶牛场奶牛乳房炎链球菌的分离率33.33%相较均高，可能与样品来源或地域不同有一定联系。链球菌按细胞壁中多糖抗原不同可分为A、B、C、D、F、G等18族，同一族根据表面蛋白抗原又分为多个型。本次试验对所得菌株进行血清学分群研究，发现B群链球菌株最多，血清型占比为24.5%，其次为D、C、G群，血清型占比分别为16.4%、9.1%、2.7%，1株B群和D群有交叉反应，占0.9%，其他菌株未得结果，与欧阳素贞^[16]等对羊源链球菌的分群鉴定及多价灭活苗的研制中，C群35%，D群40%，E群10%结果相比较低。此外，张梓英^[17]对豫南地区猪链球菌兰氏分群研究发现，兰氏C群、D群分别占75%、15%，C群相较本次实验结果较高，造成以上差异的原因可能是动物类别或地域不同。

经毒力基因检测，发现山南市毒力基因lmb检出率最高为8.70%，cyl次之，检出率为4.35%，而bca、bac、glnA、cfb、scpB、hylB均为阴性，与赵琳珊等^[18]对四环素耐药无乳链球菌生物膜形成特点研究、杜琳等对^[19]华北地区牛源无乳链球菌的分离鉴定及生物学特性中bac基因未检测到的结果相一致。林芝市glnA检出率最高为22.72%，cfb、bac、lmb检出率次之，分别为20.45%、13.64%、4.55%，cyl、scpB、bca、hylB均表现为阴性。阿里地区cfb检出率最高为50.0%，与丁月霞^[20]对内蒙古地区奶牛乳房炎链球菌毒力基因检测及耐药性研究结果相一致，但glnA、lmb、cyl、bac、bca、hylB、scpB基因的表达均有差异，而cfb检出率与刘凯等^[21]对奶牛乳房炎性无乳链球菌药敏试验及毒力基因检测中报道的99.4%相比较低。此外，陈杰等^[22]对新疆部分地区牛源无乳链球菌的主要毒力基因和耐药基因进行检测，发现147份乳样中cfb、hylB、cylE基因检出率100%，均高于本次试验检测结果。综合各地8种毒力基因的表达情况，发现各地市检出率最高毒力基因均有不同，但bca、hylB、scpB基因在各地得检出率均为0%。此外，共发现5种毒力基因组合，以lmb+glnA基因组合最多（41.03%），cyl+glnA+cfb、lmb+cyl+bac、lmb+cyl+cfb、lmb+cyl+cfb+bac次之，检出率分别为25.64%、15.38%、10.26%、7.69%，经研究发现，有国外学者Tian X Y等^[23]对乳腺炎奶牛链球菌的毒力基因分析结果中，共发现24种毒力基因组合，明显多于本次试验，且bca + cfb(9.38%)、lmb + cfb(6.25%)和cfb + hylB(6.25%)等组合的检出率均与本次试验结果有差异。造成以上差异可能是由于地理位置和样品来源不一致等因素造成的，由于西藏奇特多样的地貌形态，形成了其复杂多样的独特气候，昼夜温差较大，且动物的饲养管理多以放牧为主，进而对于病原菌的传播未能及时阻断，增加了链球菌的感染，因此养殖户应提高意识，加强饲养管理、严格消毒制度、注意疫病检疫^[24]。

4 结论

本次试验所需牦牛乳样采自山南市、林芝市、阿里地区部分地区，通过分离鉴定，共得到110株链球菌，进一步分析其形态、生化及血清分型特征，并对其毒力基因进行检测，阐述了牦牛乳源链球菌的部分生物学特性，为后续链球菌的临床诊断及防治提供一定基础。

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基金资助

西藏自治区科技厅2019年度重点资助项目(201901)

基于西藏牛病原谱识别与风险防控的核酸快检试剂与口服多联生物制剂的开发策略研究项目资助(XZ202201ZY0009N)

国家现代农业产业技术体系资助项目(CARS-37)