禽沙门氏菌、大肠杆菌及产气荚膜梭菌多重荧光PCR检测方法的建立及应用

Establishment and Application of Multiplex Real-Time PCR Method for Avian Salmonella, Escherichia Coli and Clostridium Perfringens

摘要

为建立禽沙门氏菌、大肠杆菌及产气荚膜梭菌的多重荧光PCR鉴别检测方法，根据GenBank中沙门氏菌invA、大肠杆菌phoA、产气荚膜梭菌plc基因序列分别设计特异性引物和Taqman探针，并优化PCR反应体系和反应条件，应用该方法对临床样品进行检测。结果显示：该方法与巴氏杆菌、新城疫病毒和鸭疫里默氏杆菌等无交叉反应，具有较高特异性；沙门氏菌、大肠杆菌和产气荚膜梭菌最低检测限度（LOD）均达66.9 copies/μL，相比检测沙门氏菌、大肠杆菌及产气荚膜梭菌的普通PCR的敏感性分别高100倍、1 000倍和1 000倍，具有高敏感性；组内和组间变异系数均低于3.84%，稳定性良好；通过对30份临床样品和已鉴定的23份菌株进行检测，显示该检测方法符合率为100%。建立的多重荧光PCR方法特异性和敏感性较好，适用于临床禽沙门氏菌、大肠杆菌和产气荚膜梭菌单一或混合感染的快速诊断及流行病学调查，提高了家禽腹泻疾病的诊断效率，具有良好应用价值。

Abstract

In order to establish a multiplex real-time PCR method for the differential detection of avian Salmonella, Escherichia coli and Clostridium perfringens. Specific primers and Taqman probes for Salmonella, Escherichia coli and Clostridium perfringens were designed based on invA, phoA and plc genes in GenBank, respectively, the PCR reaction system and reaction conditions were optimized. The clinical samples were detected by this method. The results showed that the method had high specificity and no cross-reaction with Pasteurella, Newcastle disease virus and Riemerella anatipestifer. The limit of detection (LOD) of Salmonella, Escherichia coli and Clostridium perfringens were all 66.9 copies/μL, 100 times, 1000 times and 1000 times more sensitive than general PCR for detection of Salmonella, Escherichia coli and Clostridium perfringens, indicating high sensitivity. Intra- and inter-assay coefficients of variation (CVs) of the Ct values were less than 3.84 %, indicating good stability. Through the detection of 30 clinical samples and 23 identified strains, the coincidence rate of the detection method was 100%. In summary, the established multiplex real-time PCR method demonstrated excellent specificity, sensitivity and detection efficiency. It was suitable for the rapid diagnosis and epidemiological investigation of investigation of avian Salmonella, Escherichia coli and Clostridium perfringens infections, either individually or in mixed infections. This method could enhance the efficiency of diagnosing avian diarrhea diseases and hold significant practical value.

Graphical abstract

关键词

禽腹泻 / 沙门氏菌 / 大肠杆菌 / 产气荚膜梭菌 / 多重荧光PCR

Key words

avian diarrhea / Salmonella / Escherichia coli / Clostridium perfringens / multiplex real-time PCR

近年来，禽病发生呈现多病原混合感染的现象^[1]，如呼吸道综合征、腹泻综合征等。其中沙门氏菌^[2]、大肠杆菌^[3]和产气荚膜梭菌^[4]是引起禽腹泻的常见细菌性病原，具有较高的临床发病率和病死率，对养禽业构成严重威胁。禽沙门氏菌病临床症状表现为水样状下痢或黄绿色粪便、精神沉郁、厌食、羽毛松乱等，肝脏和脾脏有明显肿大，肝脏坏死呈青色^[5,6]；禽大肠杆菌病临床症状表现为拉灰白色或绿色粪便、体温升高、精神沉郁、呼吸障碍、活动减缓、食欲不振和肝脏等，心包及腹膜有渗出物^[6,7]；禽产气荚膜梭菌病临床症状表现为粪便为黄白色、黄褐色糊状或是红色甚至黑褐色煤焦油状、精神委靡、采食量逐渐减少甚至食欲废绝、被毛粗乱等，小肠后半段，空肠和回肠出现坏死性肠炎的病变^[8]。这3种细菌感染家禽后具有相似的临床症状，给禽腹泻疾病的防治带来困难。因此，开发能同时诊断这3种细菌的多重荧光PCR检测方法多对禽腹泻病防治具有重要意义。Saeidabadi 等^[9]通过沙门氏菌的hemD基因设计了寡聚核苷酸引物，开发了结合高分辨率熔解曲线（HRM）分析的PCR检测方法，可快速鉴定禽沙门氏菌；Ikuta N等^[10]开发的TaqMan荧光定量PCR可快速检测禽致病性大肠杆菌；Wu S B等^[11]在肉鸡坏死性肠炎的攻毒模型中，比较了实时荧光PCR和基于细菌培养的方法对禽产气荚膜梭菌的检测结果，研究表明该PCR检测方法可以免去产气荚膜梭菌增菌培养；此外，对于水体^[12]和猪^[13]同时检测这3种细菌的方法也报道。禽沙门氏菌、大肠杆菌及产气荚膜梭菌感染可对家禽养殖造成较大损失，但目前国内外鲜有对这三种禽源细菌的多重荧光定量PCR方法进行的研究报道。本试验针对沙门氏菌invA、大肠杆菌phoA、产气荚膜梭菌plc基因序列设计特异性引物和探针，通过优化PCR反应体系和反应条件，建立能同时检测并区分这3种细菌的三重荧光PCR检测方法，为禽腹泻病的病原菌快速区分和高效防控提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 菌株、病毒和临床样品

沙门氏菌（CAU 0506）、大肠杆菌（CICC 10899）、产气荚膜梭菌（CAU 0106）、禽源巴氏杆菌（CAU 0284）、鸭疫里默氏杆菌（HNAU 0064）、丁酸梭菌（CICC 10390）、枯草芽孢杆菌（CAU 0805）、粪肠球菌（CICC 23678）、戊糖片球菌（CICC 10196）及新城疫病毒（CVCC AV116）核酸均由本实验室保存。2022年采自广东省某鸡场的30份腹泻鸡的粪便临床样品，由本实验室收集、保存。

1.2 主要试剂及仪器

Pro Taq HS Premix Probe qPCR Kit购自湖南艾科瑞生物工程有限公司；粪便基因组DNA提取试剂盒购自天根生化科技（北京）有限公司；亚硒酸盐胱氨酸（SC）培养基、四硫磺酸钠煌绿（TTB）培养基和液体硫乙醇酸盐（FT/FTG）培养基均购自广东环凯微生物科技有限公司；Nano Drop Lite超微量核酸检测仪为美国赛默飞世尔科技公司产品；qTOWER3G荧光定量PCR仪为德国耶拿分析仪器公司产品。

1.3 引物和探针设计

参考GenBank中已知的沙门氏菌invA、大肠杆菌phoA和产气荚膜梭菌plc基因序列信息，通过MEGA Ⅹ软件进行序列比对分析寻找基因保守区域，参考在线软件Oligo Architec（http://www.oligoarchitect.com/LoginServlet），自行设计特异性引物和Taqman探针，并由上海生工生物公司合成。

1.4 标准品的制备

委托上海生工生物有限公司以pUC57为克隆载体合成包括3条扩增片段共289 bp长度的基因序列，测序正确后获得的pUC57-SE-EC-CP作为标准质粒。利用超微量核酸测定仪测量pUC57-SE-EC-CP质粒浓度，根据质粒拷贝数计算公式：Plasmid copies/μL = \frac{(\mathrm{6.02}\times {\mathrm{10}}^{\mathrm{23}})\times (\mathrm{X}\mathrm{n}\mathrm{g}/\mathrm{\mu }\mathrm{L}\times {\mathrm{10}}^{-\mathrm{9}})}{\mathrm{质粒}\mathrm{长度}(bp)\times \mathrm{660}}^[14]，其中X为质粒浓度，将质量浓度换算为拷贝数浓度。

1.5 多重荧光PCR检测方法的反应条件优化

以pUC57-SE-EC-CP标准品为模板，优化包括对引物终浓度（50 nmol/L ~ 250 nmol/L）和探针终浓度（50 nmol/L ~ 250 nmol/L）的优化，退火温度（57.1 ℃，58.0 ℃，59.0 ℃，60.0 ℃，61.0 ℃，62.0 ℃，63.0 ℃，63.9 ℃）的优化以及循环数（35，40，45）优化，确定最佳反应条件。

1.6 特异性试验

以沙门氏菌、大肠杆菌、产气荚膜梭菌、禽源巴氏杆菌、鸭疫里默氏杆菌、丁酸梭菌、枯草芽孢杆菌、粪肠球菌、戊糖片球菌及新城疫病毒的核酸为模板，双蒸水作为阴性对照，对该三重荧光PCR检测方法进行特异性试验。

1.7 敏感性试验

以浓度梯度为6.69×10⁰ ~ 6.69×10⁸ copies/μL的标准质粒稀释液为模板，双蒸水作为阴性对照，进行扩增，确定其最小检测限度。

1.8 多重荧光PCR与普通PCR的敏感性试验比较

将沙门氏菌、大肠杆菌、产气荚膜梭菌的核酸进行10倍倍比稀释10^-1 ~ 10^-8作为模板，同时进行多重荧光PCR和相同靶基因的普通PCR扩增，对比两种方法的检测灵敏度。

1.9 标准曲线的建立

选取6.69×10¹ copies/μL ~ 6.69×10⁸ copies/μL浓度梯度的pUC57-SE-EC-CP稀释液为阳性模板，双蒸水作为阴性对照，进行多重荧光PCR扩增，标准曲线及其线性方程、相关系数（R²）和扩增效率均由耶拿qPCR soft 4.0软件生成。

1.10 重复性试验

选取标准质粒的3个浓度稀释液，分别为（6.69×10³ 、6.69×10⁵ 、6.69×10⁷ copies/μL）为模板，每个梯度浓度反应9次，双蒸水作为阴性对照，对建立的三重荧光PCR检测方法进行组内和组间重复性试验，计算变异系数。

1.11 临床样品检测

利用所建立的多重荧光PCR方法对本实验室2019 - 2021年从广东省多个家禽养殖场分离鉴定获得的10株沙门氏菌、10株大肠杆菌和3株产气荚膜梭菌进行符合率检测。参照粪便基因组DNA提取试剂盒说明，提取2022年广东省某个鸡场30份具有腹泻症状鸡的粪便基因组DNA，利用本研究建立的方法进行检测，统计3种病原感染情况；同时对这30份样品进行增菌培养，采用相同靶基因的普通PCR方法验证基因组^[15-16]。

2 结果与分析

2.1 反应条件优化结果

经过对反应体系优化，确定三重荧光PCR最佳反应体系为：Pro Taq HS Premix（2×）10.0 μL，上、下游引物（10 μmol/L）各0.5 μL，探针 （10 μmol/L）为0.5 μL，引物、探针终浓度均为250 μM模板2.0 μL，ddH₂O补足至20.0 μL，退火温度59.0 ℃，循环数为45。

2.2 特异性试验

采用本研究所建立的方法，对沙门氏菌、大肠杆氏菌、产气荚膜梭菌、禽源巴氏杆菌、鸭疫里默氏杆菌、丁酸梭菌、枯草芽孢杆菌、粪肠球菌、戊糖片球菌及新城疫病毒的核酸进行检测，并设置阴性对照。结果表明（如图1），仅沙门氏菌、大肠杆菌、产气荚膜梭菌在对应的通道出现特异性扩增，其他病原及阴性对照均无Ct值，表明该方法具有良好的特异性。

2.3 敏感性试验结果

敏感性试验结果表明，扩增动力学对数曲线（图2 ~ 4）对应反应孔阳性率为100%（8/8）的最低浓度均为6.69×10¹ copies/μL，为了确保检出限的准确性，确定该方法三种细菌的最低检出限（limit of detection，LOD）均为66.9 copies/μL反应。

2.4 敏感性对比试验结果

多重荧光PCR与普通PCR两种检测方法的灵敏度对比试验结果表明（图5），普通PCR方法对沙门氏菌、大肠杆菌和产气荚膜梭菌的最低检出稀释倍数分别为10^-4、10^-3和10^-2，多重荧光PCR方法对这三种细菌的最低检出稀释倍数分别为均为10^-6、10^-6和10^-5，对沙门氏菌的检测敏感性比普通PCR方法高100倍，对大肠杆菌和产气荚膜梭菌的敏感性比普通PCR方法高1 000倍。

2.4 标准曲线的建立

以系列稀释的质粒作为模板，利用所建立的多重荧光PCR方法进行检测，得到扩增标准曲线（图6）。结果表明，模板浓度在6.69×10¹ copies/μL ~ 6.69×10⁸ copies/μL内与Ct值存在良好的线性关系，其中沙门氏菌标准方程y=-3.35x+41.58，R²=0.99 731，扩增效率99%；大肠杆菌标准方程y=-3.41x+40.53，R²=0.9 966，扩增效率96%；产气荚膜梭菌标准方程y=-3.41x+40.64，R²=0.997 03，扩增效率96%。

2.5 重复性试验结果

以3个不同浓度的质粒作为模板，每个浓度设9个平行，进行多重荧光PCR检测。结果表明，组内变异系数在0.55% ~ 2.84%范围内，组间变异系数在0.66% ~ 3.84%范围内（表2）。

2.6 临床样品检测结果

对2019 - 2021年本实验室分离鉴定获得的10株沙门氏菌、10株大肠杆菌和3株产气荚膜梭菌进行回溯性检测，该结果（表3）与先前经16S rDNA测序鉴定结果符合率为100%，无漏检、错检情况。检测广东省某鸡场30份具有腹泻症状的鸡粪便基因组DNA，结果显示（表3），30份样品大肠杆菌阳性，4份沙门氏菌阳性，无产气荚膜梭菌检出，采用相同靶基因的普通PCR方法验证，结果也完全符合。

3 讨论

近年来我国养禽业集约化程度大幅提高，家禽传染病的流行趋势发生了改变，呈现出多种病原菌混合感染的趋势，给养禽业造成巨大经济损失^[17]。严重危害家禽的细菌性传染病主要是沙门氏菌病、大肠杆菌病和产气荚膜梭菌病等^[18-20]，这三种细菌性传染病临床症状类似，仅凭临床病理特征不易准确诊断。常规微生物学诊断方法操作繁杂、耗时，不能满足临床诊断的需要。单一PCR能达到较高灵敏度，但只能检测一种病原菌，不能快速明确病原混合感染的情况。实时荧光定量PCR技术是一种新型的核酸定量技术，检测和分析过程均在密闭的单管里由机器自动完成，同时具备了DNA杂交技术的高特异性、光谱技术的高精确性、自动化程度高、有效解决PCR产物污染问题及能定量检测病原体感染等优点^[21,22]。

invA仅存在于沙门氏菌中，参与细菌侵入宿主并启动感染，常作为诊断金标准^[23-24]。碱性磷酸酶基因（alkaline phosphatase）phoA作为大肠杆菌的管家基因，存在于各种大肠杆菌菌株中，广泛用于大肠杆菌的PCR检测^[25-27]。plc基因编码的α毒素是产气荚膜梭菌的主要外毒素，存在于A ～ E型产气荚膜梭菌中，具有很好的特异性^[28]。本研究基于禽源沙门氏菌invA、大肠杆菌phoA和产气荚膜梭菌plc基因建立了多重荧光PCR方法，并对反应体系和反应条件进行了优化。目的基因片段、引物及探针经NCBI Primer-BLAST显示具有较强特异性，同时选取了其他禽类常见病原作为对照，证实了本试验建立的多重荧光PCR检测方法对其他病原无交叉反应，具有良好特异性。该方法具有较高敏感性，对沙门氏菌、大肠杆菌和产气荚膜梭菌LOD均达66.9 copies/μL，直接对粪便全基因组DNA提取作为模板，不需要进行细菌扩繁，极大缩短了检测时间，提高了检测速度，可对临床上出现细菌性腹泻的家禽的病原菌进行快速鉴别诊断。

本研究中所采集临床样品均为粪便，从检测结果来看，大肠杆菌感染率最高，达100%（30/30），沙门氏菌感染率次之，为13.33%（4/30），并合并大肠杆菌感染，与宋海霞等^[29]在河南省地区腹泻鸡群中检测出主要致病菌为鸡大肠杆菌和沙门氏菌的结果基本一致。而在30份临床样品中暂未有产气荚膜梭菌检出，说明本次禽腹泻病不是由产气荚膜梭菌导致的。大肠杆菌、沙门氏菌和产气荚膜梭菌混合感染可增强细菌的致病性，病禽死亡率高，用药难度大，给治疗带来困难。养殖场需对大肠杆菌、沙门氏菌和产气荚膜梭菌的流行特点，采取有效措施来预防疾病的发生。

4 结论

本研究建立的禽沙门氏菌、大肠杆菌和产气荚膜梭菌多重荧光PCR检测方法操作简单、快速、高效，具有优秀的特异性、较高的敏感性和良好的稳定性，可以为这3种禽源细菌疾病感染的快速诊断、有效防控和流行病学调查提供有力工具。

参考文献

[1] 门凯凯,刘佳隆,郭亚格 等.鸡TGF-β1对大肠杆菌和鸡白痢沙门菌黏附DF1细胞的影响[J].畜牧兽医学报,2022,53(11):4000-4007.

[2] 张盛,王一冰,蒋守群.益生菌对鸡抵御沙门氏菌感染作用研究进展[J].动物营养学报,2021,33(05):2408-2415.

[3] 刘占经,王斌,张小萍.鸡大肠杆菌病致病源对比分析及防控对策[J].畜牧兽医杂志,2020,39(05):87-88.

[4] 冯家伟,王湘如,赵月 等.鸡产气荚膜梭菌耐药研究进展[J].国外医药(抗生素分册),2022,43(01):30-36.

[5] 李雪雁,付涛,纪桂云 等.华南地区肉鸽源沙门氏菌的鉴定及遗传进化分析[J].中国畜牧兽医,2014,41(07): 207-211.

[6] 张龙舟,高青山,崔莲花 等.基于肠道菌群调控治疗动物腹泻的相关研究进展[J].饲料研究,2021,44(12):108-112.

[7] 吕颜枝,李华坤,康永刚 等.白头翁汤和黄连解毒汤对鸡大肠杆菌病的治疗作用[J].中兽医医药杂志,2021,40(01):65-67.

[8] 王芳,谢书宇,潘源虎 等.畜禽坏死性肠炎防制研究进展[J].中国畜牧兽医,2017,44(07):2132-2138.

[9] Saeidabadi M S, Nili H, Dadras H, et al. Evaluation of PCR and high-resolution melt curve analysis for differentiation of Salmonella isolates[J]. Avian Pathol., 2017, 46(3): 319-331.

[10] Ikuta N, De Oliveira Solla Sobral F, Lehmann F K, et al. Taqman real-time PCR assays for rapid detection of avian pathogenic Escherichia coli isolates[J]. Avian Dis, 2014, 58(4): 628-631.

[11] Wu S B, Rodgers N, Choct M. Real-time PCR assay for Clostridium perfringens in broiler chickens in a challenge model of necrotic enteritis[J]. Appl Environ Microbiol, 2011, 77(3): 1135-1139.

[12] Rozwadowska B, Albertyńska M, Hudzik G, et al. Application of a real-time PCR method for Salmonella spp., Escherichia coli, Staphylococcus aureus and Clostridium perfringens detection in water samples[J]. Pol J Microbiol, 2013, 62(4): 439-443.

[13] 刘嘉琳,刘东旭,董文龙 等.猪大肠杆菌,沙门菌及产气荚膜梭菌的多重实时荧光定量PCR检测方法的建立及应用[J].中国兽医学报,2021,41(11):2161-2166.

[14] International Committee on Taxonomy of Viruses. Taxonomy. (2019). Available online at: https://talk.ictvonline.org/taxonomy/ (accessed October 16, 2020

[15] Hu Q, Tu J, Han X, et al. Development of multiplex PCR assay for rapid detection of Riemerella anatipestifer, Escherichia coli, and Salmonella enterica simultaneously from ducks[J]. J Microbiol Methods, 2011, 87(1): 64-69.

[16] Yonogi S, Kanki M, Ohnishi T, et al. Development and application of a multiplex PCR assay for detection of the Clostridium perfringens enterotoxin-encoding genes cpe and becAB [J]. J Microbiol Methods, 2016, 127: 172-175.

[17] 宫强,李战丽,牛明福.禽4种常见细菌病多重PCR检测方法的初步研究[J].黑龙江畜牧兽医,2018,(09):122-126.

[18] 李婷,周景瑞,姜玲玲 等.三种鸡源致病性细菌多重PCR检测方法的建立[J].上海畜牧兽医通讯,2020,(04): 2-5.

[19] 陆瑶,丁仕豪,曹俊 等.鸡白痢沙门氏菌PCR检测方法的建立[J].中国预防兽医学报,2021,43(11):1178-1183.

[20] 胡贺,覃宗华,王艳华 等.不同地区鸡源产气荚膜梭菌的毒素型鉴定和药敏试验[J].畜牧与兽医,2015, 47(10):28-34.

[21] 汪最,李丽,刘鹏,等.ALV-J、REV和MDV多重荧光定量PCR检测方法的建立[J].中国动物传染病学报,2020,28(06):73-78.

[22] 任晨玮,罗润波,索朗斯珠.牛病毒性腹泻病毒Real-time PCR检测方法的建立[J].高原农业,2019,3(02):187-192+230.

[23] 侯悦,刘洁.肠炎沙门氏菌中侵袭相关毒力基因研究进展[J].食品安全质量检测学报,2021,12(10):3867-3873.

[24] Beshiru A, Igbinosa I H, Igbinosa E O. Prevalence of Antimicrobial Resistance and Virulence Gene Elements of Salmonella Serovars from Ready-to-Eat (RTE) Shrimps[J]. Front Microbiol, 2019, 10: 1613.

[25] 任金瑞,李均同,赵效南 等.禽类三种常见病原菌快速检测体系的建立及应用[J].山东农业科学,2021, 53(11):120-125.

[26] Li P, Zhang D, Li H, et al. Establishment and Application of Multiplex PCR for Simultaneously Detecting Escherichia coli, Salmonella, Klebsiella pneumoniae, and Staphylococcus aureus in Minks[J]. Front Vet Sci, 2020, 7: 588173.

[27] Wang Z, Zuo J, Gong J, et al. Development of a multiplex PCR assay for the simultaneous and rapid detection of six pathogenic bacteria in poultry[J]. AMB Express, 2019, 9(1): 185.

[28] 刘立兵,李睿文,陈志敏 等.产气荚膜梭菌实时荧光PCR和实时荧光RPA检测方法的建立和比较[J].食品科学,2020,41(04): 268-272.

[29] 宋海霞.河南省鸡腹泻重要病原菌的分离鉴定与耐药性及PCR检测方法的研究[D].郑州:河南农业大学,2010.

基金资助

广东省重点领域研发计划项目(2020B0202080004)

广东省动物疫病野外科学观测研究站项目(2021B1212050021)

广东省现代农业产业技术体系创新团队建设专项资金项目(2022KJ119)

广东省农业科学院“十四五”学科团队项目(202122TD)

广东省农业科学院院长基金(202024)