全脂牦牛乳与脱脂牦牛乳蛋白组学比较分析

Analysis of the Effect of Fat on Protein Function in Yak Milk Based on 4D Proteomics

摘要

为深入了解牦牛乳脱脂前后的蛋白功能差异，本实验基于4D非标（4D LFQ -Label-free）蛋白质组定量技术对全脂牦牛乳和脱脂牦牛乳进行蛋白组学分析。结果表明脱脂前后牦牛乳蛋白在数量上共有365种受到影响，其中231种蛋白的功能被上调，134种蛋白的功能被下调；主要被上调的蛋白功能为：核糖体、cGMP-PKG信号通路、缝隙连接、长期抑郁、胰岛素分泌、脂肪细胞中脂肪分解的调节等通路；主要被下调的蛋白功能为：糖酵解/糖异生、淀粉和蔗糖代谢、n-聚糖生物合成、各种类型的N-聚糖生物合成、溶酶体；除此之外脱脂后的牦牛乳还会不同程度上影响内质网中的蛋白质加工、补体和凝血级联反应、肾素-血管紧张素系统等功能。

Abstract

To gain a deeper understanding of the differences in protein functionality before and after the skimming of yak milk, this experiment utilized the 4D non-standard (4D LFQ-Label-free) proteomic technology to conduct a proteomic analysis of whole-fat yak milk and skimmed yak milk. The results showed that a total of 365 proteins in yak milk were impacted in terms of quantity before and after the skimming process. Among these, 231 proteins exhibited an upregulation in their functionality, while 134 proteins displayed a downregulation in their functionality. The primary protein functions that were upregulated included ribosome, cGMP-PKG signaling pathway, gap junctions, long-term depression, insulin secretion, and regulation of lipolysis in adipocytes. Conversely, the main downregulated protein functions encompassed glycolysis/gluconeogenesis, starch and sucrose metabolism, n-glycan biosynthesis, various types of N-glycan biosynthesis, lysosomes. Furthermore, skimmed yak milk also had varying degrees of impact on functions related to protein processing in the endoplasmic reticulum, the complement and coagulation cascade, renin-angiotensin system and other functions. These alterations may potentially reduce the likelihood of developing conditions such as hypertension, high blood fat, and other related diseases. In summary, this study provided valuable insights into the modifications in protein functionality resulting from the skimming process of yak milk, with potential implications for health-related outcomes.

Graphical abstract

关键词

牦牛乳 / 脱脂 / 蛋白质组学 / 功能

Key words

yak milk / degrease / proteomics / function

牦牛是高原地区特有的畜种，主要生存在我国青藏高原以及周边地区，牦牛乳被称为“天然浓缩乳”，是我国高原地区人民生活中主要的乳品加工原料^[1]；牦牛蛋白含量丰富，与其他物种相比，其中乳蛋白质的平均质量分数（5.4%）要高于藏山羊（4.27%）杂交牛（4.71%）和荷斯坦牛（3.4%）^[2]，且其蛋白质组成与其他动物乳相比有所不同。牦牛乳中主要含有α-S1-酪蛋白、α-S2-酪蛋白、β-酪蛋白和κ-酪蛋白等四种主要蛋白质^[3]。其中，α-S1-酪蛋白是牛乳中含量最高的蛋白质之一^[4]，但在牦牛乳中的含量较低。相比之下，牦牛乳中含量较高的是β-酪蛋白和κ-酪蛋白^[5-6]。此外，牦牛乳中还含有一些特殊的蛋白质，如乳铁蛋白、乳清蛋白、免疫球蛋白等6。其中，β-酪蛋白和κ-酪蛋白具有较强的抗菌活性，可用于食品保鲜和医药领域。乳铁蛋白则具有良好的免疫调节作用，可用于预防和治疗免疫相关疾病。总体而言，牦牛乳蛋白质具有丰富的种类和生物活性，具有广泛的应用前景。脂肪作为乳中重要的组成成分，是哺乳动物幼仔生长初期主要能量来源，牦牛乳中的脂肪不仅是评价牦牛乳品质的重要是指标还是形成牦牛乳风味的重要来源。但由于特殊人群在选择乳制品时会选择脱脂产品，因此我们思考脱脂前后的牦牛乳蛋白是否会发生变化，造成蛋白功能上的变化，进而影响食用者的身体健康。目前，针对类研究相对较少，所以本次研究旨在利用蛋白组学分析手段对西藏牦牛乳脱脂前后的蛋白组学情况进行了解，为脱脂前后牦牛乳蛋白功能是否发生改变进行初步探讨，提供一个更加准确的科学数据。

蛋白组学是对细胞中蛋白质及其相互作用的研究，是一个相对较新且发展迅速的领域，蛋白质组学技术能够精准分析复杂乳蛋白混合物中的蛋白质，包括蛋白质检测、鉴定和表征以及定量^[7]。随着蛋白质组学技术的发展，已有人采用此方法揭示了不同物种（人、牛、山羊和牦牛）的MFGM蛋白的蛋白质组学差异^[12]，在人、牛、山羊和牦牛的血清中分别鉴定和定量了198、169、213和128种蛋白质^[8]，还有利用蛋白质组学技术在牦牛胸最长肌中共鉴定出2 650个蛋白，发现磷蛋白主要与肌原纤维组织、能量代谢调节和信号传导有关；N-糖蛋白主要参与细胞外基质的组织、细胞免疫和有机物体内平衡^[9]；通过对牛奶和酸奶中N-糖蛋白质组学分析在牛奶和酸奶中鉴定了118种N-糖蛋白中的181种N-糖基，发现牛奶发酵成酸奶后，有13种N-糖基发生了显著变化等一些研究^[10]。

蛋白许多复杂的变化发生在加热处理过程中，传统的生物化学方法只能识别某些主要蛋白质的变化，这限制了对微量蛋白质变化的研究^[11]。因此我们采取了最新的4D非标（4D LFQ -Label-free）蛋白质组定量技术，它能够快速灵敏的对蛋白进行分析。同时，4D非标蛋白质组定量技术对一些低量蛋白有更高的灵敏性，能更好的对修饰蛋白肽段进行组学分析，相对传统的检测手段更为高效精准。

1 材料与方法

1.1 仪器与材料

样品：本次研究新鲜牦牛乳2021年6月采于西藏拉萨市当雄县高原牧场，在低温-4 ℃条件下转移至实验室。将采回的部分牦牛乳样品在实验室以4 ℃，2 149×g条件下离心15 min，弃去上层脂肪，收集下层液体（脱脂乳TZR），保留部分全脂牦牛乳（QR）作为对照，全脂牦牛乳-4 ℃下贮藏，24 h内使用。

试剂：尿素：Sigma-Aldrich；蛋白酶抑制剂：Merck Millipore；BCA 试剂盒：碧云天；三氯乙酸(Trichloroacetic acid,TCA)：Sigma-Aldrich；丙酮，TEAB，蛋白酶，二硫苏糖醇（DTT），二硫苏糖醇（DTT），碘乙酰胺（IAM），甲酸，乙腈，超纯水（H₂O）；

1.2 实验方法

1.2.1 蛋白提取

各组取适量样品分别加入样品4倍体积裂解缓冲液（8 M尿素，1%蛋白酶抑制剂，），超声裂解。4 ℃，12 000 g离心10 min，去除细胞碎片，上清液转移至新的离心管，利用BCA试剂盒进行蛋白浓度测定^[12-13]。

1.2.2 胰酶酶解

各样品蛋白取等量进行酶解，用裂解液将体积调整至一致。缓慢加入终浓度20 % TCA，涡旋混匀，4 ℃沉淀2 h。4 500 g，离心5 min，弃上清，用预冷的丙酮洗涤沉淀2~3次。晾干沉淀后加入终浓度200 mM的TEAB，超声打散沉淀，1:50的比例（蛋白酶：蛋白，m/m）加入胰蛋白酶，酶解过夜。加入二硫苏糖醇（DTT）使其终浓度为 5 mM，56 ℃还原30 min。之后加入碘乙酰胺（IAM）使其终浓度为11 mM，室温避光孵育 15 min^[14,15]。

1.2.3 液相色谱-质谱联用分析

肽段用液相色谱流动相A相溶解后使用EASY-nLC 1200超高效液相系统进行分离。流动相A为含0.1% 甲酸和2% 乙腈的水溶液；流动相B为含0.1%甲酸和90%乙腈的水溶液^[16]。液相梯度设置：0-26 min，9%~25%B；26~34 min，25%~35%B；34~37 min，35%~80%B；37~40 min，80%B，流速维持在500 nL/min。 肽段经由超高效液相系统分离后被注入NSI离子源中进行电离，然后进入Orbitrap Exploris™ 480质谱进行分析。离子源电压设置为2.2 kV，FAIMS补偿电压（CV）设置为-45V,-70V，肽段母离子及其二级碎片都使用高分辨的Orbitrap进行检测和分析^[17,18]。一级质谱扫描范围设置为400~1 500 m/z，扫描分辨率设置为 60 000；二级质谱扫描范围固定起点为100 m/z，二级扫描分辨率设置为15 000，TurboTMT设置为Off^[19]。数据采集模式使用数据依赖型扫描（DDA）程序，即在一级扫描后选择信号强度最高的前20肽段母离子依次进入HCD碰撞池使用28%的碎裂能量进行碎裂，同样依次进行二级质谱分析^[20]。为了提高质谱的有效利用率，自动增益控制（AGC）设为5E4，信号阈值设置为2E4 ions/s，最大注入时间设置为100 ms，串联质谱扫描的动态排除时间设置为30 s避免母离子的重复扫描^[21]。

1.2.4 蛋白注释方法

Gene Ontology注释：GO注释是将鉴定到的蛋白利用eggnog-mapper软件（v2.0）进行注释分析。该软件基于EggNOG数据库，目前最新版是第5版，涵盖了5 090个生物（477个真核生物、4 445个代表性细菌和168个古细菌）以及2 502个病毒的全基因组编码蛋白质序列。这里提取每个蛋白质注释结果中的GO ID，然后按照细胞组分，分子功能和生物过程对蛋白进行功能分类。

蛋白结构域注释：数据中基于Pfam数据库及相应的PfamScan工具对鉴定到的蛋白质进行蛋白结构域注释。

KEGG通路注释：基于KEGG通路数据库对蛋白通路进行注释，将鉴定到的蛋白质进行BLAST比对（blastp，evalue≤1e-4），对于每一条序列的BLAST比对结果，选取比对得分（score）最高的比对结果进行注释。

1.3 数据分析

本实验数据采用GO注释利用eggnog-mapper软件（v2.0）进行注释分析；基于Pfam数据库及相应的PfamScan工具对鉴定到的蛋白质进行蛋白结构域注释；基于KEGG通路数据库对蛋白通路进行注释；聚类关系使用R语言包pheatmap绘制出的热图进行可视化展示；进行独立样品Tukey检验P＜0.05表示差异具有统计学意，其他数据采取平均值标差进行处理。

2 结果与分析

2.1 数据质控

在定量时，一个蛋白对应多个特异性肽段或对应多张谱图有利于增加定量结果的精确性和可信性。通过图1A我们发现牦牛乳中大部分蛋白对应两个以上肽段。在基于shotgun(也叫bottom-up)策略的质谱分析方法中，质谱优先扫描丰度较高的肽段。因此，蛋白的覆盖率和在样品中的丰度成正相关。图1B显示大部分蛋白的覆盖度在30%以下。图1C表明鉴定牦牛乳蛋白的分子量主要集中在10~90 kDa，其它不同阶段均有，且分布均匀。

2.2 主成分分析（PCA）

两组牦牛乳的蛋白定量主成分分析结果展示图所示，图中样本间的聚集程度代表样本的差异性大小，我们发现同组之间的样品聚集程度良好，差异性较小；TZR组与QR组蛋白之间蛋白主成分已经产生明显差异变化。

2.3 差异蛋白筛选

为了发现脱脂前后牦牛乳蛋白在功能差异性数量上的变化，我们将定量统计后的差异蛋白进行功能以及数量上的汇总，通过筛选发现TZR组与QR组相比共有231中蛋白功能被上调，134中蛋白功能被下调（图3）。

2.4 差异蛋白功能分类

通过差异蛋白的筛选我们发现QR组与TZR组确实存在对牦牛乳蛋白功能上造成影响，为更进一步直观了解这些变化的差异蛋白对那些功能进行影响，我们将这些导致功能变化的差异表达蛋白进行了GO（Gene Ontology）分类以及COG/KOG功能分类统计。将TZR组与QR组中差异蛋白的功能进行GO二级注释分类3大类：生化过程，细胞组分和分子功能，从不同角度阐释蛋白的生物学作用。发现TZR、QR组中差异蛋白参与细胞过程、代谢过程、生物调节、刺激反应等21种过程；亚细胞结构结构分类结果显示有7种，分别为细胞外（34.33%）、细胞质（31.34%）、线粒体（8.96%）、膜血浆（7.46%）、核（6.72%）、细胞质、细胞核（5.97%）、内质网（2.99%）；COG/KOG功能分类统计发现参与细胞过程和信号传导、信息的存储与处理、新陈代谢、代谢作用等21种COG/KOG功能。

2.5 KEGG 富集通路图

为了更深入了解这些蛋白分子间相互作用的信息网络，如代谢通路、复合物、生化反应等。对ZTR与QR中差异蛋白进行述富集分析得到KEGG通路，我们发现QR与TZR蛋白相关代谢途径以及蛋白的消化和吸收，最终会影响机体功能。经过脱脂后会上调：核糖体（Ribosome）、cGMP-PKG信号通路（GMP-PKG signaling pathway）、缝隙结点（Gap junction）、长期抑郁（Long-term depression）、胰岛素分泌（Insulin secretion）、脂肪细胞中脂肪分解的调节（Regulation of lipolysis in adipocytes）等通路；会下调糖酵解/糖异生（Glycolysis / Gluconeogenesis）、淀粉和蔗糖代谢（Starch and sucrose metabolism）、n-聚糖生物合成（N-Glycan biosynthesis）、各种类型的N-聚糖生物合成（Various types of N-glycan biosynthesis）、溶酶体（Lysosome）、还会影响：内质网中的蛋白质加工（Protein processing in endoplasmic reticulum）、补体和凝血级联反应（Complement and coagulation cascades）、肾素-血管紧张素系统（Renin-angiotensin system）等通路。

3 讨论

全脂牦牛乳经过离心后脱去脂肪，并不会影响样本中相应肽段的信号强度与相应的蛋白质相对定量。通过对牦牛乳脱脂前后的蛋白质组学分析，发现牦牛乳脱脂后影响众多的机体代谢通路，这些通路会直接影响身体机能的变化。脱脂乳会降低糖酵解/糖异生通路，糖酵解通路是将葡萄糖转化为丙酮酸并产生少量ATP（能量）和NADH（还原力）的过程，它是产生重要前体代谢物的中心途径：葡萄糖-6P和果糖-6P的六碳化合物以及甘油酮-P、甘油醛-3P、甘油酸-3P、磷酸烯醇丙酮酸和丙酮酸的三碳化合物-乙酰辅酶a，另一种重要的前体代谢物，由丙酮酸的氧化脱羧产生；糖异生是从非碳水化合物前体合成葡萄糖的途径。它本质上是糖酵解的逆转，替代途径略有变化^[11]。当脱脂后其参与的通路还有n-聚糖生物合成以及淀粉和蔗糖代谢均被降低，因此脱脂牦牛乳会降低机体的淀粉、蔗糖以及聚糖等碳水化合物的合成以及新陈代谢。

不仅如此脱脂后还会降低机体的患高血脂、高血压等心脑血管疾病的风险，具体影响通路为cGMP-PKG信号通路、补体和凝血级联反应以及肾素-血管紧张素系统，具体表现为：环鸟苷酸（cGMP）是介导一氧化氮（NO）和利钠肽（NPs）作用的细胞内第二信使，调节一系列广泛的生理过程；升高的细胞内cGMP水平通过两种形式的cGMP依赖性蛋白激酶（PKG）、cGMP调节的磷酸二酯酶（PDE2、PDE3）和cGMP门控阳离子通道发挥其生理作用，其中PKGs可能是主要的介质。已确定底物的PKG1亚型特异性激活导致胞质钙浓度降低和/或肌丝对Ca2+的敏感性降低（Ca²⁺脱敏），从而导致平滑肌松弛。在心肌细胞中，PKG直接磷酸化瞬时电位受体规范通道家族的成员TRPC6，脱脂后会抑制这种非选择性离子通道的Ca²⁺电导、G-α-q激动剂诱导的NFAT激活和肌细胞肥大反应。PKG还打开线粒体ATP敏感性K⁺（mitoKATP）通道，随后ROS的释放触发心脏保护。

除以上原因外补体系统在心脏保护方面也起到重要作用。补体系统是血浆中的蛋白水解级联系统，也是先天免疫的介质，先天免疫是针对病原体的非特异性防御机制。补体激活有三种途径：经典途径、凝集素途径和替代途径。所有这些途径产生关键的酶活性，进而产生补体的效应分子。补体激活的主要结果是病原体的调理作用、炎症和免疫活性细胞的募集以及病原体的直接杀伤^[21]，脱脂后牦牛乳中蛋白则会增加这种“效应分子”的产生。血液凝固是另一系列酶原到丝氨酸蛋白酶的转化，最终形成凝血酶，这种酶负责将可溶性纤维蛋白原转化为不溶性纤维蛋白凝块。蛋白酶激活的受体，如由凝血酶激活的受体，是G蛋白偶联受体的成员，并作为先天免疫的介质^[22]。脱脂后能刺激激肽释放酶-激肽，此系统是一种内源性代谢级联，其触发导致血管活性激肽（缓激肽相关肽）的释放。激肽肽参与许多生理和病理过程，包括血压和钠稳态的调节、炎症过程和预处理的心脏保护作用。

而在心血管方面起到重要的重要通路为肾素-血管紧张素系统（RAS），它是一种肽能系统，具有调节血压和水电解平衡的内分泌特征。在经典的RAS中，肾素酶切割其底物血管紧张素原（Agt），形成十肽血管紧张素I，该十肽血管紧张素I又被血管紧张素转化酶（ACE）切割，产生血管紧张素II（Ang II），血管紧张素II是该系统的关键角色。Ang II激活其AT1受体（AT1R），AT1R是介导Ang II在肾脏中的大多数已知作用的主要受体，包括血管收缩、肾钠（Na⁺）重吸收和醛固酮分泌，从而增加血压并促进高血压的发展^[23]。

综上所述食用脱脂牦牛乳后机体在消化吸收时脱脂牦牛乳不仅会降低机体的淀粉、蔗糖以及聚糖等碳水化合物的合成以及新陈代谢，还会降低机体的患高血脂、高血压等心脑血管疾病的风险。很显然脱脂后的牦牛乳饮用起来会对身体更加健康，尤其是对一些特定人群引用会更加合适，但不好的是脱脂后会对牦牛乳的提供给机体的能量以及营养功能降低，且脱去脂肪后的牦牛乳口感也会降低。

4 结果

通过对蛋白组学分析我们发现经过脱脂后牦牛乳蛋白的功能以及蛋白组学的变化：质控结果显示牦牛乳中大部分蛋白对应两个以上肽段，大部分蛋白的覆盖度在30%以下，牦牛乳蛋白的分子量主要集中在10~90 kDa，其它不同阶段均有，且分布均匀；牦牛乳蛋白的在功能差异性数量上的变化结果为：共有231种蛋白功能被上调，134种蛋白功能被下调；对这些差异蛋白进行不同级别上的功能分类GO注释发现样品均集中参与细胞过程、代谢过程、生物调节等21种过程；亚细胞结构结构分类共有7种，分别为细胞外（34.33%）、细胞质（31.34%）、线粒体（8.96%）、膜血浆（7.46%）、核（6.72%）、细胞质、细胞核（5.97%）、内质网（2.99%）；COG/KOG功能分类统计发现参与细胞过程和信号传导、新陈代谢、代谢作用等21种功能。具体功能上变化为上调：核糖体（Ribosome）、cGMP-PKG信号通路（GMP-PKG signaling pathway）、缝隙连接（Gap junction）、长期抑郁（Long-term depression）、胰岛素分泌（Insulin secretion）、脂肪细胞中脂肪分解的调节（Regulation of lipolysis in adipocytes）等通路；会下调：糖酵解/糖异生（Glycolysis / Gluconeogenesis）、淀粉和蔗糖代谢（Starch and sucrose metabolism）、n-聚糖生物合成（N-Glycan biosynthesis）、各种类型的N-聚糖生物合成（Various types of N-glycan biosynthesis）、溶酶体（Lysosome）、还会对内质网中的蛋白质加工（Protein processing in endoplasmic reticulum）、补体和凝血级联反应（Complement and coagulation cascades）、肾素-血管紧张素系统（Renin-angiotensin system）。这些蛋白功能的上的变化使牦牛乳蛋白在脱脂后机体在消化吸收时牦牛乳蛋白时会降低机体的淀粉、蔗糖以及聚糖等碳水化合物的合成以及新陈代谢，更会降低机体的患高血脂、高血压等心脑血管疾病的风险。

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基金资助

西藏农牧学院研究生教育创新计划项目“不同热处理牦牛乳蛋白氧化规律与消化特征分析”(YJS2022-34)

西藏农牧学院-西北农林科技大学联合项目(XNLH2022-03)