西藏牦牛源牛支原体病本种动物模型的建立

Establishment of Animal Model of Bovine Mycoplasma from Yaks in Tibet

摘要

为了在高原环境下建立牦牛源牛支原体病本种动物模型。采用鸡胚、家兔、犊牦牛对牛支原体进行菌株复壮效果验证，并将3个复壮株分别进行犊牦牛回归试验；通过临床症状观察、病理组织学观察等方法，以评价牦牛源牛支原体病动物模型效果，明确鸡胚、家兔能否作为牛支原体的复壮载体。结果显示，3个不同载体复壮株接种犊牦牛后，均出现体温升高、咳嗽、流涕、体重增长缓慢等临床症状，呈间歇性排菌，第7 d可检测到牛支原体抗体，且持续存在。剖检发现其肺组织呈现不同程度的损伤，主要以弥散性充血、出血、淤血、干酪样坏死为主要特征，病理组织学发现肺泡出现萎缩、塌陷，肺泡壁增厚，部分炎症细胞浸润等病理变化。本试验证明鸡胚、家兔均可作为牛支原体的复壮载体，且成功建立了牦牛源牛支原体病本种动物模型。

Abstract

In order to establish a native animal model of Mycoplasma bovis infection derived from yaks in high-altitude plateau environment, we conducted strain rejuvenation validation experiments using chicken embryos, rabbits, and calf yaks. Subsequently, the three rejuvenated strains were tested through regression experiments in calf yaks. Clinical symptoms, pathological histology, and other methods were employed to assess the effectiveness of the yak-origin Mycoplasma bovis animal model and to determine whether chicken embryos and rabbits could serve as suitable rejuvenation vectors for Mycoplasma bovis. The results revealed that following inoculation of calf yaks with the three different rejuvenated strains, clinical symptoms such as elevated body temperature, coughing, nasal discharge, and slow weight gain were observed. These symptoms were accompanied by intermittent shedding of Mycoplasma bovis, and the presence of Mycoplasma bovis antibodies was detectable as early as the 7th day and persisted. Post-mortem examinations demonstrated varying degrees of lung tissue damage, characterized primarily by diffuse congestion, hemorrhage, congestion, and caseous necrosis. Histological analyses revealed pathological changes in lung alveoli, including atrophy, collapse, thickening of alveolar walls, and infiltration of inflammatory cells. This study confirmed that both chicken embryos and rabbits effectively served as rejuvenation vectors for Mycoplasma bovis. Furthermore, it successfully established a native animal model of Mycoplasma bovis infection derived from yaks, suitable for research in high-altitude plateau environments.

Graphical abstract

关键词

牦牛 / 牛支原体 / 复壮载体 / 动物模型

Key words

Yaks / Mycoplasma bovis / ejuvenate / animal model

支原体（Mycoplasma）是一类能在无细胞人工培养基中生长繁殖的最小微生物，因其无细胞壁，细胞柔软，故呈高度多形性，可通过细菌滤器。广泛分布于污水、土壤、植物、动物和人体中，有30多种对人或畜禽具有致病性。其中致病性支原体常定居于多种动物呼吸道、泌尿生殖道、消化道粘膜表面以及乳腺、眼等部位。单独感染时一般无临床表现或症状轻微，当与其他病原微生物混合感染、继发感染或受外界因素干扰时，可引发多种疾病。其中对牛具有致病性的支原体包括牛支原体（Mycoplasma bovis）、牛眼支原体（Mycoplasma bovoculi）、殊异支原体（Mycoplasma dispar）和牛鼻支原体（Mycoplasma bovirhinis）等^[1,2]。该成员均结构简单，细胞膜由典型的3层膜结构组成，可通过0.45 μm的细菌滤器，加压条件下可通过0.22 μm的细菌滤器。其中牛支原体通常存在于牛的呼吸道和生殖道，其致病力仅次于丝状支原体亚种^[3]。

牛支原体首次于1961年由Hale等^[4]从患乳房炎的牛乳中分离获得，我国曾在1983年由陈嘉棣等^[5]首次从患乳腺炎病牛和哺乳犊牛鼻拭子上分离获得。直至2008年，我国部分地区出现了以坏死性肺炎为主要特征的“传染性牛支原体肺炎”疫情，后经研究证实该病为牛支原体所致 ^[6-7]，随后牛支原体病越来越受到人们的重视。牛支原体可以导致奶牛乳腺炎、怀孕母牛流产、犊牛肺炎、关节炎和中耳炎^[8-9]。单独感染一般不表现临床症状，当与多杀性巴氏杆菌（Pasteurella multocida）、溶血性曼氏杆菌（Mannheimia haemolytica）、牛呼吸道合胞体病毒（Bovine respiratory syncytial virus）、牛疱疹病毒1型（Bovine herpesvirus 1）、牛病毒性腹泻病毒（Bovine viral diarrhea virus）以及副流感病毒3型（Bovine parainfluenza 3 virus）等病原体混合感染或继发感染时，可引起牛呼吸系统综合征（Bovine respiratory disease complex，BRDC），给养牛业造成了严重的经济损失^[10-12]。

目前，许多学者以鸡胚、家兔、小鼠、犊牛作为试验动物，进行了临床感染试验研究。范媛等^[13]曾研究了牛支原体分离株对鸡胚和小鼠的致病性试验，结果发现牛支原体可以100%感染鸡胚，并且不同毒株对鸡胚的致死率差异极显著，小鼠在接种牛支原体后，仅出现一定程度的体重增长抑制，但并未出现呼吸道临床症状与肺脏病理损伤，也不能在小鼠体内分离到牛支原体。由此可见，小鼠不能作为牛支原体感染的动物模型。史晓娜等^[14]以家兔作为牛支原体感染对象进行致病性试验，结果发现家兔接种牛支原体后主要表现为精神沉郁、饮食欲下降等症状；剖检可见肺脏萎缩、有出血点、部分肺组织坏死，并在肺脏及气管粘液上成功分离到牛支原体。试验结果表明，通过家兔成功构建了牛支原体病临床病例。截至目前，世界范围内还没有被大家公认的牛支原体病动物模型，本试验通过牛支原体不同载体复壮株进行犊牦牛临床致病性试验，以评价鸡胚、家兔能否作为牛支原体的复壮载体，进而在高原环境下成功构建牛支原体病动物模型。

1 材料和方法

1.1 菌株来源与扩繁

T6株为西藏牦牛源牛支原体分离株，由本团队从患有呼吸道症状的牦牛体内分离获得，并已鉴定^[15]。试验前取T6株以1:10的比例接种PPLO液体培养基^[16]培养至1×10⁹ CCU/mL，4 ℃备用。

1.2 试验动物

21头6月龄健康犊牦牛（购自西藏林芝牦牛养殖基地），10枚9日龄鸡胚，4只4月龄健康家兔（购自西藏林芝鸿宇养殖有限公司）。

1.3 主要试剂

牛支原体抗体ELISA检测试剂盒购自Bio-X Diagnostics公司；PPLO Broth、Bacto Ager、Agar、Yeast Extract 均购自BD公司；Sodium pyruvate 购自SIGMA公司；苯酚红购自国药集团化学试剂有限公司；MEM购自GIBCO公司；青霉素钠购自山东聖旺药业股份有限公司；氢氧化钠购自天津市致远化学试剂有限公司；琼脂购自BD公司；马血清购自HYCLONE公司；2xTaq PCR MasterMix、Marker DL2000、核酸染料均购自天根生化科技（北京）有限公司。

1.4 引物的设计与合成

牛支原体特异性基因uvr C上游引物序列为：5’-TAATTTAGAAGCTTTAAATGAGCGC-3’，下游引物序列为5’-CATATCTAGGTCAATTAAGGC TTTG-3’。按照以下PCR反应条件进行PCR扩增：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性45 s；55 ℃退火 1 min；72 ℃延伸30 s；30个循环，72 ℃延伸 10 min。

1.5 菌株复壮及分离

将1×10⁹ CCU/mL 的T6复苏菌液尿囊腔接种发育良好的9日龄鸡胚，0.2 mL/胚，接种5 d后取尿囊液接种至PPLO液体培养基进行病原分离。家兔以滴鼻的方式接种上述菌液1 mL/d，连续接种3 d，接种18 d后剖杀家兔，采集肺脏进行病原分离；犊牦牛以气管+滴鼻的方式接种上述菌液10 mL+ 5 mL，连续接种3 d，接种后6~11 d采集犊牦牛鼻拭子进行病原分离；阴性对照按上述方式接种等量液体培养基。获得的分离株分别命名为T6-JP株、T6-JT株、T6-MN株。

1.6 动物感染试验

试验前，对20头试验牛进行牛支原体抗原、抗体检测^[18]，结果均为阴性且无临床症状者，随机分为4组，分别为T6-JP组、T6-JT组、T6-MN组和对照组，前三组分别以气管+滴鼻的方式接种1×10⁹ CCU/mL的T6-JP株、T6-JT株、T6-MN株10 mL+ 5 mL，对照组仅接种等量液体培养基。

1.7 临床症状观察

攻毒后定期对各试验牛进行直肠体温检测，精神状态、眼鼻分泌物、咳嗽、呼吸和关节等临床症状进行观察；并在攻毒前及剖杀前用电子秤对各试验牛进行称重。

1.8 排菌情况检测

攻毒结束后，隔日采集试验牛鼻拭子进行牛支原体特异性基因uvr C检测。

1.9 血清抗体检测

攻毒后每周采血1次，分离血清，用牛支原体抗体ELISA检测试剂盒进行血清抗体检测，以天数为横坐标，D450值为纵坐标绘制曲线。

1.10 病理剖检及病理组织学观察

攻毒后第28 d剖杀试验牛，观察各脏器损伤情况，并进行眼观大体病变评分，结果见表1^[19]。采集各试验牛1 cm³的肺脏组织，立即放入10%中性福尔马林固定液中，然后送至公司进行病理组织切片制备，光学显微镜下观察组织病理变化。

1.11 脏器指数评价

剖杀各试验牛后，取各脏器进行称重并进行脏器指数测定。脏器指数=脏器重/体重×100%。

1.12 病原分离与鉴定

剖杀后分别取心、肝、脾、肺、肾、气管接种至固体培养基进行病原分离培养，并进行uvr C基因检测。

2 结果

2.1 临床症状观察

攻毒后，各试验牛均出现不同程度的精神沉郁、饮食欲下降、流鼻涕、咳嗽等症状，结果见图1。T6-MN组的症状症状最为明显，第7 d部分出现短暂剧烈咳嗽；第8 d全部出现呼吸频率加快和咳嗽症状，随着时间的延长，眼角出现脓性分泌物，并伴有流涕现象，开始为浆液性鼻液，严重者出现黏脓性鼻液。T6-JP组第8 d开始出现咳嗽、流涕症状。而T6-JT组第10 d才开始出现呼吸急促、伴有少量浆液性鼻液症状。对照组均未见上述临床症状。

2.2 体温检测结果

攻毒后第6 d开始，攻毒组均呈现体温持续升高，至第8 d或第9 d达到峰值，然后开始下降，至第11 d体温基本恢复正常，结果见图2。T6-MN组、T6-JT组第8 d体温达到最高，分别为39.9 ℃、39.6 ℃，T6-JP组第9 d体温达到最高39.5 ℃，但各组均在第11 d体温基本恢复正常；对照组无明显体温波动。

2.3 增重变化趋势

对各组试验牛体重变化趋势研究发现，3个攻毒组体重增长受到了不同程度的影响。T6-JP组、T6-JT组、T6-MN组体重增加比例较NC组均差异显著（P<0.05），三个攻毒组间差异均不显著，结果见图3。

2.4 排菌情况检测结果

攻毒结束后第6 d开始，隔日采集试验牛鼻拭子，进行牛支原体特异性基因uvr C检测，结果见表3。T6-MN组、T6-JT组、T6-JP组平均阳性率分别为50.08%、40.00%、46.15%。其中试验牛攻毒6 d内所有试验牛均为阳性，随后随时间的延长，各试验牛呈现间歇性排菌；其中T6-MN组第8 d有2头牛未见排菌，并在第10~12 d出现重新排菌，间歇期最长达4 d；T6-JP组中1头牛第8 d停止排菌，至第14 d出现重新排菌，间歇期达6 d；T6-JT组中3头牛排菌间歇期超过6 d。对照组始终未检测到牛支原体。T6-MN组排菌时间长达24 d，而T6-JP组和T6-JT组分别为22 d、20 d，但24 d后所有试验牛均不再排菌。

2.5 血清抗体检测结果

用牛支原体抗体ELISA检测试剂盒进行检测攻毒前后各试验牛的血清抗体水平，以D 450值为纵坐标绘制曲线，结果见图3。3个攻毒组均在攻毒后第7 d的血清中检测到抗体，且在剖杀前持续检测到抗体；T6-JP组在第21 d血清抗体相对值达到最高，T6-JT、T6-MN均在第14 d血清抗体水平达到最高；第28 d血清抗体水平均有下降趋势；NC组始终未检测到牛支原体抗体。

2.6 剖检病变结果

攻毒后第28 d分别剖杀各试验牛，观察其病理变化，结果见图5。评分结果见图6。第28 d T6-MN组肺脏损伤与NC组相比大体病变得分显著增加（P<0.05）最为严重，表面呈现弥散性充血、出血，甚至形成出血斑，切开可见大理石样花纹，胸腔内有少量渗出液；与NC组相比大体病变得分显著增加（P<0.05）。T6-JT组主要以肺脏颜色苍白为主、偶而出现出血点或形成出血斑；与T6-MN组相比无显著性差异（P>0.05）。T6-JP组与T6-JT组评分结果相似与T6-MN组相比无显著性差异（P>0.05）。对照组肺脏呈粉红色，未发现异常。

2.7 病理组织学观察结果

通过病理组织学观察发现，NC组肺组织未见实质化，间质内有少量红细胞浸润，未见异常病变，如图A所示。T6-JP组肺组织结构中度异常，大量肺泡萎缩，塌陷，肺泡壁增厚，肺组织实质化，间质内有部分红细胞浸润，少量细胞可见明显空泡化，可见有部分炎症细胞浸润，如图B所示。T6-JT组肺组织结构中度异常，大量肺泡萎缩，塌陷，肺泡壁增厚，肺组织可见明显纤维化，肺组织可见大量水肿，间质内有部分红细胞浸润，肺组织被膜可见明显增厚，可见有大量炎症细胞浸润，如图C所示。T6-MN组肺组织结构重度异常，大量肺泡萎缩，塌陷，肺泡壁增厚，肺组织可见大量纤维化，部分区域明显坏死，间质内有少量红细胞浸润，大量细胞可见明显空泡化，可见有大量炎症细胞浸润，如图D所示。结果见图7。

2.8 脏器指数评价结果

剖杀各试验牛后，根据其脏器指数的变化情况，可以判断牛支原体对脏器病变的影响程度，攻毒组与NC组心脏指数、肝脏指数、肾脏指数差异均不显著（P>0.05），表明牛支原体未对心、肝、肾造成损伤；攻毒组肺脏指数、脾脏指数与PC组差异显著（P<0.05），表明犊牦牛复壮株对肺脏、脾脏造成一定损伤。结果见表3。

2.9 病原分离与鉴定

第28 d剖杀后分别采集心、肝、脾、肺、肾、气管进行病原分离；3个攻毒组气管和肺脏分别接种于PPLO固体培养基，37 ℃ 5%CO₂培养72 h，形成肉眼可见针尖大小的白色菌落，低倍镜下呈“煎蛋样”菌落。通过牛支原体uvr C特异性基因检测，结果均为阳性，但对照组均未分离到“煎蛋样”菌落，且uvr C检测结果均为阴性，结果见图8-9。

3 讨论

李明霞等^[20]报道的牛支原体可通过特定受体黏附于呼吸道上皮细胞，实现其在宿主局部的定植，同时释放代谢产物与毒素，直接损害宿主防御系统或诱导细胞凋亡，造成对宿主的感染。本试验采用犊牦牛气管+滴鼻的方式接种不同载体复壮株，各攻毒组均出现不同程度的临床症状；其中T6-MN组的临床症状最明显，攻毒后7~10 d内，攻毒组开始出现鼻腔黏膜黏液分泌增多、眼部分泌物增多、饮食欲下降，在第6~11 d体温明显升高，且在感染牛支原体后犊牦牛体重增长受到抑制，该结果与Mahmood等^[21]报道的自然感染病例和Zhang等^[22]人工感染病例的临床症状均相似。另外，牛支原体定植于上呼吸道黏膜表面的上皮细胞后，经气管、支气管停滞于细支气管终末分支的黏膜上，可引起原发性病灶^[23]。本试验第28 d剖杀试验牛，其肺脏以弥散性充血、出血、局灶性坏死、胸腔积液增多、干酪样坏死为其特征，该结果与王展慧等^[24]研究结果相似；Hermeyer等^[25]发现，牛支原体在动物体内产生的过氧化氢和来自白细胞的活性氧和活性氮可能会导致宿主形成严重且典型的肺部干酪样损伤，本试验也产生相似症状。病理组织学观察发现攻毒组肺组织主要出现结构异常，肺泡有萎缩、塌陷，肺泡壁增厚，肺组织实质化，间质内有部分红细胞浸润；细胞明显空泡化；有部分炎症细胞浸润等病理变化。脏器指数检测表明，牛支原体对试验牛肺脏造成了不同程度的损伤，攻毒组脾脏指数显示，牛支原体感染犊牦牛后会产生强力的免疫反应，对心脏、肝脏、肾脏均未造成损伤。

通过鼻拭子抗原检测发现，排菌率3个攻毒组几乎没有差异，通过对各试验组排菌分析发现，攻毒后各组均出现间歇性排菌，其中T6-MN组最长间歇期为4 d，而T6-JT组、T6-JP组最长间歇期可达6 d，随后再次进入排菌期，至第24 d后所有试验牛不再排菌，该结果与刘重阳等^[26]的试验结果相似。由此可见，牛支原体感染后第6 d及12~14 d排菌率最高，这为今后选择合适的采样时间及制定防控措施提供依据。人工感染牛支原体的动物能产生较高水平的牛支原体特异性抗体，本试验中，3个攻毒组均在攻毒后7 d检测到血清中存在牛支原体抗体，至少持续28 d以上，且鸡胚复壮株产生的抗体水平高于牦牛复壮株，为今后牛支原体疫苗的研究提供了参考。第28 d采集试验牛的不同器官进行牛支原体的分离，除了肺脏和气管以外其它脏器均未分离到牛支原体，证明牛支原体主要侵害肺脏和气管。晁金等^[27]研究发现牛支原体HB0801株接种1月龄断奶犊牛，并在28 d剖杀，可在脾脏和肾脏中检测出牛支原体。本试验除了气管和肺脏外，在心、肝、脾、肾组织中均未检测到牛支原体。由此可见，牛支原体的致病性强弱除了与菌株毒力的强弱有关以外，还与感染动物年龄密切相关，这为预防和治疗牛支原体引起的疾病提供了帮助。通过以上数据表明，3个不同载体复壮菌株中，牦牛复壮株的致病性强于其他2个复壮株，但鸡胚、家兔两个复壮株均引起相应的临床症状与病理变化，可以作为牛支原体菌株复壮的载体。

综上所述，本试验结果显示，鸡胚和家兔较犊牦牛可以作为牛支原体菌株的复壮载体；不同载体复壮株回归本种动物后，也间接证明了鸡胚和家兔可以作为牛支原体病的动物模型。但对其动物模型的评价方法及标准还有待于进一步研究确定。该试验结果不仅为西藏牦牛源牛支原体病的治疗与防控奠定了基础，也为今后牦牛源牛支原体的致病性以及候选疫苗的安全性、稳定性研究提供理论依据。

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基金资助

西藏自治区重点研发计划项目(XZ202001ZY0046N)

财政部和农业农村部“国家现代农业产业技术体系”项目(CARS-37)