西藏雪灵芝根际固氮菌的分离与鉴定

Isolation and Identification of Azotobacter in the Rhizosphere of Arenaria brevipetala

摘要

雪灵芝是藏东南色季拉山珍稀药用植物，其根际固氮菌对于雪灵芝适应高寒环境具有重要意义。本文利用Ashby无氮液体培养基对采自色季拉山的雪灵芝根际土样进行固氮菌的富集培养，把富集培养液涂布于Ashby固体培养基来分离固氮菌，并依据形态学指标和生理生化指标对所分离到的固氮菌初步鉴定。从西藏雪灵芝根际土壤样品中分离到2株固氮菌，分别编号为LZ-Azo1和LZ-Azo2，并保存菌种。根据菌落特征、菌体形态及生理生化指标，对这2株固氮菌进行了鉴定，LZ-Azo1为圆褐球固氮菌（Azotobacter chroococcum），而LZ-azo2为链霉菌属（Streptomyces sp.）。分离到的2株固氮菌皆属于自生固氮菌，有助于西藏雪灵芝在高寒环境中获取氮源，对其适应高寒环境至关重要。

Abstract

Arenaria brevipetala is a rare medicinal plant in Sejila Mountain of southeast Tibet, and its rhizosphere azotobacter is of great significance for Arenaria brevipetala to adapt to alpine environment. In this paper, nitrogen free liquid medium of Ashby was used to enrich and culture azotobacter in rhizosphere soil samples of Arenaria brevipetala mat collected from Sejila Mountain, and the enriched medium was coated in Ashby solid medium to isolate azotobacter. The isolated azotobacter was preliminarily identified according to morphological and physiological and biochemical indexes. Two strains of azofixing bacteria, numbered LZ-Azo1 and LZ-Azo2, were isolated from rhizosphere soil samples of Arenaria brevipetala in Tibet and were preserved. The two strains of azofixing bacteria were identified according to colony characteristics, cell morphology, physiological and biochemical indexes, and LZ-Azo1 was a round brown ball azofixing bacterium, LZ-azo2 belonged to Streptomyces. The two strains of azotobacter isolates were all autogenous azotobacter, which was helpful for Arenaria brevipetala of Tibet to obtain nitrogen sources in the alpine environment and was crucial for its adaptation to the alpine environment.

Graphical abstract

关键词

雪灵芝 / 固氮菌 / 根际微生物 / 菌种鉴定

Key words

Arenaria brevipetala / nitrogen-fixing bacteria / rhizosphere microorganism / strain identification

植物促生菌（Plant Growth-Promoting Bacteria，PGPB）是通过促进植物对矿物成分的吸收和利用，并对植物病原菌进行抑制从而对植物的生长起到促进作用的植物益生菌。植物促生菌通过产生生长激素、生物固氮、溶解矿质元素、抑制植物病原菌、产生铁载体等促进植物的生长^[1]。生活于植物根系或根际土中的植物根际促生菌（Plant Growth-Promoting Rhizobacteria，简称PGPR）又是主要的植物促生菌类型。一般土壤根际细菌有2% ~ 5%属于PGPR，包括许多种类，如荧光假单胞菌（Pseudomonas fluorescens）、芽胞杆菌属（Bacillus）、黄单胞菌属（Xanthomonas）、慢生型根瘤菌属（Bradyrhizobium）、克雷伯氏菌属（Klebsiella）、黄杆菌属（Flavobacteria）、固氮螺菌属（Azospirillum）、固氮菌属（Azotobacter）等。其中固氮菌属为固氮菌科的革兰氏阴性杆菌，有荚膜、无芽孢、能形成厚壁孢囊，可自生固氮。氮元素是植物生长所需的大量元素，氮源为植物生长的限制性养料，植物根际自生固氮菌可为植物提供氮源。生物固氮皆由原核生物完成，按固氮活动与其他生物的关系分为自生固氮菌、共生固氮菌和联合固氮菌三类。生物固氮是仅次于光合作用的第二重要的生物代谢类型^[2]。因此，一直是生命科学研究的热点问题。国内科学家对固氮菌也进行了广泛的研究。王慧桥等从海盐土中分离自生固氮菌并鉴定，还研究了其对玉米细菌生长状况的影响^[3]。成艳红等从红壤中分离到一株自生固氮菌并对其固氮能力进行了评估^[4]。李凌凌等将筛选到的固氮菌用于制备复合型菌肥^[5]。

植物根际是受植物根系影响最深的土壤范围，在距根1~2 mm内的土壤由于受到根系分泌物和脱落物的影响，其微生物类群即根际微生物（rhizosphere microbe）极为独特，也其植物的关系也最为密切。根际微生物的研究也是微生物学家较为关注的热点。本文研究了雪灵芝根际微生物中的固氮菌。雪灵芝（Arenaria kansuensis Maxim.）为石竹科（Caryophyllaceae）无心菜属（Arenaria）多年生垫状草本植物，是重要中药药用植物之一，生长于海拔4 200 m至5 200 m高山草甸、碎石带、砂地等高寒环境。雪灵芝藏语叫阿仲尕布，被藏族同胞称为人间仙草，全草可入药，具有清热解毒、提高人体免疫力的作用，对胃肠溃疡、黄疸、流感等有一定的治疗作用^[6]。本文从藏东南的色季拉山雪灵芝根际土壤中分离到2株自生固氮菌，对于雪灵芝适应高寒环境可能有一定的帮助。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 药品

甘露醇、蔗糖、苹果酸、KH₂PO₄·H₂O、K₂HPO₄·H₂O 、MgSO₄·7H₂O、CaSO₄、CaCO₃、NaCl、Na₂MoO₄·H₂O、FeCl₃产自洛阳昊华化学试剂有限公司；牛肉膏、蛋白胨、琼脂粉由北京奥博星生物技术有限责任公司生产。

1.1.2 土样

采自色季拉山雪灵芝植物的根际土（取3个土样），处理方法如下：将雪灵芝根系多余的土抖掉，当抖动根时，这些紧密附着于根的土粒不易脱落，被保留下来，就是根际土。然后将此带根际土10 g左右的根系放入准确测量体积的100 mL无菌水中，将根际土粒洗下，将根取出并用无菌水对根冲洗两次，做成土粒悬浮液，平均分成两份，其中一份用作梯度稀释，另一份于干燥箱内进行干燥，获得干土的重量，以便计算每克干土的微生物含量。

1.1.3 主要试剂与培养基

（1）阿须贝（Ashby）无氮液体培养基（富集培养用）：甘露醇10.0 g，KH₂PO₄·H₂O 0.2 g, MgSO₄·7 H₂O，NaCl 0.2 g，CaSO₄ 0.1g，CaCO₃ 5.0 g，定容至1 000 mL，pH为7.0～7.2，分装至100 mL三角瓶中，每瓶25 mL，121℃灭菌

15 min。

（2）Ashby固体培养基（用于分离固氮菌）：甘露醇10.0 g，KH₂PO₄·H₂O 0.2 g, MgSO₄·7H₂O，NaCl 0.2 g，CaSO₄ 0.1 g，CaCO₃ 5.0 g，加入琼脂粉15 g，定容至1 000 mL，pH为7.0～7.2，121 ℃灭菌15 min，冷至50 ℃左右倒平板。

（3）牛肉膏蛋白胨固体培养基：蛋白胨10 g，牛肉膏3 g，NaCl 5 g，1 000 mL蒸馏水，琼脂

15 g，pH7.2，121 ℃灭菌15 min，冷至50 ℃左右倒平板。

（4）改良DObereiner无氮液体培养基的主要成分（用于富集培养）：蔗糖10 g，苹果酸5.0 g，KH₂PO₄·H₂O 0.4 g，K₂HPO₄·H₂O 0.1 g，NaCl

0.1 g，Na₂MoO₄·H₂O 0.002 g，MgSO₄·7H₂O 0.2 g，FeCl₃ 0.01 g，定容至1 000 mL，pH7.0～7.2，121 ℃灭菌15 min。

（5）牛肉膏蛋白胨半态培养基：蛋白胨10 g，牛肉膏3 g，NaCl 5 g，1 000 mL蒸馏水，琼脂5 g，融化后分装试管，pH 7.2，121 ℃灭菌15 min，冷至50 ℃左右垂直放（不要摆斜面）。

1.2 固氮菌株的分离筛选

1.2.1 富集培养方法

取5 g根际土样用45 mL无菌水制成悬浊液，吸取5 mL悬浊液装入盛有25 mL Ashby无氮液体培养基和改良DObereiner无氮液体培养基两种富集液体培养基的100 mL三角瓶中，30 ℃下 180 rpm摇床振荡并进行恒温48 h进行加富培养。换新鲜培养基继续培养，重复4～5次后，稀释分离。

1.2.2 分离方法

从上一步培养了48 h的富集培养液中取出200 μL以涂布法接种于Ashby固体培养基上，30 ℃，48 h培养后选择典型的单一菌落进一步纯化，直至获得纯种，将纯化的菌接种至斜面培养基，取富集培养后的培养液，稀释涂布平板分离培养基。28 ℃培养2 d后，将在稀释度较大的平板上，生长较大的菌落移入斜面。培养后，保藏备用。

1.2.3 划线法纯化、保藏

将分离到的固氮菌菌株利用划线法进一步纯化，将纯化后的菌种分为两份，其中一份接种于肉汤固体培养基试管中，保存于4 ℃冰箱中；另一份在肉汤液体培养基的菌株发酵液加入甘油（要灭菌，用量为发酵液:甘油＝7:3）于-20 ℃冰箱中保存。

1.3 初步鉴定

1.3.1 形态学方法

1.3.1.1 菌落形态观察

将菌种用划线法分别接种于Ashby固体培养基和牛肉膏蛋白胨固体培养基上，培养24 h后，观察单菌落的形态，包括大小与形状、颜色、表面（光滑、粗糙、皱纹、同心环、辐射状等）、隆起（凸、凹、平）、边缘（光滑、锯齿状、波浪状、纤维状等）、硬度、透明度等特征。

1.3.1.2 菌体形态

将培养24 h的固氮菌菌株挑取、涂片于载玻片上，革兰氏染色后，在显微镜油镜下观察并描述其形态特征。主要指标有革兰氏染色阳性（紫色）或革兰氏阴性（红色）、菌体形状、大小、排列方式、有无芽孢等。

1.3.1.3 运动性

将分离到的固氮菌利用穿刺法接种于半固体培养基中，于30 ℃培养24 h后观察菌体在穿刺线上的生长情况，根据其生长情况作出其是否能够运动，进而判定其是否具有期待鞭毛。

1.3.2 生理生化法

选用培养24 h的菌体分别进行淀粉消解试验、吲哚试验、接触酶试验、甲基红试验、乙酸甲基甲醇试验，并记录试验结果。所用培养基及试剂见文献。

2 结果与分析

2.1 固氮菌菌株的分离

从雪灵芝根际土样中分离到2株固氮菌，编号为SJL-Azo-1和SJL-Azo-1分离图片见图1和图2。

2.2 菌株LZ-Azo-1和LZ-Azo-2的鉴定

2.2.1 形态特征

菌株LZ-Azo-1和LZ-Azo-2的菌落形态见图1和图2，菌体形态见图3和图4，革兰氏染色、菌落和菌体形态特征见表1。

从菌落形态和菌体形态可以初步判定，菌株LZ-Azo-1为产荚膜的双球菌，菌株LZ-Azo-2为一株放线菌。

2.2.2 菌株LZ-Azo-1及LZ-Azo-2生理生化特征

由于从菌落形态及菌体形态特征可以将2菌株初步判定为球菌和放线菌，其生理特征指标分别采用细菌和放线菌的指标进行研究，菌株LZ-Azo-1生理生化特征见表2，菌株LZ-Azo-2生理生化特征见表3。

根据《土壤微生物研究法》及《微生物学实验手册》，综合菌株的形态学特征及部分生理生化反应特征，将分离得到的2株自生固氮菌初步鉴定结果为：LZ-Azo1为圆褐球固氮菌（Azotobacter chroococcum），而LZ-azo2为链霉菌属（Streptomyces sp.）。

3 讨论

植物根际促生菌因其对宿主植物的具有明显的促生作用特别是对农作物有增产作用而倍受人们重视。因所分离菌种主要用于促进作物的生长增产，科研人员对根际菌的分离主要从作物根际土壤样品中进行。郭英等研究了野大豆根际促生菌，因其解磷、产IAA和产ACC脱氨酶等多功能促生作用，可显著提高大豆幼苗的茎、叶、根的干重^[7]。陈腊等从生长于我国东北黑土的玉米根际土中分离到5株合成生长素（IAA）、溶磷解钾、产铁载体等多功能促生菌，并利用玉米对其促生效果进行了检验，取得了良好效果^[8]。杨华等从水稻根围微生物394株中筛选到具有溶磷、固氮、产铁载体和IAA等促生功能的菌株6株，分别检测了它们对水稻种子的萌发、根系发育的促进作用，发现其中3株菌具有制备水稻微生物菌肥的潜力^[9]。本实验从高寒藏药植物雪灵芝根际土中筛选到2株固氮根际促生菌，可能会具有更强的耐受高寒环境的能力。还有从蔬菜植物根际筛选促生菌用于蔬菜的增产研究，如张垚等对辣椒根际促生菌筛选并发现其对辣椒种子萌发、幼苗的生长有明显促进作用^[10]。魏婷等从番茄根际分离到一株耐镉（Cd）鞘安醇单孢菌（Sphingomonas sp.），该菌株能够溶磷、产铁载体和吲哚乙酸，高Cd环境中能够促进番茄幼苗的生长，且不会使植株对Cd明显的积累^[11]。也有其他来源根际促生菌用于作物生长促进尝试的，吕朝阳等从互花米草根际土中筛选到一株分泌IAA和溶磷能力较强的菌株，通过菌株发酵液对番茄种子和幼苗实验，发现这株促生菌对番茄种子的萌发及细菌的生长有显著的促生活性^[12]。郭雨晴从荒漠珍稀植物中分到5株根际促生菌，具有固氮、溶磷等促生作用，对高粱幼苗均表现出促生作用^[13]。王慧桥等采用Ashby无氮培养基从滨海土壤样品中分离耐盐自生固氮菌^[14]。本实验利用Ashby无氮液体培养基和改良DObereiner无氮液体培养基两种富集液体培养所分离到的2株自生固氮菌，可能也会对其他植物的生长有促生作用。科研人员分离到的根际促生菌多数为细菌，本实验分离到的自生固氮菌LZ-Azo1为圆褐球固氮菌（Azotobacter chroococcum）为细菌，而LZ-azo2为链霉菌属（Streptomyces sp.）的放线菌。

在分离到根际促生菌的基础上，将根际促生菌做成微生物菌肥是一个具有实践意义的尝试。戚秀秀通过在水稻育苗基质中添加根际促生菌研发高效水稻育苗基质，研究发现根际促生菌应用于水稻育苗基质能够促进秧苗的生长并能够明显提高其代谢活性^[15]。代金霞等从盐碱区耐盐植物根际土壤110株细菌中分离到具解磷、产IAA、产ACC脱氨酶和铁载体等促生特性的根际促生菌11株，并将它们构建了9组复合菌群，以苜蓿和柳枝稷为促生对象，从中筛选出了高效促生微生物菌剂^[16]。蒋宝贵从华中农业大学农场试验田中分离的解磷解钾和自生固氮菌，利用分离到的4株植物促生菌制备了复合菌剂，该菌剂能够明显增加玉米的生物量^[17]。卢秉林等研究了自生固氮菌对春小麦的增产作用，以圆褐固氮菌 Azotobacter chroococcum beijerinck N45供试菌株进行盆栽试验，研究结果表明，该菌株对春小麦具有增产作用，同时还对氮肥的利用有促进作用；他们又对分离自小麦和玉米等作物的13株根际自生固氮菌对春小麦籽粒、生物量等的促进作用进行了研究，发现这些自生固氮菌对春小麦的增产效果明显，可以降低氮肥的施用量^[18-19]。姚阳阳比较了两类根际复配促生菌剂对传统中药材当归生长的影响，发现两种根际复配促生菌剂都能够提高当归的药效成分，以假单胞菌属为主的复配促生菌剂比芽孢杆菌属为主的复配剂促生效果要好^[20]。同样作为中药材的雪灵芝根际促生菌制成菌肥可能会对高寒环境中生长的中药材植物具有更佳的促生效果。本实验的结果为从高寒环境植物中分离筛选高效植物促生菌提供了参考。

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基金资助

国家自然科学基金(31960013)

西藏自治区科技计划项目(XZ202101YD0013C)

西藏农牧学院研究生教育创新计划项目(YJS2021-22)