西藏昌都传统发酵葡萄酒中酵母菌的分离鉴定及耐受性分析

Isolation, Identification and Tolerance Analysis of Saccharomyces Cerevisiae from Tibet Traditional Fermented Red Wine

摘要

以西藏昌都自酿葡萄酒为材料，采用稀释涂布平板法分离纯化酵母菌，根据菌落形态、镜检进行初步鉴定，并对真菌ITS区进行高通量测序。结果表明，共筛选得到4株酿酒酵母菌。乙醇、葡萄糖、pH、NaCl、SO₂耐受性分析发现，菌株M-4在葡萄糖质量分数为30%的YPD液体培养基中能快速启动发酵，同时能够耐受15%乙醇、pH 2.5、10 %NaCl、300 mg/LSO₂的发酵环境，菌株M-1、M-2、M-3次之。酿酒酵母M-4可作为酿造葡萄酒的开发菌株。

Abstract

In this study, Saccharomyces cerevisiae strains were isolated and purified from naturally fermented red wine in Chamdo, Tibet, using the dilution coating plate method. Initial identification was conducted based on colony and cell morphology, as well as high-throughput sequencing of the fungal ITS region. The results showed that a total of 4 strains of S. cerevisiae were isolated and purified. Further analysis of these strains' tolerance to ethanol, glucose, pH, NaCl, and SO₂ demonstrated that strain M-4 exhibited rapid growth in YPD medium containing 30% glucose. Moreover, it displayed the highest tolerance levels among the strains, with a maximum tolerance of 15% ethanol, pH 2.5, 10% NaCl, and 300 mg/L SO₂. Strains M-1, M-2, and M-3 followed in decreasing order of tolerance. In conclusion, strain M-4 exhibits favorable characteristics for wine fermentation and can be considered a promising candidate for the development of red wine production.

Graphical abstract

关键词

酿酒酵母 / 分离 / 鉴定 / 耐受性

Key words

Saccharomyces cerevisiae / isolate / identify / tolerance

毛葡萄（Vitis heyneana Roem. et Schult.）是葡萄属木质藤本植物，有舒筋活血、治疗跌打损伤、抗血栓功效^[1,2]。我国葡萄属植物种类资源丰富，占世界葡萄属植物种类的60%^[3]。昌都市位于藏东南地区，自然资源丰富，素有藏东南“水果之乡”“中国野生红葡萄之乡”之称，当地葡萄种植有近千年的历史，用野生葡萄酿酒已有300多年的历史。

葡萄酒的酿造是一个多种微生物代谢的过程，其中酵母菌发挥着重要作用，不仅参与乙醇代谢，还有风味物质代谢功能^[4,5]，因此酵母菌对葡萄酒的品质起着至关重要的作用^[6]。为了提高酒的品质，从水果自然发酵中分离酵母菌成为研究热点。张莉等^[7]对河南本地苹果园土壤、果实及表皮中的酿酒酵母菌株进行分离、鉴定、发酵实验，共获得8株有着较优发酵能力的酿酒酵母；杜刚等^[8]利用稀释平板涂布法从6种市售酒曲中分离出10株酵母菌，其中在菌株CK-03的发酵液中检测出25种挥发性成分，主要为酯类和醇类物质；高晓航^[9]从宁夏贺兰山东麓葡萄酒产区的葡萄果实表皮和根际土壤中共分离了9株酿酒酵母，且菌株HBN05整体耐受性好。杨雨蒙等^[10]从夏黑葡萄中分离出3株具有改良葡萄酒风味潜力的酵母菌。综上所述，酿酒酵母菌对发酵酒的风味和品质具有重要作用，本文以昌都野生毛葡萄发酵液为原料，通过可培养法分离、纯化酵母，并对其生长特性及耐受性进行分析^[11]，以期为本期葡萄酒的开发提供菌株支持。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 材料

以西藏昌都地区野生毛葡萄发酵液为实验材料。

1.1.2 试剂

酵母膏：北京奥博星生物技术有限责任公司；葡萄糖：天津市大茂化学试剂厂；琼脂粉：天津市大茂化学试剂厂；氯化钠、无水乙醇、柠檬酸、亚硫酸：天津市北方天医化学试剂厂。

1.1.3 培养基配制

YPD液体培养基：蛋白胨20 g、酵母膏10 g、蒸馏水定容至1 000 ml，115 ℃灭30 min。

PDA培养基：马铃薯200 g、葡萄糖20 g、琼脂粉18 g、蒸馏水定容至1 000 ml，自然PH，115 ℃灭菌30 min。

1.1.4 仪器与设备

SW-CJ-1C型双人双面净化工作台：苏州净化设备有限公司; JA2002电子天平：上海精天电子仪器仪器有限公司；UV-1800型紫外可见分光光度计：上海美谱达仪器有限公司；HZQ-F100全温振荡培养箱：太仓市实验设备厂；SHP-Ⅲ型生化培养箱：上海山连试验设备有限责任公司。

1.2 实验方法

1.2.1 酵母菌的分离纯化

用0.9％生理盐水将野生毛葡萄发酵液稀释至10^-2、10^-3、10^-4、10^-5[12]，用移液器分别吸取200 μl稀释液均匀涂布PDA培养基中，放置28 ℃培养48 h后挑选单一菌落进行镜检，筛选酵母菌，挑取具有酵母菌形态的菌落^[13]在PDA培养基中进行多次划线，将得到的酵母纯培养物接种PDA液体培养基中28 ℃震荡培养24 h，4 ℃冷藏备用^[14]。

1.2.2 ITS序列测定

以酵母菌基因组DNA为模板，用通用型引物ITS1：TCCGTAGGTGAACCTGCGG和ITS4：TCCTCCGCTTATTGATATGC对编码ITS基因进行聚合酶链式反应^[15]。

1.2.3 菌株活化与培养

将1.2.1保存的菌株接种于200 ml YPD液体培养基中，于28 ℃，180 r/s培养24 h。用血球计数板技术法将菌液浓度稀释至10⁶ 个/ml。

1.2.4 酿酒酵母菌生长曲线的测定

取1.2.3活化菌液（接种量1%）接种于YPD液体培养基，28 ℃振荡培养。分别测定6 h、10 h、14h、18 h、22 h、26 h、30 h、34 h、38 h、42 h、48 h时OD₆₀₀吸光度^[16]，上述实验重复3次，记录数据并绘制酵母菌生长曲线图。

1.2.5 NaCl耐受性测定

配制NaCl质量浓度为6%、8%、10%、12%、14%、16%的YPD液体培养基，取7 ml分装于放有倒置杜氏小管的10 ml试管中（杜氏小管充满液体培养基，无气泡）。 115 ℃灭菌30 min。用移液器吸取1.2.3活化菌液（接种量为1%）接种于上述培养基中，于28 ℃静置培养。每6小时观察杜氏小管内气体量并记录，直至杜氏小管不再产生气泡停止记录。

1.2.6 葡萄糖耐受性测定

配制葡萄糖质量浓度为5%、10%、15%、20%、25%、30%的YPD液体培养基，取7 ml分装于放有倒置杜氏小管的10 ml试管中（杜氏小管充满液体培养基，无气泡）。115 ℃灭菌30 min。用移液器吸取1.2.3活化菌液（接种量为1%）接种于上述培养基中，于28 ℃静置培养。每6 h观察杜氏小管内气体量并记录，直至杜氏小管不再产生气泡停止记录。

1.2.7 pH耐受性测定

配制YPD液体培养基，用柠檬酸溶液将pH值调节为2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0，取7 ml分装于放有倒置杜氏小管的10 ml试管中（杜氏小管充满液体培养基，无气泡）。115 ℃灭菌30 min。用移液器吸取1.2.3活化菌液（接种量为1%）接种于上述培养基中，于28 ℃静置培养。每6 h观察杜氏小管内气体量并记录，直至杜氏小管不再产生气泡停止记录。

1.2.8 乙醇耐受性测定

配制YPD液体培养，取7 ml分装于放有倒置杜氏小管的10 ml试管中（杜氏小管充满液体培养基，无气泡）。115 ℃灭菌30 min。冷却后，在超净工作台中添加无水乙醇，使乙醇终浓度分别为6%、9%、12%、15%、18%。用移液器吸取1.2.3活化菌液（接种量为1%）接种于上述培养基中，于28 ℃静置培养。每6 h观察杜氏小管内气体量并记录，直至杜氏小管不再产生气泡停止记录。

1.2.9 SO₂耐受性测定

配制YPD液体培养，取7 ml分装于放有倒置杜氏小管的10 ml试管中（杜氏小管充满液体培养基，无气泡）。115 ℃灭菌30 min。冷却后，在超净工作台中添加亚硫酸原液^[17]，使培养基中SO₂终浓度为50 mg/L、100 mg/L、150 mg/L、200 mg/L、250 mg/L、300 mg/L。用移液器吸取1.2.3活化菌液（接种量为1%）接种于上述培养基中，于28 ℃静置培养。每6 h观察杜氏小管内气体量并记录，直至杜氏小管不再产生气泡停止记录。

2 结果与分析

2.1 酵母菌的分离

从昌都地区自酿红酒中初步筛选得到4株酵母菌，分别编号为M-1、M-2、M-3、M-4，并对初步筛选得到的菌株在淀粉固体培养基上培养，以观察菌落特征和细胞形态。菌株菌落形态特征如表1和图1所示。

由图1和表1可知，4株酿酒酵母的菌落特征和细胞形态呈乳白色和白色，菌落扁平或凸起，菌落大小各异，表面光滑，具有粘性。细胞形态特征呈圆形和椭圆形，两端出芽或一端出芽（表1）

2.2 菌株耐受性测定

2.2.1 NaCl耐受性测定

由表2可知，随NaCl浓度升高，4种菌株的生长能力和产气能力呈逐渐降低的趋势。NaCl浓度为14%～16%时，4种菌株均不能生长，当NaCl浓度为12 %时，M-2、M-3、M-4菌株能微弱生长，M-1菌株不能生长；产气能力分析发现，M-3菌株不能产气，当NaCl浓度为6%～10%时，M-1、M-2、M-4产气能力较强。以上结果表明，M-2、M-4菌株在NaCl胁迫下能较好的生长和产气。

2.2.2 葡萄糖耐受性测定

菌株对葡萄糖耐受性测定结果如表3所示。糖是酒精发酵的原料，其浓度影响着发酵进行。伍保龙等 ^[18]研究表明酵母的发酵产酒精能力与初始葡萄糖浓度有明显关系。由表3可知，M-1、M-4菌株在10%～30%葡萄糖条件下均能较好的发酵生长且产气能力较强，M-2能生长但产气能力较弱；M-3菌株在10%～15%葡萄糖条件下可以微弱生长，当葡萄糖浓度超过20%时，M-3菌株无法生长。以上结果表明，M-1、M-4菌株在高葡萄糖浓度下有较强的适应能力。

2.2.3 pH耐受性测定

绝大多数酿酒酵母的最适pH在4.0～4.5之间，酿造葡萄酒时pH控制范围为3.0～3.6，因此会造成pH胁迫^[19]由表4可知，随pH值降低，菌株的生长能力和产气能力逐渐降低。M-1、M-4菌株在pH值3.5～5.0间能发酵产气，且pH 2.5条件下可以微弱生长;M-3菌株在pH 4.5～5.0可以微弱生长，但不能发酵产气。说明M-1、M-4菌株可以满足葡萄酒酿造过程中形成的低pH环境。

2.2.4 乙醇耐受性测定

由表5可知，4种菌株随乙醇浓度升高，产气能力和生长能力呈逐渐降低的趋势。在6%～12%乙醇浓度下，M-1、M-4菌株具有发酵产气能力，M-2和M-3菌株发酵产气能力较差或不产气；当乙醇浓度在15%时，M-4菌株仍具有发酵产气能力。发酵过程中产生的酒精会随着浓度的升高抑制酵母细胞的生长。综上，菌株M-4的乙醇耐受性能力符合酿造葡萄酒的要求。

2.2.5 SO₂耐受性测定

菌株对SO₂耐受性测定结果如表6所示。葡萄酒酿造时，适量添加SO₂有抑制微生物生长、防止葡萄汁氧化的作用^[20]。菌株M-1、M-4在SO₂质量浓度为300 mg/L的条件下能很好地生长，且M-4发酵产气能力强；SO₂质量浓度在100 mg/L时，菌株M-2能正常生长但发酵产气能力较弱；菌株M-3在50 mg/L微弱生长且不产气。

2.3 分子生物学鉴定

将筛选获得的4种菌株M-1、M-2、M-3、M-4分别在淀粉液体培养基中培养，并提取基因组。以基因组DNA为模板进行PCR扩增，PCR扩增结果如图2所示。由图2可知，ITS序列扩增结果在500 bp左右，条带清晰单一，符合测序要求。

2.4 菌株系统发育树分析

选取性状优良的M-4菌株，基于ITS序列构建系统发育树^[21-24],结果见图3。由图3可知，M-4菌株与酿酒酵母聚于一支。因此，综合菌落特征、细胞形态特征和分子鉴定，将M-4菌株鉴定为酿酒酵母。

2.5 酿酒酵母菌生长曲线的测定

不同温度条件下M-4菌株生长情况如图4所示。由图4可知，在23 ℃～31 ℃条件下M-4菌株生长启动速度显著高于19 ℃条件下菌株的生长启动速度，但42 h后OD₆₀₀值无显著变化。以上结果表明，M-4菌株最适生长温度在27 ℃左右，且低温（19 ℃）只影响酵母菌的生长速度，不影响其生物量。

3 结论与讨论

本实验从西藏昌都自酿红酒中共分离出4株酿酒酵母，通过对4株菌株进行耐受性测定发现，菌株M-4在葡萄糖质量分数为30%的YPD液体培养基中能快速启动发酵，同时能够耐受pH 2.5、10% NaCl、300 mg/LSO₂的发酵环境。随着酿酒酵母发酵时间的增加，乙醇含量也随之增加，张穗生等^[25]研究表明酵母的细胞壁、细胞膜的结构受酒精浓度的影响，较高的酒精含量会对酵母的生长产生毒害作用。在工业酿造葡萄酒中酒精度一般在10%~13% ^[26]，若发酵菌株在此酒精度范围中均有发酵能力，说明其乙醇耐受性能力符合酿造葡萄酒的要求。本实验分离出酿酒酵母M-4具有较强的乙醇耐受力，在酒精体积分数15%时仍能启动发酵。综上可得菌株M-4发酵性能优良，可以作为酿造红酒的开发菌株。

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基金资助

西藏自治区级大学生创新性实验训练计划(S20191069344)