一株青稞根际溶磷真菌的鉴定及其促生特性研究

Identification of an Inter-Rhizosphate Solubilizing Fungus of Barley and Its Probiotic Properties

摘要

本研究从青稞根际土壤中筛选出一株溶磷真菌，并研究其促生特性，为提高青稞产量提供优质真菌菌剂。采用梯度稀释分离法，利用PDA、RBM、NBRIP固体培养基培养，从健康青稞根际土壤中分离筛选溶磷真菌，通过形态学和ITS序列分析对其进行鉴定；采用NBRIP液体培养测定菌株对Ca₃（PO₄）₂的溶解能力；通过盆栽试验测定其对青稞的促生能力。 结果 （1）筛选出1株溶磷真菌菌株W41，将W41初步鉴定为毛茛葡萄孢盘菌（Botryotinia ranunculi）；（2）在NBRIP液体培养基中有效磷含量为55.82 mg/L，并兼具固氮、解钾、产IAA的能力；（3）通过皿内发芽试验得到孢子液浓度为1×10³ cfu/mL时青稞种子萌发生长效果最好；（4）盆栽试验中与对照相比，株高平均增加29.71%，根长平均增加28.69%，鲜重平均增加48.49%，干重平均增加39.12%，对青稞幼苗的促生效果显著。通过本研究，菌株W41具有较强的溶磷能力和促生效果，为利用真菌菌剂提高青稞产量提供了新的思路和方向。

Abstract

In this study, a phosphorus solubilizing fungus was isolated from the rhizosphere soil of barley plants, and its growth-promoting characteristics were investigated. The aim was to provide a high-quality fungal agent to enhance barley yields. The isolation process involved a gradient dilution method, and the fungus was cultivated on solid media, including PDA, RBM, and NBRIP, using healthy barley rhizosphere soil samples. The fungus's identification relied on morphology and ITS sequence analysis. Additionally, its ability to dissolve Ca₃(PO₄)₂ was assessed through NBRIP liquid culture, along with evaluations of nitrogen fixation, potassium solubilization, and IAA production. A pot experiment was conducted to determine the fungus's growth-promoting effects on barley. Key findings from the study included the successful isolation of a strain named W41, which exhibited strong phosphorus-solubilizing capabilities and was initially identified as Botryotinia ranunculi. In NBRIP liquid medium, the strain demonstrated an effective phosphorus content of 55.82 mg/L, along with nitrogen fixation, potassium solubilization, and IAA production abilities. The best germination and growth performance of barley seeds occurred when they were exposed to a spore liquid concentration of 1×10³ cfu/mL in dish germination tests. In potting experiments, strain W41 significantly increased the average plant height, root length, fresh weight, and dry weight of barley seedlings by 29.71%, 28.69%, 48.49%, and 39.12%, respectively, compared to the control group. This research underscored the substantial phosphorus-solubilizing and growth-promoting potential of strain W41, offering a promising avenue for enhancing barley yields through the application of fungal agents.

Graphical abstract

关键词

青稞 / 根际溶磷真菌 / 鉴定 / 促生

Key words

barley / rhizosphere solubilizing fungi / identification / promotion

磷元素是促进植物生长所必需的矿质元素之一，是植物生长发育的重要物质基础^[1]。磷在土壤中主要以有机和无机磷化合物的形式存在，其中无机磷占总磷含量的一半以上，以矿物形式存在，所以土壤中的可溶性磷含量非常低^[2]。在中国的农业土地中，有十分之七左右的耕地是缺磷的，土壤中绝大部分的磷都是很难被利用吸收，并且十分低效的^[3]。磷酸盐溶解微生物（PSMs）提供了一种生态上可接受的手段，将不溶性磷酸盐转化为可溶形式，使它们可供植物吸收。不溶性磷酸盐通过酸化、融合、交换反应和生成有机酸的过程被磷酸盐溶解微生物转化为有效形式^[4]。

目前，从植物根际土壤筛选得到的溶磷微生物主要包括细菌、真菌和放线菌，作为溶磷微生物的一部分，溶磷真菌的数量和种类远少于溶磷细菌，但其溶磷能力普遍高于溶磷细菌，溶磷真菌可以更有效地将土壤中植物难以利用的低效磷转化为植物可以利用的高效磷，并具有较强的溶磷遗传稳定性^[5]。近年来，由于耕地长期使用磷肥，大多数耕地土壤具有巨大的潜在磷储备，但只有一小部分磷可供作物生长发育^[6]。现已研究报道的溶解难溶无机磷能力较强的真菌主要有曲霉属（Aspergillus）和青霉属（Penicillium），而青霉属中的拜莱青霉（Penicillium bilaii）能显著提高土壤有效磷含量并促进多种作物产量的提高，是国际上普遍认可的溶磷效果非常好的溶磷真菌，应用该菌制成的溶磷微生物肥料已在加拿大被商业化生产^[7]。植物与根系中的微生物之间的相互作用和有益合作来调节根系中的磷效率，特别是利用溶磷真菌将土壤中不能被作物利用的低效磷转化为作物和植物都能利用的高效磷，是近年来的研究热点。Chatli等^[8]分离了溶磷青霉菌株FC28、FC39，对磷酸三钙的溶解量分别为136.9 mg·L^-1和103.3 mg·L^-1。许昌超等^[9]从土壤中筛选出一株青霉菌株P6，发现其不仅能够提高土壤中的有效磷含量，还能促进小白菜生长；薛应钰^[11]等人发现，从白刺根际土壤分离筛选出的一株溶磷能力强的草酸青霉真菌对番茄的促生作用十分显著。因此，研究土壤中微生物对土壤中磷的可用性的影响变得尤为重要^[10]，筛选更多具有溶磷作用的菌种类群，可为潜在磷的可利用性提供更多的菌种资源，不断挖掘高效溶磷真菌菌种资源具有重要意义和应用前景。本研究旨在从青稞根际土壤中筛选出具有高效溶磷能力并具有显著促生作用的的真菌菌株，以期为后续制备高效微生物菌剂提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 土壤来源

土壤样品于2022年3月取自西藏林芝市巴宜区西藏农牧学院农场（29.67201300°N，94.33951200°E）的青稞根际。选择健康的青稞，用铲子将植物连根挖出，抖落根上松散的土壤，将附着根际土的根装于无菌密封袋中，编号，保存于4 ℃的冰箱中，送到实验室进行分离。

1.2 培养基

（1）马铃薯固体培养基（PDA^[12]）；（2）孟加拉红培养基^[13]；（3）筛选培养基（NBRIP^[14]）；（4）固氮阿须贝培养基^[15]；（5）亚历山德罗夫培养基^[16]。

1.3 方法

1.3.1 根际土壤真菌的分离及溶磷真菌的筛选

（1）分别平板初筛

采用平板稀释培养法^[17]，将土壤样品稀释至10^-3、10^-4、10^-5倍，分别涂布在含有100 mg/mL链霉素和氯霉素的PDA、孟加拉红平板上，每个梯度重复3次，在25℃培养箱中培养2~5 d。挑取真菌菌落，纯化数次，接种于NBRIP平板上观察是否出现溶磷圈，若出现溶磷圈^[18]，再将该单菌落转接至斜面培养，保存于4 ℃冰箱中。

（2）三角瓶复筛

将所选菌株进行液体培养，确定孢子数为10⁷，再按1%的接种量接入以Ca₃（PO₄）₂为唯一磷源的NBRIP液体培养基中在25 ℃下，180 r/min摇床培养培养7 d，经10 000 r/min离心10 min，取上清液用钼锑抗比色法测定含磷含量^[19]。

1.3.2 溶磷真菌的鉴定

（1）溶磷真菌的形态学观察^[20]

将菌株接种于PDA液体培养基中，在25 ℃、180 r/min的摇床条件下培养24 h。吸取少量菌液后在PDA培养基上进行接种，于25 ℃培养箱中放置3 d，观察菌落的形态特征，同时通过电子显微镜进行观察。

（2）溶磷真菌的 ITS rDNA 序列鉴定

提取纯化后的菌株基因组DNA，以真菌rDNA-ITS通用引物ITS1（5’-TCCGTAGGTGAA CCTGCGG-3’）和ITS4（5’-TCCTCCGCTTA TTGATATGC-3’）进行扩增。将PCR扩增产物提交给生工生物工程（上海）股份有限公司进行测序。将测序后结果与NCBI（GenBank）数据库中进行BLAST同源性比对，并用MEGA 7.0构建菌株的系统发育树。

1.3.3 溶磷真菌促生能力的筛选

将所选出的溶磷菌株进行多种促生功能^[21]的测定，

（1）解钾^[16]：将分离得到的菌株接种于解钾固体培养基上25 ℃培养，出现黄色晕圈的菌株即为解钾菌。

（2）固氮^[22]：将分离得到的溶磷菌接种于固氮培养基上25 ℃培养，重复五代后，能在培养基中正常生长的为固氮真菌。

（3）产吲哚乙酸（IAA）^[23]：将分离得到的菌株接种于含有100 mg/L色氨酸的液体培养基中培养，取菌悬浮液50 µL，同时滴加50 µL PC比色液，对照组仅在比色液中加50 µL 50 µg/mg的IAA，置于黑暗下30 min后观察颜色的变化，颜色变为粉红色者即为可产生IAA^[24]。

1.3.4 皿内发芽试验与盆栽试验

为进一步考察溶磷真菌的促生能力，参照文献^[25]结合实际情况加以改良后，进行种子萌发试验与青稞盆栽试验。青稞种子（藏青2 000）用5% NaClO和75%酒精进行表面消毒，再用无菌水冲洗。对种子进行不同浓度菌液的浸种后放入铺有无菌滤纸的皿内进行为期7 d的种子萌发试验，观察种子萌发情况。试验处理为：1）对照CK（水），加入无菌水100 mL；2）PDB；3）接种菌株W41孢子悬液（1×10³、1×10⁴、1×10⁵ cfu/mL）。

盆栽土壤为相同条件的农场土壤，试验在含等量土壤的塑料花盆（12 cm×13 cm×15 cm）中进行，每盆播种10粒青稞种子，每个处理3个重复^[26]。定期浇水，在第10 d时加入等量用无菌水制成的溶磷真菌的菌悬液（孢子数为1×10³、 1×10⁴、1×10⁵ CFU/mL）。培养28 d后，从各处理中随机抽取15株幼苗，洗净吸干水分测定幼苗株高、根长、鲜重和干重及茎粗。

1.4 数据分析

利用软件Microsoft Office Excel 2010 进行数据的基本处理，用SPSS Statistics 22.0软件对所有试验数据进行差异显著性分析，OriginPro 2016 等软件制图，MEGA 7.0构建系统发育树。

2 结果与分析

2.1 溶磷真菌的筛选

由图1可知，通过初筛，从根际土壤中分离得到6株溶磷真菌菌株，命名为W12、W16、W26、W27、W41、W45。菌株在培养基上产生明显的溶磷圈，溶磷圈直径与菌落直径比（D/d）为1.02～2.21（表1）。对分离出的6株溶磷真菌进行复筛，6株溶磷真菌菌株的溶磷量分别为15.43 mg/L、12.05 mg/L、22.54 mg/L、3.08 mg/L、55.81 mg/L、8.08 mg/L（图2），其中菌株W41的溶磷量最高，为55.81 mg/L，溶磷效果显著。经过复筛，确定其中一株菌株溶磷效果最好，可展开后续研究（图1）。

2.1.2 溶磷真菌W41的鉴定

（1）溶磷真菌W41的形态学特征

溶磷真菌菌株W41在PDA培养基25 ℃下培养3 d后进行镜检。通过在培养基上所观察到的真菌菌落性状为菌落近圆形,菌丝体为白色，生长旺盛，菌落外围一圈和底部都有菌丝体生长,且底部为白色或浅黄色，产生大量黑色大颗粒状孢子（图2A）。通过生物显微镜观察发现，分生孢子梗褐色至黑褐色，有的分枝长，有的分枝短，梗粗细不均。分生孢子头呈球状，形似菊花，黑褐色（图2D）；分生孢子多呈卵形、球状（图2C）淡褐色，大小在6.79~17.25 μm×6.78~12.13 μm。有时长在培养基边缘，呈环状凸起，有的近球形，黑色。综上，待测菌株与丛梗孢科的曲霉菌属真菌形态相似。

（2）ITS rDNA 序列及系统发育树

利用通用引物序列ITS1进行扩增和测序。将测序结果在NCBI中用 Blast 软件进行同源性序列比对，并构建系统发育树（图3）。结果表明，菌株W41与登录号为NR_164278的菌株毛茛葡萄孢盘菌（Botryotinia ranunculi）处于同一分支，且同源性达到92%，亲缘关系最近。用邻接法通过软件Mega 7.0构建系统发育树，并结合形态学鉴定结果，可以初步确定菌株W41为毛茛葡萄孢盘菌（Botryotinia ranunculi）。毛茛葡萄孢盘菌（Botryotinia ranunculi）是丛梗孢科，葡萄孢盘菌属，分生孢子梗褐色至深褐色，顶部近无色，有的呈曲索状，有的寄主上分枝长，有的分枝短，梗粗细不均。小梗膨大或不膨大。分生孢子淡褐色，广卵形，大小6.75~17.28 μm×6.75~12.15 μm（多数8.1~14.85 μm×6.75~10.8 μm）。菌核主要生于培养基底部，近球形，不规则形，黑色，表面光滑，光亮，边缘呈环状凸出。

2.1.3 溶磷真菌W41的促生能力

（1）固氮、解钾的能力

在亚历山德罗夫培养基平板中央滴下孢子浓度为1×10⁷ cfu/mL 50μL菌悬液，在25 ℃培养3 d后，W41菌株菌体周围有明显的黄色晕圈产生，说明具有解钾活性；在阿须贝培养基平板上点接浓度为1×10⁷ cfu/mL 50 μL菌悬液，25 ℃培养3 d后，重复五代后，株菌W41仍可以在平板上正常生长，菌体周围伴有透明圈，说明其有固氮能力（图5）。

（2）产IAA的能力

根据颜色反应从图6中可以看出，6株溶磷真菌都有一定的产IAA能力。从比色液颜色反应图中菌株W41呈现出最红的颜色。比色液的标准曲线为y=0.003 6 x-0.006 5，R2=0.998 4。重复测量三次后算出平均值，得出相应的IAA值。据计算结果（图7），菌株W41的IAA含量104.03 mg/L，在6株菌中W41显著优于其它菌株。

2.1.4 皿内发芽试验与盆栽试验

（1）皿内发芽试验

皿内发芽试验结果如图8~10所示。施加不同浓度孢子悬浮液制成的菌剂，在青稞幼苗在生长至第7 d时真菌菌剂孢子液浓度为1×10³ cfu/mL、1×10⁴ cfu/mL，其茎长、与鲜重均显著高于对照（P<0.05），而在菌液浓度为1×10⁵的时候促生效果较差，可能是因为菌液浓度过高，使植物无法有效利用养分。其中，施加菌剂浓度为1×10³ cfu/mL时，茎长比对照平均增加2.76 cm，增幅达17.27%；鲜重比对照平均增加0.11 g，提高26.05%，效果最好。菌剂浓度为1×10⁴ cfu/mL时，茎长比对照平均增加3.39 cm，增幅达20.43%；鲜重比对照平均增加0.10 g，提高23.84%。以上结果说明菌株W41对青稞幼苗的生长有较好的促进作用。

（2）盆栽试验

青稞盆栽试验中，施加溶磷真菌菌剂的青稞幼苗在生长至28 d时，其株高、根长、茎宽及鲜重和干重均显著高于对照（P < 0.05），其中，在施加菌剂浓度为l×10³ cfu/mL的效果最为明显，株高分别比水对照、PDB对照平均增加6.98 cm、 3.25 cm，增幅达29.71%、13.85%；根长分别比水对照、PDB对照平均增加4.88 cm、3.28 cm，提高27.61%、18.56%；茎宽分别比水对照、PDB对照平均增加0.69 cm、0.25 cm，提高28.69%、10.31%；鲜重分别比水对照、PDB对照平均增加0.81 g、0.47 g，提高48.49%、28.26%；干重分别比水对照、PDB对照平均增加0.06 g、0.05 g，提高39.12%、32.79%。以上结果说明菌株W41对青稞幼苗的生长有较好的促进作用。如图11~15所示。

3 讨论

目前，关于微生物溶解土壤中矿物质及其在提高土壤肥力方面拥有潜在用途的文献中，大多讨论的都是溶磷细菌和泡囊丛枝菌根真菌。少数涉及丝状非菌根真菌，包括根霉属、曲霉属和青霉属的真菌，极少有提到丛梗孢属的真菌。本研究以从健康青稞根际土中分离溶磷真菌结合形态学鉴定与ITS rDNA 基因序列分子鉴定，可初步确定该真菌属于丛梗孢属的毛茛葡萄孢盘菌（Botryotinia ranunculi），在分离出的6株溶磷真菌中，溶磷效果最好的菌株为W41。对溶磷真菌进行了多种促生能力的测定，结果表明，这菌株W41还同时具有固氮、解钾以及产IAA的能力。在盆栽试验中，青稞株高、根长、茎宽及鲜重和干重均显著高于对照（P<0.05）。以上结果说明菌株W41对青稞幼苗的生长有较好的促进作用、而PDB的处理比水的处理促生效果更好，可能是因为PDB里还存在着一些其他的营养物质，也对植株有促进生长的作用。对于青稞幼苗的茎宽也有所影响，这可能是因为W41这株溶磷真菌菌株不仅仅使土壤有效磷含量的提高，除了菌剂的溶磷作用之外，菌株W41还拥有固氮和解钾以及高效的产IAA能力。根据梁艳琼^[27]等人的研究，从海南岛芒果根际土壤中分离到的溶磷真菌也能有效促进了黄瓜、番茄和西瓜幼苗的生长。王莉晶^[28]等人发现溶磷真菌青霉菌对小麦幼苗生长的刺激作用，发现接种一个月后，在土壤中接种磷化真菌的试验组小麦幼苗的根长增加了近33%，生物量增加了近16%，小麦根部的磷浓度增加了近33%，根重增加了近28%，小麦茎部的磷浓度增加了近28%，土壤中的可溶性磷也有所增加。因此，微生物可以将不溶性磷转化为可被植物吸收和利用的可溶性磷,并且能够促进植物的生长。

影响农作物产量最重要的因素是土壤肥力。如果土壤肥力没有得到恢复，并且过度依赖化学制剂，农民将很难从使用改良品种和更高产的耕作方式中受益^[29]，替代化学磷肥的方法是在土壤-根系界面（根际）使用不同的微生物过程。定植于根际的微生物积极参与了土壤中磷的转化，并将磷酸盐输送到植物中。生物菌剂既能够改善土壤环境，还能减少对于植物和土壤的危害，所以就显得尤为重要了。土壤中的有效磷是表现土壤供磷能力、确定磷肥用量和农田磷环境风险的重要指标。由于实验室条件与自然环境存在巨大差异，很多在实验室条件下表现高效的溶磷菌，在小区与大田试验中效果并不理想。为了一进步考察菌株W41的溶磷、促生作用，进行了皿内萌芽培养和盆栽试验，结果显示菌株W41这株溶磷真菌可以很有效的促进青稞的生长，与其他5株溶磷真菌菌株相比，有效磷含量也十分显著。

溶磷菌在国内外，已经有一定的研究，效果极佳的溶磷菌已经描述了许多。在土壤中，溶解磷的真菌约占总真菌种群的0.1%~0.5%。此外，在实验室条件下重复传代培养时，溶解磷的真菌不会失去溶解磷的活性，土壤中的真菌比细菌更容易长距离穿越，因此可能对土壤中的磷溶解更为重要^[30]。一般来说，溶解磷的真菌比细菌产生更多的酸，因此表现出更优秀的溶解磷活性。在溶解磷酸盐的丝状真菌中，曲霉属和青霉属是最具代表性的。

4 结论

本研究从健康青稞根际土壤中分离筛选到1株以溶磷能力为主兼具多种促生功能的优异真菌W41，初步鉴定为毛茛葡萄孢盘菌（Botryotinia ranunculi）；青稞盆栽试验表明，效果最显著的处理与对照相比，株高平均增加6.98 cm，增幅达29.71%；根长平均增加4.88 cm，提高27.61%；茎宽平均增加0.69 cm，提高28.69%；鲜重平均增加0.81 g，提高48.49%；干重平均增加0.06 g，提高39.12%，溶磷真菌W41可以显著促进青稞幼苗的生长。虽然对于毛茛葡萄孢盘菌（Botryotinia ranunculi）的研究不多，但本研究中的菌株W41在试验中的表现效果都不错，说明这种真菌对于转化土壤有效磷，促进青稞生长方面具有较好的潜力，可为溶磷生物肥料的开发提供菌种资源；对指导西藏的农业生产以及农作物的生长产量都具有积极的影响和重要的意义，更对于西藏地区青稞的种植技术提供了技术支持，对加快民族地区农业经济发展农作物产量的提高具有重要意义。

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基金资助

西藏农牧学院研究生创新计划项目(YJS2022-47)

国家自然科学基金(31960002)