巨柏根际多功能溶磷菌W13对植物生长的促生效果研究

Study on the Growth-Promoting Effect of the Multifunctional Phosphate-Solubilizing Bacterium W13 in the Rhizosphere of Cupressus Gigantean

摘要

从巨柏根际土壤中分离多功能溶磷促生菌株，为高原环境下多功能溶磷菌的收集和研究提供研究基础。本研究从西藏自治区林芝市朗县采集巨柏根际土壤样本，采用梯度稀释法筛选溶磷菌，并结合溶磷圈法和钼锑抗比色法测定溶磷能力，选出溶磷能力较好的菌株，并对IAA、固氮、解钾等多种促生特性进行测定，最终筛得具有多功能的溶磷菌，通过盆栽实验对溶磷菌的促生效果进行验证，并结合形态特征、革兰氏染色和16S rDNA基因序列对菌株进行鉴定。W13具有产IAA、铁载体、固氮、解钾等多种促生特性，为非脫羧勒克菌（Leclercia adecarboxylata）。经盆栽促生试验结果表明，W13对油菜和青稞具有不同程度的促生作用，与对照组相比W13有效提高了油菜植株的根长、株高、鲜重和干重，并分别增长了119 %、55.30 %、157 %和50 %。青稞株高效果显著增长了44.80 %。多功能溶磷细菌W13对油菜和青稞都具有一定的促生作用，因此该菌具有作为生物肥料的潜力，用于植物生产。

Abstract

The objective of this study was to isolate phosphorus-solubilizing bacterial strains with multiple growth-promoting functions from the rhizosphere soil of Cupressus gigantean, and to provide a basis for collection and investigation of multi-functional phosphorus-lytic bacteria in high-altitude environment. In this research, a soil sample was collected from the rhizosphere of Cupressus gigantean in Lang County, Nyingchi City, Tibet Autonomous Region. Phosphorus-dissolving bacteria were screened using the gradient dilution method. The phosphorus-soluble ability of the strains was determined using the phosphorus-soluble circle method and the molybdenum antimony anti-colorimetric method. Strains displaying notable phosphorus-solubilizing capacity were selected, and various growth-promoting traits, including IAA production, nitrogen fixation, and potassium solubilization, were assessed. Finally, a multi-functional phosphorus-solubilizing bacterium named W13 was identified as Leclercia adecarboxylata. W13 exhibited several growth-promoting characteristics, including IAA production, siderophore production, nitrogen fixation, and potassium solubilization. Pot experiments confirmed that W13 had a significant growth-promoting effect on both rapeseed and barley. In comparison to the control group, W13 led to a substantial increase in root length, plant height, fresh weight, and dry weight for rapeseed plants by 119%, 55.30%, 157%, and 50%, respectively. Moreover, the height of barley plants increased significantly by 44.80%. The multi-functional phosphorus-soluble bacterium, W13, demonstrated significant growth-promoting effects on rapeseed and barley, suggesting its potential use as a biofertilizer for plant production.

Graphical abstract

关键词

巨柏 / 根际 / 溶磷细菌 / 促生效果

Key words

Cupressus gigantean / rhizosphere / phosphorus-soluble bacteria / promoting effect

磷（P）是土壤系统中植物生长和养分循环的必要元素之一，在植物的光合作用、呼吸作用、大分子生物合成和抗病性等代谢过程中起着重要作用^[1-2]，是植物生长发育所必需的营养元素之一。尽管土壤中有机和无机磷都存在，但大多数磷不能被植物吸收，导致土壤中磷的有效性较低，影响了植物的光合能力，从而限制了植物的生长和发育^[3]。因此，磷是影响植物生产力的主要因素之一。研究发现，植物根际存在大量具有溶磷能力的细菌，可以将难溶性磷酸盐转化为可溶性磷，从而提高土壤磷的可利用性，促进植物生长。溶磷菌作为新型生物肥料，具有巨大的促生潜力，既可以提高植物对磷的吸收，减少对化肥的依赖，又可以提高土壤肥力，优化磷资源的使用，与化肥相比更环保^[4-5]，因此已成为当前研究的热点^[6]。

巨柏（Cupressus gigantean）是西藏特有的国家一级保护植物，具有较高的经济价值、生态效益和重要的科学研究价值。巨柏主要分布在雅鲁藏布江及其支流河谷，分布地主要为林芝市巴宜区、米林县和朗县。朗县的巨柏分布地土壤中总磷含量显著低于米林县和巴宜区^[7]。在缺磷的土壤环境下，可以促进溶磷菌的富集和提高溶磷菌的溶磷能力；此外，研究发现溶磷菌具有明显的根际效应，即根际土壤中的溶磷菌数量和种类比非根际土壤的多^[8]。因此，本研究选择朗县的巨柏根际土壤作为筛选溶磷菌的材料。

在恶劣的地理和气候条件下仍存在特殊的微生物资源，对植物生长具有积极的影响。巩文峰等^[9]人从西藏色季拉山长鞭红景天根际土壤中分离得到一株溶磷能力最好的PSB19，其溶磷量达到392.15 μg/mL，具有产IAA和固氮特性，其在4和10 ℃的低温条件下生长良好。张英^[10]从西藏阿里地区高寒草原的四种牧草中分离出73株溶解无机磷的溶磷菌，其中17株具有优良的促生特性，研究发现，溶磷菌处理后披碱草的株高、地上和地下植物干重显著高于对照。朱德旋^[11]等人从北方寒地种植的不同农作物根际土壤中分离得到一株高效解磷的细菌B51-7，同时具有很强的广谱抑菌作用，抑菌率最高为89.71 %，在盆栽实验中经过处理的水稻生长具有显著差异。为发掘高寒、高海拔环境下的溶磷菌资源，以生长在恶劣环境下的巨柏作为研究物种，对其根际土壤中的根际溶磷菌分离筛选，并对筛选获得的溶磷菌进行促生能力的测定，最终选取一株具有多种促生特性的溶磷菌，通过盆栽实验对非寄主植物进行促生试验，结合形态特征、革兰氏染色和16S rDNA基因序列对菌株进行鉴定。以期为巨柏根际多功能溶磷菌作为生物肥料在农业中的开发和应用奠定了基础，同时，也为高寒高海拔根际溶磷菌的开发利用和丰富菌种资源提供理论基础和科学依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 供试土样

供试巨柏根际土壤样品采自西藏自治区林芝市朗县（29^°0^′58.53^″N，93^°19^′22.48^″E，海拔为 3 061 m）。选取无病害且健壮的植株作为巨柏根际土壤的采集目标，收集巨柏的细根至少采集20 g，做好标记后置于4 ℃冰箱保存，将其带回实验室，将细根转移至100 mL离心管中加入50 mL PBS，利用离心机6 500 r/min离心5 min收集根际土壤。

1.1.2 培养基

LB固体培养基：胰蛋白胨10 g，酵母提取物5 g，氯化钠10 g，琼脂 18 g，蒸馏水1 000 mL，pH 7.0。

PKOC2固体培养基^[12]：葡萄糖18.19 g， Ca₃（PO₄）₂ 5 g，MgCl₂·6H₂O 3.21 g，MgSO₄·7H₂O 0.25 g，KCL 0.2 g，（NH₄）₂SO₄ 0.08 g，琼脂18 g，蒸馏水1 000 mL，pH 7.0。

阿须贝氏培养基：甘露醇10 g；酵母膏0.4 g；氯化钠0.2 g；碳酸钙1 g；三水磷酸氢二钾0.5 g；七水合硫酸镁0.2 g；琼脂18 g；超纯水1 000 mL。

CAS检测培养基：铬天青S（CAS）60.5 mg；十六烷基三甲基溴化铵(HDTMA) 72.9 mg；六水氯化铁2.645 mg；二水磷酸二氢钠295.25 mg；十二水磷酸氢二钠1 213.5 mg；氯化铵125 mg；磷酸二氢钾37.5 mg；氯化钠62.5 mg；琼脂9 000 mg，蒸馏水1 000 mL。

1.2 溶磷菌的分离与筛选

1.2.1 溶磷菌的分离培养

取5 g巨柏根际土壤，采用稀释分离法分离溶磷菌。依次吸取稀释10^-3、10^-4和10^-5的土壤悬液各100.0 μL，分别涂布在PKOC2培养基上，28 ℃恒温倒置培养。挑选菌落周围产生溶磷圈的菌落到LB培养基上进行分离纯化。将纯化菌株在LB培养基斜面画线培养24 h，然后置于4 ℃冰箱保存备用。

1.2.2 溶磷含量测定

将画线纯化菌株接种到50 mL LB的液体培养基中培养48 h，菌液浓度培养至OD₆₀₀=0.5时^[13]，取0.5 mL菌悬液接种至PKOC2液体培养基中培养7 d。菌株溶磷量测定：50 mL菌液6 500 r/min离心5 min，取1 mL上清液，使用钼锑抗比色法测定菌株的有效磷含量^[14]。

1.3 溶磷菌促生特性测定

通过在阿须贝式培养基上的多次转接培养^[15]，检测分离菌株的固氮能力。将菌株点接在亚力山德罗夫培养基上，观察有无黄色晕圈的产生及测量黄色晕圈的大小^[16]。通过用CAS平板法确定菌株的产铁载体能力^[17]。将分离菌株进行IAA能力定性测定和定量分析^[18]，根据IAA的标准曲线计算出IAA的含量。

1.4 盆栽实验

将油菜和青稞种子用75%的酒精消毒1 min，再用次氯酸钠表面消毒5 min，最后用无菌水冲洗3次^[19]。盆栽土由50 %基质+50%纯土组成，121 ℃高温灭菌1 h^[20]。

将种子接种在无菌水和W13菌株的菌液（当OD₆₀₀=0.5时）中浸种1~2 h，浸种之后的油菜和青稞种子放到含有5 %无菌水的灭菌滤纸上28 ℃培养1~2 d，将发芽的油菜种子移植到含等量土的盆中（12 cm×13 cm×15 cm）生长20 d，设置3个重复，20 d后测量油菜和青稞的株高、根长、鲜重及干重。

1.5 菌株鉴定

对菌株W13进行形态学和分子生物学鉴定，菌落形态及革兰氏染色鉴定参照《伯杰细菌鉴定手册》（第8版）进行^[21]；基于16S rDNA序列的分子生物学鉴定,采用细菌基因组DNA提取试剂盒（Coolaber）根据操作手册提取菌株基因组DNA。采用细菌16S rDNA通过引物（27F，5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’；1492R，5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’）进行扩增。扩增程序为：94 ℃预变性5 min，94 ℃变性30 s，55 ℃复性30 s，72 ℃延伸45 s，30个循环；最后72 ℃延伸5 min。PCR 扩增产物，经1.2 %的琼脂糖凝胶电泳检测后，切胶回收，送生工生物工程（上海）股份有限公司测序。所测基因序列在NCBI数据库中进行同源性序列比对，并采用MEGA 7.0构建系统发育树，自展值为1 000次。

1.6 数据处理

试验数据采用SPSS 23.0进行数据统计及差异显著性分析。

2 结果与分析

2.1 溶磷菌溶磷能力测定

在PKOC2平板上经初筛和复筛获得7株溶磷菌，将7株菌接种到无机磷培养基上，通过观察透明圈法则测定菌株溶磷能力，其中，有3株溶磷圈直径（D）与菌落直径（d）比值（D/d）＞1.5；结合其溶解Ca₃（PO₄）₂的能力定量测定溶磷量，最终筛选出W24、W13、W26和W88四株溶磷菌（表1）。

2.2 促生特性

将筛选的W24、W13、W26和W88菌株进行进一步的促生特性研究。由表2可知，在4株溶磷菌中，W13菌株除了对磷酸盐具有增溶特性外，还同时具有固氮、解钾、产铁载体以及产IAA的能力特性，其中解钾D/d达到了5.91±0.02，产IAA能力为119.02±0.35 mg/L。因此，选取W13菌株作进一步研究。

2.3 盆栽促生实验

油菜接种W13菌液生长20 d后，处理与未处理的CK相比在根长、株高、鲜重和干重均具有显著的差异（P＜0.05），分别增长了119 %、55.30 %、157 %和50 %（图1，表3）。青稞接种W13生长20 d后，与CK相比根长、干重和鲜重差异不显著，但经过菌株W13处理后的青稞株高显著增长了44.80 %（图2，表4）。结果表明，W13具有的溶磷、固氮、解钾等促生特性，更加有利于植株对于养分的吸收与利用，从而促进植物的生长，菌株W13对油菜和青稞生长都有一定的促进作用。

2.4 菌落形态特征

将菌株W13在LB固体培养基上划线并于28 ℃培养24 h后，观察单菌落形态特征（图3），观察到菌株形态特征明显，菌落表面光滑，半透明，微带黄色，表面湿润，圆形边缘规则，通过染色后观察发现W13菌株为紫色短杆状的革兰氏阳性菌。

2.5 菌株鉴定

将西藏朗县巨柏根际土壤中分离得到的溶磷菌株W13的基因序列提交至NCBI中进行Blast比对构建系统发育树，菌株W13与Leclercia adecarboxylata的同源性达到98 %（图4）。因此，分离得到的溶磷细菌定为非脫羧勒克菌(Leclercia adecarboxylata)。

3 讨论

溶磷微生物由于其具有环境友好、成本低、高效率等优点，受到了人们的广泛关注。Chuansheng Mei等^[22]人研究发现，从阿巴拉契亚山脉山麓生长的植物中筛选出5种溶磷细菌都能显著促进高羊茅的离体生长，其中IALR1325促进了辣椒和番茄的生长。YaÑez-OcampoG^[23]等人从马铃薯土壤中筛选出4种细菌，A3作为磷酸盐增溶最高的细菌来评估其对马铃薯生长的促进作用，结果表明，在添加细菌A3 28 d后，马铃薯根和茎的长度显著增加，茎长度增加了79.3 %。磷的吸收对植物的生长具有有益的影响，溶磷菌剂的使用，直接增加其在土壤中的数量，有利于植物对磷的吸收利用^[24]。本研究从高海拔、高寒环境下生长良好的巨柏根际土壤中筛选得到的W13为非脫羧勒克菌（Leclercia adecarboxylata），能够溶解土壤中的不溶性磷酸盐和增强植物对土壤中养分的吸收，从而促进植物生长。在IAA的研究中发现，根际细菌在根系分泌物中将它们转化为吲哚-3-乙酸，并被植物根系利用，导致植物内源性生长素信号通路的活化，这更有助于促进植物细胞的生长和增殖^[25]。在研究中W13产IAA能力为119.02 mg/L高于Sang-Mo Kang等^[26]人从番茄根际土壤中分离得到的Leclercia adecarboxylata MO1（IAA 9.815 ± 0.6293 μg/mL），通过盆栽试验验证，添加溶磷菌可增加油菜株高、根长、鲜重和干重。Fahu Pang等^[27]人从冬小麦种子分蘖和种子灌浆生长阶段进行内生细菌分离，筛选出2株非脱羧勒克氏菌RD197具低水平产IAA（0.00~19.99 mg/L）、溶磷（0~49.99 mg/L）和固氮的能力，RA192具有中水平的产IAA[48.04（±5.08）]和低水平的溶磷（0~49.99 mg/L）能力，在盆栽试验中，接种比未接种的盆栽株高不显著，但地上部分和地下部分干重促生效果明显。W13菌株同时兼具有溶磷、固氮、解钾、产铁载体和IAA多种促生特性，在盆栽实验中促生效果显著。添加溶磷菌对溶解难溶性磷酸盐具有较大的作用^[28]，不同种类的溶磷菌和同一溶磷菌对不同植物各生长指标的影响也不同，进而表现促生能力的差异性。研究发现，将W13非脫羧勒克菌应用于油菜种子会显著增长植物的株高、根长、鲜重和干重；应用于青稞，则只对株高有促进作用。因此，W13磷溶菌对植物生长具有积极影响，但仍有一些限制。首先，本研究仅在实验室范围内进行，对其农田的适用性尚未得到证明；其次，目前仅评估了W13对油菜和青稞的影响，需进一步研究W13对其他植物的作用。本研究为进一步深入探讨W13磷溶菌的作用机制，并开展其应用研究，为更好地支持农业生产和保护环境提供了研究基础。

4 结论

本研究通过形态特征、革兰氏染色和16S rDNA 基因序列比对相结合的方法对巨柏根际土壤中分离出的多功能溶磷菌W13进行形态及菌株鉴定，W13为非脱羧勒克菌，其具有溶磷、固氮、解钾、产铁载体、产IAA等多种促生特性；通过盆栽实验对溶磷菌W13的促生效果进行验证，添加该溶磷菌对油菜的根长、株高、鲜重、干重和对青稞的株高具有显著的促进作用。因此，W13作为生物菌肥在农业生产和植被恢复等方面具有应用潜力。

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基金资助

2022年度西北农林科技大学-西藏农牧学院科研联合基金项目(XNLH2022-02)

2022-2023年研究生教育创新计划项目(YJS2022-04)