不同饲养方式下藏猪盲肠与结肠细菌群落的差异分析

Differential Composition of Bacterial Communities in Cecum and Colon of Tibetan Pigs under Different Feeding Methods

摘要

为了探讨不同饲喂方式与不同肠段间藏猪细菌群落组成的差异性，部分阐明藏猪肠道微生物的特异性。选用两年龄的放牧与舍饲藏猪各3头，分别采集盲肠与结肠食糜样品，测定细菌16S rRNA基因的V3-V4区域，分析细菌群落的组成，探讨盲肠与结肠细菌群落的空间差异格局；采用Person相关性分析探索盲肠与结肠细菌群落的相关性。结果表明，不同饲养方式下，在门水平细菌群落分别有4个差异分类单元，在属水平盲肠中有19个差异分类单元、结肠中有9个差异分类单元。不同饲养方式下，藏猪细菌群落的Beta多样性表现出明显的差异性。在放牧养殖条件下，藏猪的盲肠食糜中拟杆菌门、变形菌门和TM7的相对丰度显著高于结肠（P＜0.05），厚壁菌门、螺旋体门、放线菌门、软壁菌门与疣微菌门相对丰度两个肠段间无显著差异（P＞0.05）。放牧藏猪盲肠中Unclassified_Ruminococcaceae（厚壁菌门、瘤胃球菌科）、Unclassified_Clostridiales（厚壁菌门、梭菌目）、Unclassified_Bacteroidales（拟杆菌门、拟杆菌目）、Turicibacter（厚壁菌门、苏黎世杆菌科）与梭菌属（厚壁菌门、梭菌科）相对丰度显著高于结肠（P＜0.05），但链球菌属（厚壁菌门、链球菌科）相对丰度显著低于结肠（P＜0.05）。舍饲藏猪盲肠与结肠间细菌群落无显著差异（P＞0.05）。放牧藏猪盲肠与结肠中细菌群落关联网络中各节点联系较为紧密，彼此间呈现竞争或者协同作用，舍饲藏猪盲肠与结肠细菌群落关联网络中各节点联系较为松散。结果说明，饲养方式影响藏猪肠道中细菌群落的组成，放牧养殖条件下藏猪肠道细菌表现出更加多元的状态。

Abstract

In the aim of exploring the differences in bacterial community composition between

different feeding methods and different intestinal segments of Tibetan pigs, and partially elucidating the specificity of intestinal microorganisms in Tibetan pigs, this study employed three grazing and three housed Tibetan pigs of two different age groups to collect cecal and colonic surimi samples, and the V3-V4 regions of bacterial 16S rRNA genes were sequenced to analyze the bacterial community composition, and thereby to explore spatial differences in cecal and colonic bacterial communities. Person correlation analysis was used to investigate the correlation between cecal and colonic bacterial communities. The results showed that there were 4 different taxa at phylum level, 19 different taxa at genus level in cecum and 9 different taxa in colon, respectively. The Beta diversity of bacterial community of Tibetan pigs exhibited significant variation under different feeding methods. Specifically, under grazing conditions, the relative abundance of Bacteroidetes, Proteobacteria and TM7 in cecal chyme of Tibetan pigs was significantly higher than that in colon (P<0.05), but there was no significant difference in the relative abundance of Firmicutes, Spirochetes, Actinobacteria, Tenericutes and Verrucobacteria between two intestinal segments (P>0.05). The relative abundance of Unclassified_Ruminococcaceae (Firmicutes, Ruminococcaceae), Unclassified_Clostridiales (Firmicutes, Clostridium), Unclassified_Bacteroidales (Bacteroidetes, Bacteroidales), Turicibacter (Firmicutes, Turicibacteraceae) and Clostridium (Firmicutes, Clostridiaceae) was significantly higher than that of colon (P<0.05), but the relative abundance of Streptococcus (Firmicutes, Streptococcaceae) was significantly lower than that of colon (P<0.05). There was no significant difference in bacterial community between cecum and colon of captive Tibetan pigs (P>0.05). Furthermore, the nodes in the association network of bacterial communities in cecum and colon of grazing Tibetan pigs were closely connected, indicating competition or synergism with each other. In contrast, the nodes in the association network of bacterial communities in cecum and colon of captive Tibetan pigs were loosely connected. The results indicated that feeding methods affectted the composition of bacterial communities in the intestinal tract of Tibetan pigs, and the intestinal bacteria of Tibetan pigs exhibited greater diversity under grazing farming conditions.

Graphical abstract

关键词

饲养方式 / 盲肠 / 结肠 / 细菌群落组成 / 相关性

Key words

feeding method / cecum / colon / bacterial community composition / correlation

哺乳动物肠道内含有约10¹⁴个细菌，数量是构成大多数哺乳动物真核细胞总数的十倍左右^[1]。肠道微生物群包含的基因数量可能是动物机体基因组的100倍，提供了宿主在大多数情况下无法完成的功能，如消化植物纤维和获取能量等^[2]。猪的肠道是一个动态微生物群的家园，微生物聚集在一起形成了一个复杂的微生态系统，与宿主具有共生关系^[3]。肠道微生物和微生物群在维持猪的营养、生理和免疫功能方面起着关键作用^[4]。

大量的研究表明，藏猪体内栖居了与其特性密切相关的细菌。在纤维降解方面，分离和鉴定出了多株芽孢杆菌BY-2^[5]、BY-3^[6]、BY-4^[7]与TL106^[8]，均具有极强的纤维降解潜能。随着测序技术的进步，检测的水平和深度都在进步，通过高通量测序技术，在藏猪肠道中筛选到与纤维降解相关的细菌类群有瘤胃球菌属（Ruminococcus）、普氏菌属（Prevotella）、梭菌属（Clostridium）、丁酸球菌属（Butyricicoccus）、纤维杆菌属（Fibrobacter）、毛螺菌属（Lachnospira）、厌氧弧菌属（Anaerovibrio）、副杆菌属（Parabacteroides）、拟杆菌属（Bacteroides）和螺旋体属（Spirochaetes）^[9-10]。在免疫功能方面，将藏猪粪便移植后，不同动物均表现出免疫能力的提高^[11]。本研究，以放牧和舍饲藏猪盲肠和结肠细菌为研究对象，测定不同饲养方式对藏猪盲肠与结肠细菌群落组成的影响，探索藏猪在不同饲养条件下时，其肠道细菌在不同肠道间的差异。

1 材料与方法

1.1 样品采集

两年龄的放牧藏猪和舍饲藏猪各3头，屠宰后分别采集盲肠和结肠食糜样品于5 mL康宁冻存管中，立即用液氮速冻，实验室-80 ℃冰箱中保存待测。

1.2 总DNA提取

采用粪便DNA提取试剂盒，按照说明书提取盲肠与结肠食糜样品中的微生物总DNA。

1.2.1 仪器与试剂

总DNA提取主要仪器与试剂见表1。

1.2.2 提取步骤

取约200 mg粪便，转移至2 mL离心管中，并置于冰上。加入1.4 mL裂解液，涡旋振荡1 min，彻底混匀。70 °C水浴，振荡混匀15 sec，室温放置1 min，12 000 r/min离心1 min沉淀粪便颗粒。转移900 μL上清液至1.5 mL离心管，加入100 μL杂质去除剂，立即涡旋振荡至彻底混匀。室温放置1 min，12 000 r/min离心3 min，去除杂质。转移上清至1.5 mL离心管，12 000 r/min离心3 min。再取离心后的210 μL上清液至1.5 mL离心管中，加入20 μL Proteinase K (20 mg/mL)，充分混匀。加入200 μL结合液，立刻振荡混匀，70 °C水浴 10 min。将DNA吸附柱S2套入2 mL收集管中，加入100 μL缓冲液至DNA吸附柱中，12 000 r/min离心1 min，弃掉废液。加入100 μL异丙醇至上述预冷后的样本预处理混合液中，立即振荡混匀，短暂离心收集管盖内的液体，将上述混合物加入DNA吸附柱中，12 000 r/min离心1 min，弃掉废液，加入500 μL去蛋白液，12 000 r/min离心 30 sec，弃掉废液。将DNA吸附柱放回收集管中，加入600 μL漂洗液，12 000 r/min离心30 sec，弃废液。将DNA吸附柱放回收集管，空柱 12 000 r/min室温离心2 min，除去残留的漂洗液。将DNA吸附柱放入新的1.5 mL离心管中，在膜中央加入50~150 μL洗脱液，室温放置5 min，然后12 000 r/min离心1 min，收集滤液，即为DNA溶液。

1.3 PCR扩增

将样品统一稀释到20 ng/μL（不足的直接使用原液）进行PCR扩增，扩增目的片段为16S rRNA的V3-V4区域。

1.3.1 仪器与试剂

PCR扩增主要仪器与试剂见表2。

1.3.2 引物信息

PCR扩增引物信息见表3。

1.3.3 扩增体系及参数

扩增体系共25 μL（扩增体系及扩增参数见表4），并添加样本特异性Barcode序列。

1.4 测序及分析

将微生物总DNA样品送至上海派森诺生物科技有限公司，采用Illumina公司的TruSeq Nano DNA LT Library Prep Kit制备测序文库，对文库在Agilent Bioanalyzer上进行质检，采用Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay Kit在Promega QuantiFluor荧光定量系统上对文库进行定量，使用MiSeqPE250测序仪进行2×300 bp的双端测序。

对原始序列进行初步筛查、识别分配、去除嵌合体后，采用QIIME1软件按97%的序列相似度进行归并和分类操作单元（OTU）划分^[12]，并选取每个OTU中丰度最高的序列作为该OTU的代表序列，获取各样本在门、纲、目、科、属五个分类水平上的组成。使用Mothur软件，调用Metastats（http://metastats.cbcb.umd.edu/）的统计学算法，对门和属水平的各个分类单元在3个类型猪之间的序列量（即绝对丰度）差异进行两两比较检验^[13]。使用R软件对Unweighted的UniFrac距离矩阵分别进行NMDS分析，根据物种丰度矩阵和样本分组数据构建偏最小二乘法判别分析（PLS-DA）模型。使用QIIME软件，对未加权的UniFrac距离矩阵分别进行UPGMA聚类分析，并使用R软件进行可视化。采用SPSS21.0软件，对各分类水平的分类单元进行差异分析与Pearson相关性分析，P<0.05表示差异显著，P<0.01表示差异极显著。

2 结果与分析

2.1 不同饲养方式下藏猪盲肠与结肠细菌群落差异分析

盲肠与结肠中的差异分类单元见表5、图1与图2。根据Metastats计算结果，在盲肠内，放牧藏猪与舍饲藏猪在门水平下的差异分类单元数为4个，分别是放线菌门Actinobacteria、变形菌门Proteobacteria、TM7、疣微菌门Verrucomicrobia，放牧藏猪相对丰度高于舍饲藏猪。在属水平共有19个差异分类单元，放牧藏猪18个属相对丰度较高，分别是[Prevotella]、02d06、阿洛巴氏菌属Allobaculum、安德克氏菌属Adlercreutzia、双歧杆菌属Bifidobacterium、布劳特氏菌属Blautia、梭菌属Clostridium、贪铜菌属Cupriavidus、低嗜盐菌属Dehalobacterium、Dorea、刺骨鱼菌属Epulopiscium、L7A_E11、乳杆菌属Lactobacillus、艰难杆菌属Mogibacterium、草酸杆菌属Oxalobacter、沙特尔沃思菌属Shuttleworthia、萨特氏菌属Sutterella与YRC22；舍饲藏猪相对丰度较高的属是密螺旋体属Treponema。在结肠内，放牧藏猪与舍饲藏猪在门水平下的差异分类单元数分别为4个，放牧藏猪相对丰度较高的是放线菌门Actinobacteria与变形菌门Proteobacteria，舍饲藏猪相对丰度较高的是拟杆菌门Bacteroidetes与螺旋体门Spirochaetes。在属水平共有9个差异分类单元，放牧藏猪4个属相对丰度较高，分别是双歧杆菌属Bifidobacterium、低嗜盐菌属Dehalobacterium、刺骨鱼菌属Epulopiscium、萨特氏菌属Sutterella；舍饲藏猪5个属相对丰度较高，分别是[Ruminococcus]、RFN20、梭菌属Clostridium、Paludibacter与密螺旋体属Treponema。

2.2 不同饲养方式下藏猪盲肠与结肠细菌群落Beta多样性分析

Beta多样性分析的主要目的是考察不同样本间群落结构的相似性。通过主成分分析（Principal component analysis，PCA）、多维尺度分析（Multidimensional scaling，MDS）和聚类分析（Clustering analysis）三类方法，对群落数据结构进行自然分解并通过对样本排序，从而观测样本之间的差异。

2.2.1 主成分分析

通过降维进行PCA分析，在盲肠（图3 A）第一主成分（PC1）为45.30%，第二主成分（PC2）为36.48%，二者累计为81.78%，表明2个主成分提取了足以代表原始变量的信息；在结肠（图3 B）第一主成分（PC1）为47.84%，第二主成分（PC2）为26.05%，二者累计为73.89%，表明2个主成分同样提取了足以代表原始变量的信息。PCA分析表明，放牧藏猪盲肠与结肠细菌群落均分布于图的右侧区域，且盲肠细菌群落彼此间差异很小，聚集在第一象限较小的范围内，放牧藏猪结肠细菌群落与舍饲藏猪在两个肠段的细菌群落较分散地分布在图中。

2.2.2 多维尺度分析

通过未加权多维尺度分析（Multidimensional scaling，MDS）发现放牧藏猪盲肠（图4 A）与结肠（图4 B）内3个样品均较集中的分布在一起，与舍饲藏猪明显分割开，而舍饲藏猪3个样本并没有聚集在一起。

2.3 盲肠与结肠细菌群落组成差异分析

通过统计，相对丰度在1%以上细菌群落的结果（图5），在放牧养殖条件下，藏猪的盲肠食糜中拟杆菌门、变形菌门和TM7的相对丰度显著高于结肠（P＜0.05），厚壁菌门、螺旋体门、放线菌门、软壁菌门与疣微菌门相对丰度两个肠段间无显著差异（P＞0.05）。但与放牧藏猪盲肠食糜细菌相对相比，结肠中厚壁菌门相对丰度有降低的趋势，放线菌门相对丰度有升高的趋势。图7显示，放牧藏猪盲肠中Unclassified_Ruminococcaceae（厚壁菌门、瘤胃球菌科）、Unclassified_Clostridiales（厚壁菌门、梭菌目）、Unclassified_Bacteroidales（拟杆菌门、拟杆菌目）、Turicibacter（厚壁菌门、苏黎世杆菌科）与梭菌属（厚壁菌门、梭菌科）相对丰度显著高于结肠（P＜0.05），但链球菌属（厚壁菌门、链球菌科）相对丰度显著低于结肠（P＜0.05）。

由图6与图8可见，舍饲藏猪盲肠与结肠食糜中细菌的相对丰度无显著差异（P＞0.05）。

2.4 放牧藏猪、舍饲藏猪盲肠与结肠细菌群落Pearson相关性分析

放牧藏猪盲肠与结肠主要细菌群落（相对丰度˃1%）Pearson相关性分析结果见表6。在盲肠与结肠两个肠段间呈显著或极显著正相关的细菌类群有Unclassified_Ruminococcaceae与Unclassified_Clostridiales、Unclassified_Bacteroidales、苏黎世杆菌属（Turicibacter）、梭状芽孢杆菌属（Clostridium），Unclassified_Clostridiales与Unclassified_Bacteroidales、苏黎世杆菌属（Turicibacter），Unclassified_Lachnospiraceae与乳杆菌属（Lactobacillus），Unclassified_Clostridiaceae与密螺旋体属（Treponema）、Unclassified_S24-7，密螺旋体属（Treponema）与Unclassified_S24-7，Unclassified_Bacteroidales与苏黎世杆菌属（Turicibacter）、梭状芽孢杆菌属（Clostridium），Unclassified_Peptostreptococcaceae与梭状芽孢杆菌属（Clostridium），双歧杆菌属（Bifidobacterium）与Unclassified_S24-7；呈显著或极显著负相关的细菌类群有链球菌属（Streptococcus）与Unclassified_Ruminococcaceae、Unclassified_Bacteroidales、苏黎世杆菌属（Turicibacter）、梭状芽孢杆菌属（Clostridium），梭状芽孢杆菌属（Clostridium）与Unclassified_Lachnospiraceae、乳杆菌属（Lactobacillus），Unclassified_Clostridiales与Unclassified_S24-7、密螺旋体属（Treponema）。

舍饲藏猪盲肠与结肠主要细菌群落（相对丰度˃1%）Pearson相关性分析结果见表7。在盲肠与结肠两个肠段间呈显著或极显著正相关的细菌类群有Unclassified_Clostridiales与双歧杆菌属（Bifidobacterium）、苏黎世杆菌属（Turicibacter），Unclassified_Bacteroidales与梭状芽孢杆菌属（Clostridium）、链球菌属（Streptococcus），双歧杆菌属（Bifidobacterium）与苏黎世杆菌属（Turicibacter），梭状芽孢杆菌属（Clostridium）与链球菌属（Streptococcus）；Unclassified_Ruminococcaceae与乳杆菌属（Lactobacillus）呈极显著负相关。

放牧藏猪盲肠与结肠中呈显著或极显著相关关系的细菌群落有21对，舍饲藏猪有7对，表明放牧藏猪盲肠与结肠中细菌群落关联网络中各节点联系较为紧密，彼此间呈现竞争或者协同作用，舍饲藏猪盲肠与结肠细菌群落关联网络中各节点联系较为松散。

3 讨论

哺乳动物的肠道微生物群中有约100万亿个细菌，这些细菌通过利用不可消化的食物成分产生短链脂肪酸和维生素等物质，促进动物机体代谢，抑制和预防病原体的增殖，保障宿主的免疫系统，为宿主提供健康支撑^[14-15]。这些特性也使肠道微生物群成为研究动物耐粗饲特性的重要目标，促进动物健康生产与饲料资源的开发利用^[16]。随着高通量测序方法的适应性和可用性的不断扩大，近年来猪肠道菌群的研究已成为一个活跃的研究领域。近年来，对猪胃肠道微生物组的研究极大地扩展了对不同表型的肠道微生物组作用的认识，但这些研究大多集中在粪便微生物组上。本研究，以两种养殖形式（放牧与舍饲）藏猪的盲肠与结肠细菌群落为研究对象，重点剖析细菌群落间的相互关系，为筛选藏猪肠道特异细菌群落提供了支撑。

已有研究表明，饲养方式显著影响藏猪肠道微生物的组成和多样性^[17]。在放牧养殖的条件下，藏猪接触的环境具有很大的变化，肠道内微生物的丰富度与多样性更佳，具备更强的消化饲粮纤维的能力，这种能力与藏猪肠道内纤维降解微生物关系密切^[18]。藏猪肠道内降解纤维的微生物主要聚集在大肠中，表现出放牧养殖状态下，盲肠与结肠中与纤维降解相关的微生物相对丰度显著高于舍饲圈养的其他猪种。研究发现，放牧藏猪盲肠与结肠内具有更多特异性的菌群，这与谭占坤等的研究结果是一致的。消化道微生物随着胃肠道环境的变化表现出不同的特性，并发生了明显的变化^[19]。盲肠与结肠中微生物在动物体内的功能是与动物肠段的生理功能息息相关的，研究发现，藏猪在放牧养殖的条件下大肠中的微生物具有更大的变异性，盲肠和结肠中多个微生物类群在组成和结构中存在差异，而在舍饲养殖条件下，藏猪的饲养环境长期保持一致，盲肠与结肠中微生物在组成和结构中基本一致。有研究表明，在舍饲养殖的状态下，猪肠道微生物表现出纵向和横向的变异性，回肠和大肠中微生物具有显著差异，但盲肠和结肠中的微生物特性基本一致^[20]。另有研究表明，在舍饲状态下，猪盲肠和结肠的微生物组成存在显著差异^[21]。在较低的分类水平上，对300日龄莱芜猪的研究显示，梭菌属和普雷沃菌属分别是盲肠中最常见的属^[22]，而90日龄的DLY猪结肠中普雷沃氏菌属、震荡杆菌属和琥珀弧菌属的分布高度变化^[20]。盲肠中普雷沃氏菌和放线菌的大量繁殖与多糖发酵有关^[23]，乳酸菌和链球菌（结肠中普遍存在的属）的许多成员有助于乳酸的产生^[24]。可见饲养环境不仅影响不同猪相同肠道中微生物的组成，也会导致不同肠段中微生物的变化，同时猪的品种、年龄和饲料也是导致肠道微生物差异性的重要因素。不同肠段的优势菌与肠段的特殊功能密切相关，并在特定部位的生理功能中也起着重要作用。

4 结论

本试验研究表明，藏猪肠道微生物的群落组成和多样性与其饲养方式息息相关，在舍饲养殖条件下的藏猪，其肠道微生物的组成多元化的结构和变异性较低，说明舍饲藏猪肠道中的微生物类群组成相对稳定，在放牧养殖条件下的藏猪，其肠道微生物的组成具有更多元化的结构和变异性，可以促使藏猪肠道中的微生物类群聚集更多有价值和多元性的微生物。综上，不同饲养方式是塑造藏猪肠道微生物多元性的重要影响因素，影响了藏猪盲肠和结肠的微生物结构和组成上的差异，以上结果可为研究藏猪肠道细菌的特异性提供参考。

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基金资助

西藏自治区重点研发计划(XZ202001ZY0039N)

国家自然科学基金(U22A20519)

西藏农牧学院-南京农业大学联合基金(KYYZ2023003)

2022中央支持地方高校改革发展专项资金项目(KY2022ZY-01)