藏猪和大约克猪 INHBA 基因多态性及差异表达分析

Analysis of INHBA Gene Polymorphism and Differential Expression between Tibetan and Yorkshire Pigs

摘要

为探究INHBA基因在藏猪与大约克猪中的多态性与表达差异。在DNA水平上对藏猪、大约克猪INHBA基因5'侧翼区和CDS区进行了单核苷酸多态性（Single nucleotide polymorphism，SNP）位点筛选，同时在mRNA水平上用荧光定量PCR（qRT-PCR）方法检测INHBA基因在卵巢组织中的相对表达量。结果发现：INHBA基因在5'侧翼区存在一个突变位点A-1589T，并在藏猪与大约克猪2个品种间存在极显著差异（P<0.01）；经转录因子预测，发现该突变位点与繁殖性能相关，并推测消失的转录因子结合位点可能是导致藏猪繁殖力低的主要原因之一。INHBA基因在卵巢中，藏猪表达量极显著高于大约克猪（P<0.01），推测INHBA基因可能与猪繁殖性能有关，并对提高猪的繁殖性能起到积极作用。本研究结果为进一步探究INHBA基因在猪繁殖性能的作用机制提供理论支撑。

Abstract

This study was conducted to investigate the polymorphism and expression difference of INHBA gene in Tibetan and Yorkshire pigs. Single nucleotide polymorphism (SNP) sites were screened at the DNA level for the 5' flanking region and CDS region of INHBA gene in Tibetan and York pigs, and the relative expression of INHBA gene in ovarian tissues was measured at the mRNA level by fluorescent quantitative PCR (qRT-PCR). The results showed that there was a mutation site A-1589T in the 5' flanking region of INHBA gene, which exhibited significant difference (P<0.05) between Tibetan and Yorkshire pigs. Transcription factor prediction indicated an association between the mutation site and reproductive performance, suggesting that the absence of a transcription factor binding site may be one of the primary factors contributing to the reduced fertility observed in Tibetan pigs. Furthermore, the expression of the INHBA gene in ovarian tissues was significantly higher in Tibetan pigs compared to Yorkshire pigs (P<0.01), and it was hypothesized that the INHBA gene might be associated with and play a positive role in improving the reproductive performance of pigs. The results of this study provide theoretical support for further investigation of the mechanism of INHBA gene in pig reproductive performance. The findings of this study offer theoretical support for further investigations into the role of the INHBA gene in pig reproductive performance mechanisms.

Graphical abstract

关键词

藏猪 / INHBA基因 / 繁殖性能 / 基因表达

Key words

Tibetan pig / INHBA gene / reproductive performance / gene expression

藏猪是我国独有的高原高寒放牧型猪种，经野猪长期驯化而来^[1]，是农牧民主要的食物和经济来源。作为高原特色品种，藏猪兼具抗病抗寒力强、肉质细嫩香糯、低氧适应性佳等众多外来猪种与其他地方猪种不可比拟的优势^[1]。由于特定的生态环境、社会经济与文化习俗等因素，藏猪养殖基本保留了原始的饲养管理方式^[2]，即放牧于山坡、林间自由觅食，栖息、妊娠、产仔与哺乳等活动均在野外^[3]。母猪发情后群体随机交配，完全没有人工选配^[4]。而母猪的繁殖性能受到环境、品种、季节等多方面的影响^[5]，这种较为落后的养殖模式导致了藏猪长久存在近亲繁殖且繁殖性能低下等现象^[6]。根据近年来报道，外来品种长白猪平均每胎产仔10~12头，大约克猪平均每胎产仔10~13头^[7]；国内本土猪种辽宁黑猪平均每胎产仔11~14头，二花脸猪平均每胎产仔12~15头^[8-9]。相比之下，产仔数少，繁殖力低是藏猪最显著的繁殖特征。然而繁殖性状作为猪重要的经济性状，是反映当地生产水平和经济效益的重要指标之一^[6]。因此，提高藏母猪繁殖力是藏猪育种的重要目标。

繁殖性状是猪育种和生产的重要经济性状，提高藏猪繁殖性能，对农牧民增收、藏猪的产业发展、高原种质资源保护与利用具有重大意义。抑制素（Inhibin，INH）是由雄性动物睾丸支持细胞和雌性动物卵巢颗粒细胞分泌的大分子糖蛋白激素^[10-12]，它能选择性地抑制垂体促卵泡素（FSH）的合成和分泌，对卵母细胞形成、发育有重要的影响^[13-14]。在孙君卫^[15]等关于蛋鸡卵泡发育调控的研究中发现：抑制素A（INHA）、抑制素βA亚基（INHBA）和抑制素βB亚基（INHBB）三个亚基基因对繁殖性能有重要影响。另外Yu Dong-Yue^[16]在研究蓝狐遗传多态性与生长和生殖性状之间的关系中发现，INHBA基因在404G>T突变位点上，其不同基因型组合对雄性生殖力有显著影响。并且Li Xinjian^[17]在研究五只高产和五只低产约克夏母猪的全基因组变异体中同时也证明INHBA基因的几个差异变体与产仔数密切相关。根据上述研究成果，我们初步推测INHBA基因对动物繁殖性能起到重要作用。作为高原动物，藏猪繁殖性能较低，该基因在藏猪繁殖性能上的影响尚不可知，因此有必要将INHBA基因作为影响藏猪繁殖性能的候选基因开展相关研究。

本研究选用成年藏猪（Tibetan pig, TP）与大约克猪（Yorkshire pig, YP）卵巢组织，分别从DNA与mRNA层面分析藏猪、大约克猪的基因变异与表达情况，旨在为进一步探究藏猪繁殖性状相关基因的调控机制以及提高藏猪繁殖性能提供一定的理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

用于RNA-Seq及RT-qPCR试验的大约克猪卵巢来自林芝地区当地屠宰场，选择同批大约克猪（n=6），屠宰后立即取下卵巢；藏猪（n=6）卵巢来自于西藏农牧学院动科学院实习牧场，参试猪（180日龄，二胎母猪）均处于均处于发情期，剖腹手术切除卵巢，收集后均迅速置于液氮中冷冻，并储存在-80 ℃冰箱备用。

1.2 组织总DNA、RNA提取及cDNA的合成

本试验采用苯酚-氯仿法提取耳组织中的总DNA，使用Trizol法分别提取藏猪与大约克猪在卵巢组织中总的RNA，用1%的琼脂糖凝胶电泳和NanoDrop 2000（Thermo公司生产）分别检测DNA、RNA的完整性、纯度和浓度。DNA于-20 ℃保存备用，RNA于-80 ℃低温冰箱保存备用。利用二步法Fastking cDNA(With gDNase)第一链合成试剂盒依据制造商说明书，对cDNA进行合成，NanoDrop 2000检测cDNA的浓度，所得cDNA放置于-20 ℃冻存。

1.3 DNA引物设计与合成

登录GenBank（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank），下载猪INHBA基因（登录号: NC_010456）DNA序列。使用Premier 5.0软件设计、NCBI网页在线设计INHBA基因5'侧翼区和CDS区的特异性引物（表1为部分引物序列），由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，RNase-Free water溶解，-20 ℃保存。

1.4 普通PCR的扩增

PCR扩增体系为20 µL：2×PCR Hero^TM Mix(dye) 10 μL，上、下游引物(10 μmol/L)各0.5 μL，RNase-free ddH₂O 8 μL，DNA模板1 μL。扩增后的产物进行1%琼脂凝胶电泳，合格产物送至成都生物工程股份有限公司进行测序。

1.5 基因型、基因频率检测与转录因子预测

以藏猪和大约克猪提取的DNA为模板，采用混池测序对INHBA进行基因多态性分析，藏猪和大约克猪分别为40头和30头，使用ChromasPro软件进行序列对比分析，筛选SNPs位点后，针对有效筛选出的位点扩大样本进行单个个体测序。根据测序结果统计等位基因频率和基因型频率。同时用JASPAR在线网站（htttp://jaspar.binf.ku.dk/）对SNPs位点突变前后的转录因子进行预测。

1.6 统计分析

使用IBM SPSS Statisties 22.0软件分析INHBA基因表达量的差异显著性，测定结果以P值（P value）表示，P<0.01表示差异极显著，P<0.05表示差异显著。

1.7 荧光定量PCR引物设计与合成

从NCBI数据库中分别下载INHBA基因（登录号：NM_214028）（目的基因）和GAPDH基因（登录号：NM_001206359）（内参基因），利用Primer Premier 5.0 软件进行定量引物的设计，送至上海生工生物有限公司合成，引物信息见表2。

1.8 荧光定量PCR

选用藏猪和大约克猪卵巢组织的cDNA，利用 SuperReal PreMix Plus（SYBR Green）试剂盒（天根）在罗氏LightCycler 96实时荧光定量PCR仪上对INHBA基因进行荧光定量PCR扩增。样品目的基因的表达量采用2^-ΔΔCT法计算。

2 结果与分析

2.1 组织总RNA提取结果

如图1所示，琼脂糖凝胶电泳检测所提取的RNA样本均能跑出清晰的28S以及18S条带，证明RNA样本能满足进一步试验需求。

2.2 INHBA基因型频率与等位基因频率分布分析

使用ChromasPro软件对个体测序结果与原序列对比（图2），发现INHBA基因在5'侧翼区有1个突变位点A-1589T，将此位点的基因型频率以及等位基因频率通过卡方检验（表3），证实该位点符合哈迪-温伯格定律。

2.3 INHBA基因在2个猪种卵巢组织中的相对表达量

使用荧光定量PCR技术检测藏猪和大约克猪在卵巢中INHBA基因的表达水平见图3，结果显示：在卵巢组织中，大约克猪的表达量极显著高于藏猪（P<0.01）。

3 讨论

繁殖性能是由多个方面组成的并是由多个基因型作用的复杂形状，如产仔间隔、产后配种时间、受胎率、使用寿命等组成，而繁殖力是繁殖性能的一大主要方面。大多数的繁殖力性状属于数量性状，受部分主效基因与诸多微效基因的调控，这些调控繁殖性状的基因称为繁殖力基因^[18]。哺乳动物卵巢发育受诸多因素的影响，包括物种差异、外界环境、激素水平、基因表达水平与相关通路调节等^[19]，这些因素影响着卵巢功能是否正常，也往往决定着繁殖性能的高低^[20]。繁殖活动的成败是养猪行业面临的一个至关重要的问题。因此，筛选藏猪繁殖相关的主效调控基因是提高猪繁殖性能，解决藏猪繁殖性能低下的关键前提。

本研究在INHBA基因起始密码子上游2 000 bp内筛选到1个突变位点A-1589T，并对该位点突变前后分别进行转录因子预测，发现减少了24个转录因子，其中消失的2个转录因子Lhx1、Prdm9对于繁殖性能具有重要作用：（1）Lhx1基因5个外显子编码含1个结合的同源结构域和2个富含半胱氨酸的LIM结构域的转录因子，LIM结构域在蛋白—蛋白相互作用中起作用，并与锌原子结合，在细胞发育和分化等通路上起调控作用^[21-22]。哺乳动物在胚胎早期，雌、雄两性都发生两套生殖管道系统：一对中肾管道和一对苗勒管道。在雌性生长发育过程中苗勒上皮即雌性哺乳动物原始生殖道上皮，具有分化为各种成熟生殖道上皮的能力，如输卵管上皮、宫颈上皮和子宫内膜等，然而这些上皮组织与繁殖性能息息相关。Lhx1在中肾管和苗勒管中均有表达，在使用Wnt7a-Cre小鼠进行了苗勒管特异性敲除研究中发现^[23]，苗勒管上皮中Lhx1的缺失导致苗勒管伸长和子宫发育不全的阻滞，进而对于繁殖性能产生影响。同时在Singh Neha^[24]研究LIM同源域（LIM-HD）基因及其在生殖系统发育和性发育障碍的研究中发现，Lhx1是苗勒管上皮的发育和卵母细胞等生殖细胞迁移过程中所必需的基因。当小鼠Lhx1-lacZ敲除后研究在苗勒管的上皮细胞中动态表达，发现尽管Lhx1-null的雌性新生小鼠有卵巢,但缺少子宫和输卵管，进而导致小鼠的繁殖性能受到影响^[25]。在Tanaka Satomi S^[26]的研究中也证明了Lhx1（Lim1）缺乏活性后小鼠胚胎显示有缺陷的原肠胚形成并且缺乏原始生殖细胞（PGC）。（2）Prdm9（PR Domain Containing 9）是一种催化组蛋白H3K4三甲基化的甲基转移酶，是哺乳动物中首个发现的控制减数分裂重组热点的转录因子^[27]。DNA结合蛋白Prdm9指导在小鼠和人类中启动减数分裂重组的双链断裂（DSB）的定位。一些缺乏Prdm9的小鼠品系是不育的，并且在没有Prdm9的小鼠、犬和一名人类中也存在不育或半不育的例子^[28]。在Gasic Srdjan^[29]研究大鼠卵母细胞的Prdm9缺乏导致非同源染色体和非整倍性之间的关系的研究中发现，不育Prdm9缺陷小鼠携带具有许多持续断裂和突触染色体的粗线期卵母细胞，从而导致卵泡数量、产仔数和生育年龄减少等情况。在雄性不育牛-牛睾丸的组织学评估和Prdm9表达水平的研究中^[30]，进行了正常成年牛、性不成熟牛和不育雄牛-牛睾丸中Prdm9 mRNA水平的对比，结果表明与正常成年牛相比，性不成熟牛和不育雄牛-牛睾丸中Prdm9的mRNA水平显著下降，并推测Prdm9与雄性牛的繁殖性能相关。并且有研究表明^[31]在缺乏Prdm9基因的睾丸中发现H3K4me3表达水平降低，其中组蛋白甲基化的表观遗传修饰在生殖细胞发育和受精卵重编程过程中具有非常重要的作用，Prdm9基因与繁殖性能具有较强的相关性。由上述结果揭示INHBA基因A-1589T突变位点可能是调控繁殖性状的关键功能位点，该试验结果为后续深入研究INHBA基因在肌肉生长发育中的作用机制奠定了基础。

抑制素（Inhibin，INH）主要由雌性动物卵巢颗粒细胞和雄性动物睾丸的Sertoli细胞分泌，能有效抑制垂体促卵泡素的合成与分泌^［32］。许多研究都指出瘦素对下丘脑的生殖调控不能产生瘦素（Lep/Lep）的小鼠是不育的，研究发现抑制素βA亚基（INHBA）mRNA作为促性腺激素中潜在的瘦素靶标。我们进一步显示瘦素刺激后GnRHR蛋白的促性腺激素特异性上调^[33]。Shabbir Samina^[34]在研究胡羊卵巢中不同阶段差异中发现lncRNA在卵泡发育过程中调节INHBA的表达并参与了胡羊卵泡和卵巢发育的最后阶段的发育。彭志兰^[35]等以高繁殖力和低繁殖力山羊为研究对象，对INHBA和INHBB基因进行了研究，其中，INHBA基因AA型和INHBB基因CC型明显增加了山羊产仔数。Zhao^[36]等研究发现，哈萨克斯坦羊INHBA存在多态性，其中AA基因型产羔数明显高于BB型和AB型。Li^[15]等通过全基因组对不同品种母猪进行测序分析，筛选出包括INHBA在内的高繁殖力候选基因。近年来也有一些研究采用基因免疫的方法，通过调控抑制素水平促进超数排卵来提高动物繁殖性能^[37-38]。在本研究中，通过对藏猪和大约克猪的卵巢组织进行RT-qPCR检测，发现大约克猪的表达量极显著高于藏猪的INHBA基因的表达量，这与上述实验结论一致。其分子机制还有待于后续进一步研究探讨。综上表述可推测INHBA基因可能与繁殖性能相关，并推测上述转录因子接合位点消失可能是导致藏猪繁殖力低的主要原因之一。

4 结论

为探讨INHBA基因在猪繁殖性能上所发挥的作用，选取藏猪和大约克猪，在DNA水平上对藏猪、大约克猪INHBA基因5'侧翼区和CDS区进行了单核苷酸多态性位点筛选，同时在mRNA水平上用qRT-PCR方法检测INHBA基因在卵巢组织中的相对表达量。通过SNPs位点筛选，在INHBA基因的5'侧翼区发现A-1589T突变位点，经转录因子预测，发现该位点突变前后消失的2个转录因子与繁殖性能相关。利用qRT-PCR技术，对INHBA基因在藏猪和大约克猪卵巢组织中相对表达量进行分析，结果显示，在卵巢组织中，大约克猪的表达量极显著高于藏猪（P<0.01），推测A-1589T位点可能是调控INHBA基因表达的关键功能位点，该突变位点可能是调控繁殖性能的重要分子标记，提示IHNBA基因可能是繁殖性能的重要候选基因。本研究结果为后续深入研究INHBA基因在繁殖性能中的作用机制奠定了基础。

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基金资助

西藏自治区科技计划项目(XZ202202JD0002N)

西藏自治区重大科技专项项目(XZ202101ZD0005N)