猪源芽孢杆菌的分离鉴定及其生物学特性研究

Isolation, Identification and Its Biological Characteristics Analysis of Bacillus spp. from Pig Intestine

摘要

为了分离出潜在的猪源益生芽孢杆菌并探究其益生作用以期获得几株优良的芽孢杆菌菌株用于生产实践。试验采用仔猪粪便为原料，通过菌落形态观察、革兰氏染色、生理生化性质鉴定和16S rDNA序列分析、开展生物学特性分析、进行体外抑菌、药敏和淀粉酶、蛋白酶及纤维素酶活性测定等试验，对用营养琼脂固体培养基分离筛选出的两株菌株进行了研究。经过16S rDNA序列分析，确定培养得到的两株细菌为芽孢杆菌（Bacillus haynesii和Bacillus aerius），Bacillus aerius对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的生长繁殖没有明显的抑制作用；在试验所用到的十种药物中，这两株菌除了对红霉素不敏感外，对其余九种药物均有一定的敏感性；在酶活性试验中，两株菌的蛋白酶和淀粉酶活性比较强，纤维素酶的活性较弱。试验结果表明，这两株芽孢杆菌具有进一步研究并作为益生菌株开发利用的潜能。

Abstract

In order to isolate potential porcine bacillus probiotics and explore its probiotic effects, and obtain several excellent bacillus strains serving for production practice, piglets stool test was used as raw material, through the colony morphology observation, gram staining, physiological and biochemical properties evaluation, 16S rDNA sequence analysis, the biological characteristics analysis, in vitro antimicrobial susceptibility and amylase, protease, and determination of cellulose enzyme activity test, to study two strains form nutrient AGAR solid medium separation. Bacillus haynesii and Bacillus aerius were determined by 16S rDNA sequence analysis. Bacillus aerius had no obvious inhibitory effect on the growth and reproduction of Escherichia coli and Staphylococcus aureus. Among the ten drugs used in the experiment, these two strains were not sensitive to erythromycin, but were sensitive to the other nine drugs. In enzyme activity test, the protease and amylase activities of the two strains were stronger, while the cellulase activity was weaker. The results showed that these two strains had the potential to be further studied and exploited as probiotic strains.

Graphical abstract

关键词

芽孢杆菌 / 分离 / 纯化 / 16S rDNA / 生理生化特性分析

Key words

Bacillus spp / isolation / purification / 16S rDNA / analysis of physiological and biochemical characteristics

前言

由于中国国力的不断增长，我国人民的生活水平也正在日渐提高，因此畜牧人应当对畜牧业自身提出更高的要求，养猪产业也正面临着机遇和挑战。在猪只养殖过程中，猪只肠道内环境的好坏与猪只对饲料的消化吸收有着重大的影响，因此如何改善猪只肠道内环境是当前养猪业面临的一个重大问题。抗生素的使用极大地提高了畜禽生产效率。然而，长期使用抗生素会带来药物残留和毒性效应，对人类和动物的生命健康构成潜在威胁^[1]。近年来，抗生素的滥用带来了严重的危害。一方面，耐药细菌的出现降低了抗生素对人类和动物病原体的治疗效果；另一方面，环境中残留的抗生素不仅对环境系统造成破坏，更对生态系统中的人和动物构成威胁^[2]。2020年07月01日，国家农业部已发布文件，全面在饲料中禁用促生长的抗生素。因此，寻找一种无药物残留和无毒害的添加剂来代替抗生素用于畜牧业生产越来越重要。芽孢杆菌作为一种有益菌，对常见肠道病原体有抑制作用，能够调节肠道菌群的平衡，使各种微生物的种类、数量和定居位置维持相对稳定，各菌群之间相互协调和制约，共同组成稳定的消化道微生物区系。研究表明，芽孢杆菌是革兰氏阳性菌^[3]，能够在动物胃肠道内产生多种消化酶，从而帮助动物对某些营养物质的消化和吸收。芽孢杆菌具有较强的蛋白酶、淀粉酶和脂肪酶活性，同时还能够产生降解饲料中复杂碳水化合物的酶，如：果胶酶、葡聚糖酶、纤维素酶等。这些酶能够破坏植物饲料细胞的细胞壁，从而促使细胞的营养物质释放出来,并且能够消除饲料中的抗营养因子，削减抗营养因子对动物消化利用营养物质的障碍。夏超笃^[4]等认为解淀粉芽孢杆菌对大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌及四联球菌均具有一定的抑制作用。郭军蕊^[5]认为枯草芽孢杆菌在通过高温制粒的加工过程以及经复杂的胃肠道环境和胆汁后依然具有较高的存活率，可保持较高的稳定性，因而能有效地进入动物胃肠道，发挥其益生作用。

然而，不同来源的芽孢杆菌的益生性能是不尽相同的。因此，本试验在仔猪粪便中分离纯化得到了两株芽孢杆菌，并通过研究其体外抑菌能力、药敏试验和产酶能力等，为将来对其进行更深入的研究指引方向并为芽孢杆菌应用于实际生产中提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 菌株和培养基

菌株来源：仔猪粪便指示菌：大肠杆菌和金黄色葡萄球菌，由福建农林大学动物科学学院单胃动物营养试验室保存提供。

培养基：营养琼脂固体培养基、营养肉汤液体培养基、卵黄琼脂培养基、西蒙氏枸橼酸盐琼脂培养基、淀粉酶活测定专用培养基、纤维素酶活测定专用培养基（以上药品均购自武汉伊莱瑞特生物科技股份有限公司）。

DNA提取液：（Tris 150±20 mM，EDTA 30±5 mM，SDS 1%，用盐酸调pH值为7.7～8.0）。

1.2 仪器与设备

PCR扩增仪，电泳仪，凝胶成像仪，显微镜，购自伯乐医学生命产品（上海）有限公司；恒温培养箱，离心机，紫外分光光度计，超净工作台，购自赛默飞世尔科技（中国）有限公司。

1.3 菌落的培养及分离纯化

采集粪样：采集新鲜的仔猪粪便，将粪样放入无菌袋中，记录采集的时间、地点，4 ℃保存备用。

粪便悬液制备：取10 g粪样，放入盛有40 mL蒸馏水的离心管中，在振荡器上振荡混匀20 min，使粪样与蒸馏水充分混合，从而将细菌分散在蒸馏水的每个区域，然后80 ℃水浴10 min，制备成粪便悬液^[6]。

粪便悬液稀释：用移液枪从离心管中吸取粪便悬液0.1 mL，注意尽量不要吸取到粪便中未消化的食物残渣等，加入盛有0.9 mL无菌水的离心管中，充分混匀，然后用移液枪从此离心管中吸取0.1 mL加入另一只盛有0.9 mL无菌水的离心管中，来回打液混合均匀，以此类推制成1:10¹、 1:10²、1:10³、1:10⁴、1:10⁵、1:10⁶不同的稀释梯度。

倒平板：配制营养琼脂培养基，121 ℃灭菌15 min，冷却至45 ℃ ~ 50 ℃倒平板，每皿15 mL左右。培养皿凝固后，在培养皿底部分别用记号笔标记：1:10⁴、1:10⁵、1:10⁶三种稀释梯度。

涂布：使用移液枪分别吸取1:10⁴、1:10⁵、 1:10⁶稀释梯度的粪便稀释液0.2 mL，将菌悬液对号滴入已写好稀释度的培养皿表面中央，再用灭过菌的玻璃珠在培养基表面上下左右摇晃，涂布均匀，倒置放置，待培养^[7]。

培养：将接种好细菌的营养琼脂培养皿倒置于37 ℃恒温培养箱中培养，培养时间大约为20 h。

平板划线分离纯化：挑取单菌落接种到营养琼脂培养基上，对应做好标记，置于37 ℃温箱中培养20 h左右，待长出菌落，继续分离纯化，直至获得纯种菌株^[8-9]。

1.4 纯化菌株的形态观察

观察菌落形态，如：大小、颜色、边缘是否整齐。

细菌革兰氏染色

涂菌：在洁净的载玻片上滴加一滴灭菌水，用灭菌的接种环蘸取单菌落上的少量细菌于灭菌水中混匀。

干燥：用加热法，即将涂有细菌的一面向上，通过火焰若干次，以热而不烫为宜，防止细菌的菌体烧焦、变形。目的是使细菌粘附在玻片上，便于染料着色。

初染：于制片上滴加结晶紫染液，染l min后，用蒸馏水洗去剩余染料。

媒染：干燥玻片后滴两滴碘液，覆盖住菌膜。1 min后水洗。

复染：滴加品红染液复染l min，水洗。晾干。

油镜镜检：观察染色情况及细菌的形状。革兰氏阳性菌染成蓝紫色，革兰氏阴性菌染成淡红色^[3]。

1.5 菌株的生理生化性质鉴定

通过V-P试验、明胶液化试验、枸橼酸钠盐利用试验、卵磷脂酶试验、吲哚试验、接触酶试验、葡萄糖酵解试验，并参考《伯杰氏细菌鉴定手册》（第9版）进行^[10]。

1.6 芽孢杆菌的分子生物学鉴定

挑取纯化后的菌落于营养肉汤液体培养基中，于37 ℃恒温震荡箱中120 rpm/min培养24 h。

取1 mL菌液于离心管中，12 000 rpm离心 10 min后去掉上清液。

加入500 μLDNA提取液，与菌体沉淀混匀，于80 ℃水浴锅中加热10 min，破碎细胞。

12 000 rpm离心10 min，吸取离心后的上清液移至新的离心管，加入与吸取液等体积的异丙醇，颠倒混匀，12 000 rpm离心10 min，弃上清液。

将离心管吹干，再加入30 μL灭菌的ddH₂O，用于溶解DNA，获得含有细菌基因组DNA的溶液。

（1）PCR扩增引物

本试验采用的PCR引物为细菌通用引物，目的是扩增芽孢杆菌的16S rDNA^[11-12]。

（2）PCR反应体系（总体系50 μL）

（3）PCR循环条件

制胶：向1×SB缓冲液中加入1%的琼脂糖，放入微波炉加热溶解，并加入核酸染；料（核酸染料：1×SB＝1:10 000），倒入制胶板等待凝固；加样：加入PCR产物10 μL，DNA Marker 5 μL；电泳：电泳液没过胶板构成通路，设置180 V， 20 min；紫外凝胶成像：电泳完成后，戴手套将胶板放入紫外照胶仪中观察并拍照，观察是否出现1 500 bp左右的目标条带。

基因测序和序列比对：将PCR后的产物送至测序公司测序。得到测序结果后，利用NCBI数据库中的BLAST功能，对获得的16S rDNA的基因序列进行比对，获得菌株信息。

1.7 抑菌性试验

将培养充分的细菌液体放入离心机进行离心，收集上清液备用；在超净工作台内将事先准备好的大肠杆菌、金黄色葡萄球菌依次稀释至10 ~3梯度，吸取100 μL的菌液涂布到肉汤琼脂培养基中，然后用镊子将无菌牛津杯轻放于涂完指示菌株的平皿中^[13]，再吸取 200 μL上清液滴到牛津杯内，注意操作过程中不要让上清液溢出牛津杯，最后将平皿放置4 ℃冰箱中24 h，目的是进行扩散处理。然后放到37 ℃恒温箱中培养24 h，观察抑菌现象^[14-16]。

1.8 药敏试验

用接种环挑取单个菌落接种于NB培养基中，于37 ℃恒温摇床中培养12 h，进行增菌。取 0.4 mL已稀释好的枯草芽孢杆菌菌液，用灭菌的三角环均匀涂布在枯草芽孢杆菌选择培养基上，待菌液干后，用灭菌镊子取药敏纸片均匀贴于培养基表面^[17]。37 ℃恒温培养24 h。24 h后将其拿出，观察抑菌圈直径^[18]。

1.9 淀粉酶活性测定

配制淀粉酶活测定专用培养基，121 ℃灭菌20 min。倒板后接种细菌于培养基内，待菌生长良好后，加碘液染色，观察透明圈。

1.10 蛋白酶活性测定

营养琼脂固体培养基加1.5%脱脂奶粉。倒板后接种细菌，待菌生长良好后，观察蛋白水解圈。

1.11 纤维素酶活性测定

配制纤维素酶活测定专用培养基，121 ℃灭菌20 min。倒板后接种细菌，待菌生长良好后，加0.1 g/L刚果红染色，用1 mol/L氯化钠洗涤，观察透明圈^[19]。

2 试验结果

2.1 革兰氏染色观察结果

用显微镜观察细菌颜色为蓝紫色，可以初步判断这两种细菌为革兰氏阳性菌，形状为杆状，菌落呈白色，周围不光滑，如图1~3和图4所示。

2.2 菌株的生理生化性质鉴定结果

上述2、5号菌株的生理生化性质鉴定结果见表4。将结果与《伯杰氏细菌鉴定手册》（第9版）上关于芽孢杆菌的描述做对照，初步鉴定这两个菌株属于芽孢杆菌属。

2.3 分子生物学鉴定结果

以分离菌株DNA为模板，选择芽孢杆菌的通用引物27F和1942R进行PCR 扩增，PCR产物用1%的琼脂糖凝胶电泳分析，在大约1 500 bp 处有明显条带，与目的片段大小相符，如图5所示。测序结果表明，二号菌和五号菌均为芽孢杆菌，二号菌为Bacillus haynesii，五号菌为Bacillus aerius（电泳图中从右至左为五号菌和二号菌）。

2.4 药敏试验结果

两株芽孢杆菌对十种药物的敏感程度分析如图6-7和表5所示。

2.5 抑菌性试验结果

如图8-9所示，Bacillus aerius对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌抑菌效果不明显。

2.6 淀粉酶活性测定结果

经过碘液染色后，有淀粉的部分会变成蓝色，没变成蓝色的区域说明没有淀粉存在，进一步说明淀粉被淀粉酶水解掉了。由图10-11可见两株菌均有产淀粉酶的能力，其中Bacillus haynesii的产淀粉酶能力比较强。

2.7 蛋白酶活性测定结果

由图12-13可见，两种芽孢杆菌周围均是透明带，说明蛋白质已被蛋白酶水解，可知两株菌均有产蛋白酶能力。

2.8 纤维素酶活性测定结果

对比染色前后的图片（图14-15），不难看出，染色前后有部分区域变透明了，这说明纤维素已被纤维素酶水解，因此两株菌均有产纤维素酶的能力，但是能力较弱（图中从左往右为染色前和染色后）。

3 分析与讨论

动物胃肠道的消化吸收功能与胃肠道内的各种细菌存在着密切的关系。随着我国农业部在饲料中全面禁用促生长类饲用抗生素通知的颁布，目前益生菌在畜牧行业的应用越来越被广泛地研究。研究发现，口服益生菌可以通过产生代谢物和抗菌化合物、改变胃肠道微生物群组成结构并抑制畜禽食源性病原体的产生，促进畜禽肠道微生物群的平衡^[20]。

在众多的益生菌中，芽孢杆菌因其能产生芽孢，可以在较为恶劣的环境中生存，耐酸及耐胆盐的能力比较强，很容易适应动物胃肠道的环境，进而有利于其益生作用的发挥。

而本文的研究从规模化养殖的三元仔猪粪便中提取出的两株芽孢杆菌，经生理生化性质鉴定与16S rDNA测序，鉴定其为Bacillus haynesii和Bacillus aerius，为了探究其是否有益生效果，本文首先对其抑菌性能做出了测试，与杜汉宇等^[20]测出的抑菌圈直径（16.5 mm）相比，本试验分离到的Bacillus aerius对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的生长抑制效果不明显。同样，为了避免其耐药性基因的横向传播，因此，其耐药性的测试也是保证其益生作用得以发挥的必不可少的一环。除此之外，本文对其产生各种酶的能力做出了一些试验，发现Bacillus haynesii的淀粉酶活性高于Bacillus aerius，而Bacillus aerius的蛋白酶活性高于Bacillus haynesii，纤维素酶活性基本一样。这两株芽孢杆菌均有较强的产酶能力，能够帮助畜禽分解淀粉、蛋白质、纤维素等营养物质。本次试验得到的结果虽然与其他科研结果不是一模一样的，但大致的性质变化不大。以上结果说明这两株均有较好的生物学特性，但是能否作为益生菌制剂被应用到生产中还有待进一步的研究和讨论。

4 结论

综上所述，本研究从仔猪粪便中筛选得到了两株芽孢杆菌，Bacillus haynesii和Bacillus aerius均具有良好的药敏性能，抑菌性能，及产淀粉酶、蛋白酶、纤维素酶的能力。通过药敏试验可知，Bacillus haynesii对头孢唑啉、氨苄西林、氯霉素、青霉素显示高耐受性；Bacillus aerius对氨苄西林、氯霉素、青霉素显示高耐受性；同时这两种芽孢杆菌对红霉素表现为不敏感，这为日后用药提供了一些理论上的指导。根据以上的结果初步判定分离得到的两株芽孢杆菌具有良好的生物学特性，有较强的产淀粉酶、蛋白酶、纤维素酶等能力，在作为饲料添加剂方面具有很大的潜力。

参考文献

[1] 付水广,瞿明仁,宋小珍.益生素和中草药在乌骨鸡生产中替代抗生素的研究[J].中国家禽.2004(02):14-15.

[2] 华鹤良.乳酸菌的分离鉴定及其抗菌肽与发酵性能研究[D].江苏扬州:扬州大学,2014.

[3] 李贺海,王佳慧,李迎迎 等.芽孢杆菌的分离鉴定[J].中国兽医科学.2020(11):1-7.

[4] 夏超笃,湛穗璋,艾琴 等.一株解淀粉芽孢杆菌的益生特性及抑菌性研究[J].中国畜牧兽医.2020,47(02):425-432.

[5] 郭军蕊.枯草芽孢杆菌对蛋鸡益生作用机制的研究[D].北京:中国农业科学院,2017.

[6] 温灿权,陆黎明,戴佳佳 等.猪源枯草芽孢杆菌的分离鉴定及其特性研究[J].江西农业大学学报.2015,37(03):522-529.

[7] 张君利,刘超兰,郭义东 等.云贵川湖泊芽孢杆菌分离、鉴定及抗动物病原菌活性研究[J].四川动物.2019,38(06):686-694.

[8] 汪攀,易敢峰,孙自博 等.一株凝结芽孢杆菌的分离鉴定及益生性研究[J].中国畜牧兽医.2017,44(04):1195-1202.

[9] 陈秀秀,孙洪浩,孙小涵 等.一株凝结芽孢杆菌的分离鉴定及益生性分析[J].饲料博览.2020(11):1-5.

[10] 赵小琪,黄英,段博芳 等.猪源性芽孢杆菌的筛选与鉴定[J].上海畜牧兽医通讯.2017(04):6-9.

[11] 张韵,赵丽娜,曹琳 等.益生凝结芽孢杆菌的筛选及生物学特性研究[J].中国畜牧杂志.2017,53(01):109-114.

[12] TOLBA O, EARLE J A, MILLAR B C, et al. Speciation of Bacillus spp. in honey produced in Northern Ireland by employment of 16S rDNA PCR and automated DNA sequencing techniques[J]. World J Microbiol Biotechnol. 2007, 23(12): 1805-1808.

[13] 资英娟,孔俊铭,郭志鹏 等.凝结芽孢杆菌NJh032产酶抑菌活性及其发酵产品性能探究[J].饲料研究.2021,44(07):102-106.

[14] 王晓佳.枯草芽孢杆菌的生物学特性及在猪生产中的应用[J].养猪.2020,(03):14-16.

[15] 王晓佳.凝结芽孢杆菌的生物学特性及在仔猪生产中的应用[J].广东饲料.2020,29(06):32-35.

[16] 徐亚飞,胡浩,周计丹 等.凝结芽孢杆菌的生物学特性及其在水产养殖中的应用[J].盐城工学院学报(自然科学版).2017,30(01):52-55.

[17] 张小波,温贵兰,张喜懿 等.一株鸭源贝莱斯芽孢杆菌的分离鉴定及药敏试验[J].贵州畜牧兽医.2020,44(06):48-50.

[18] 柳成东,于晓东,王乙茹 等.凝结芽孢杆菌药敏实验的研究[J].饲料工业.2020,41(14):35-39.

[19] 刘宇,李阳,尹珺伊 等.一株产纤维素酶的解淀粉芽孢杆菌分离鉴定及其酶促反应条件研究[Z].中国山东青岛:20161.

[20] 杜汉宇,葛成菲,汪丽丽 等.枯草芽孢杆菌的分离鉴定及其特性研究[J].天津农学院学报.2020,27(03):53-56.

基金资助

西藏自治区重点研发及转化计划项目(XZ201902NB06)