喜马拉雅紫茉莉种子消毒及无菌苗培养条件的研究

Study of Disinfection of Mirabilis himalaica Seeds and Sterile Seedling Culture Conditions

摘要

以剥去外种皮的喜马拉雅紫茉莉种子为外植体，研究不同消毒剂对喜马拉雅紫茉莉种子消毒效果及萌发的影响，并对无菌苗培养基进行筛选。结果表明：（1）种子最适消毒方法为75%乙醇1 min＋2% NaClO 15 min，污染率为3.74%，褐化死亡率为1.33%，种子发芽率为94.05%。（2）种子发芽适宜的基本培养基为MS+蔗糖30 g/L+琼脂7 g/L，种子发芽启动时间为4.33 d，发芽率在95%以上。（3）将子叶展开的无菌苗转接到MS+6-BA 0.2 mg/L+蔗糖30 g/L+琼脂7 g/L培养基上，培养至30 d，无菌苗平均叶片数为15.33个，叶片肥厚宽大，茎节间较短，生长旺盛。该研究结果为喜马拉雅紫茉莉无菌苗的培育提供了科学依据和技术支持。

Abstract

Using Mirabilis himalaica seeds with their outer seed coat removed as explants, this study examined the impact of various disinfectants on seed disinfection and germination. Additionally, the study included the selection of a suitable culture medium for sterile seedling growth. The results indicated that the optimal seed disinfection method involved a combination of 75% ethanol for 1 minute followed by 2% NaClO for 15 minutes. This treatment resulted in a contamination rate of 3.74% and a browning mortality rate of 1.33%, while achieving a high seed germination rate of 94.05%. Regarding the appropriate basic culture medium for seed germination, the study found that MS supplemented with 30 g/L of sucrose and 7 g/L of agar was ideal. Seed germination commenced after approximately 4.33 days, with a germination rate exceeding 95%. Furthermore, the unfolded cotyledon sterile seedlings were successfully transferred to a medium containing MS, 6-BA at a concentration of 0.2 mg/L, 30 g/L of sucrose, and 7 g/L of agar. After 30 days of cultivation, the sterile seedlings exhibited an average of 15.33 leaves, characterized by wide, thick leaves and shorter internode distances, indicative of vigorous growth. These research findings offer valuable insights into the cultivation of sterile Mirabilis himalaica seedlings, serving as a scientific basis and providing essential technical support.

关键词

喜马拉雅紫茉莉 / 种子 / 消毒剂 / 无菌苗 / 组织培养

Key words

mirabilis himalaica / seed / disinfectant / sterile seedlings / tissue culture

喜马拉雅紫茉莉（Mirabilis himalaica (Edgew.) Heimerl）及其变种中华紫茉莉（M. himalaica var.chinensis Heimerl）是紫茉莉科（Nyctaginaceae）紫茉莉属（Mirabilis）多年生草本植物，《中国植物志》将其归入山紫茉莉属（Oxybaphus），新拟名为山紫茉莉（O.himalaicus Edgew.）和变种中华山紫茉莉（O. himalaicus Edgew. var. chinensis）^[1,2]。喜马拉雅紫茉莉为常用藏药材，藏语名为“巴朱”，以根入药，具有温肾、生肌、利尿、排石、干“黄水”之功效，同时还具有治疗胃寒、肾寒、阳痿、浮肿、结石、腰痛、关节痛、“黄水”病等疾病的作用，也可用于消炎、止痛^[3-7]；主要药用化学成分包括黄酮类化合物、生物碱类化合物、三萜类化合物等次生代谢产物^[8-10]。在藏药石榴日轮丸、二十五味儿茶丸、十四味羚牛角丸和红花如意丸等藏成药中均使用喜马拉雅紫茉莉入药^[3-7,10]。随着藏药工业化生产速度加快、市场开拓力度加强，对喜马拉雅紫茉莉药理作用及其药用范围的不断深化拓展，对其原料药的需求量越来越大。喜马拉雅紫茉莉已被列入西藏Ⅰ级濒危藏药材名单^[11,12]。因此，扩大药源和寻找替代方法十分必要。采用植物生物技术培育优质喜马拉雅紫茉莉是一种前景看好的方法。

喜马拉雅紫茉莉黄酮类化合物生物合成的分子生物学机制研究及代谢工程研究，是近年来的研究热点之一，相关研究主要集中在代谢途径分析和基因克隆与功能分析等方面。兰小中等^[13]克隆了喜马拉雅紫茉莉鱼藤酮合成途径中的MhPAL、MhCHS和MhCHI三个基因，通过表达喜马拉雅紫茉莉毛状根中的MhCHI或MhCHS基因都能提高其鱼藤酮含量。采用转录组、蛋白组和代谢组等多组学关联研究的方法，喜马拉雅紫茉莉黄酮类化合物生物合成的关键代谢途径的基本框架已逐步明确，更多的黄酮类化合物生物合成关键酶及其基因被挖掘，如苯丙氨酸解氨酶（PAL）、肉桂酸-4-羟基化酶（C4H）、4-香豆酸辅酶A连接酶（4CL）、查尔酮合成酶（CHS）和查尔酮异构酶（CHI）等^[14]。刘佳佳等^[15]基于喜马拉雅紫茉莉愈伤组织低温转录组测序数据库，利用生物信息学软件对MhMYB转录因子进行结构域、系统进化及低温诱导表达水平分析，初步研究表明，筛选出的34个MhMYB家族成员中的MhMYB6、MhMYB15、MhMYB62可参与调控低温诱导喜马拉雅紫茉莉类黄酮的累积，为探索高山藏药植物喜马拉雅紫茉莉MYB基因提供了理论参考。然而，目前对这些基因的鉴定和功能验证研究还很少。可以借助基因过量表达、基因敲除、基因沉默等技术产生的基因表达变化以及植物整体功能的变化来研究基因功能，而建立植物离体再生体系和遗传转化体系则是利用这些技术的必要条件。

在植物组织培养及基因工程研究中，如何获取健壮无菌苗作为外植体建立组织培养的高频再生体系，是有效开展这些工作的前提和基础，而无菌苗一般由种子获得。因此，在无菌苗培养时，种子消毒以及接种等环节就显得尤为重要。不仅要求消毒彻底，还要使消毒剂对种子的伤害最低，如果种子受到的伤害较大就会导致发芽率低、无菌苗长势不良，且直接影响后续的外植体的再分化及高频再生体系的建立。此外，在分子生物学研究中，为避免微生物的污染，可以用无菌苗来提取高质量的DNA和RNA^[16-17]。无菌苗还能鉴定植物的抗病性，张志元等^[18]用无菌苗法鉴定了油菜（Brassica campestris L.）对菌核病的抗性及抗病生理。

喜马拉雅紫茉莉种子的消毒及无菌苗的培养，在其组培快繁和基因的鉴定与功能验证中发挥着重要的作用。然而，目前有关喜马拉雅紫茉莉种子消毒及无菌苗培养方面的研究尚无报道。因此，本研究的目的，就是探讨不同消毒剂对喜马拉雅紫茉莉种子消毒效果及萌发的影响，以期探索高效且稳定的消毒方法，并对无菌苗培养基进行筛选，为喜马拉雅紫茉莉无菌苗的培育提供参考与借鉴。

1 材料与方法

1.1 植物材料

喜马拉雅紫茉莉种子于2020年9月采自西藏农牧学院藏药材种质资源圃。种子自然干燥后在通风、干燥、避光的室内存储。于2021年7月开展实验。种子千粒重为13.927 g。

1.2 方法

1.2.1 种子消毒处理

喜马拉雅紫茉种子在遇水后很快在种子表面出现白色的黏液，并且去除黏液非常困难。在前期的试验中发现喜马拉雅紫茉莉种子黏液不利于消毒剂渗入，消毒效果很差，因此，在消毒之前剥去种子的外种皮。

将喜马拉雅紫茉莉种子用自来水浸泡2~4 h（种子泡胀，方便剥皮即可）。种子剥皮。将剥皮后的种子用洗洁精揉搓清洗，自来水冲洗多次至洗洁精完全去除。然后将剥去外种皮的种子转入超净工作台进行消毒处理。种子先用75%乙醇消毒1 min，无菌水冲洗3次，再用0.15% HgCl₂消毒5、8、10和12 min或2% NaClO消毒5、10、15和20 min，无菌水冲洗3次。将消毒完毕的种子置于无菌滤纸上吸干表面的水分，然后接种到MS培养基上培养。共8个消毒处理，每个处理设3次重复，每个重复1个培养皿，每个培养皿接种12粒种子。培养条件：温度25 ℃ ± 2 ℃、光照12 h/d，下同。培养至第7 d，统计污染率、种子发芽率和褐化死亡率。

污染率＝污染种子数／供试种子总数×100%

发芽率＝种子发芽总数／供试种子总数×100%

褐化死亡率=褐化和死亡的种子数／供试种子总数×100%

培养基中均添加蔗糖30 g/L、琼脂7 g/L，pH 5.8，下同。

1.2.2 种子发芽适宜基本培养基地筛选

根据本试验1.2.1的筛选结果，将剥皮种子用最适消毒方法消毒后，分别接种于1/2 MS和MS培养基上培养。每个处理设3次重复，每个重复1个培养皿，每个培养皿接种12粒种子。从处理当天开始，每24 h观察记录种子的发芽情况及生长情况，以胚根露出种孔3 mm为种子的萌发标志。培养至第7 d视为种子发芽进程结束，统计发芽启动时间、发芽率及无菌苗生长状态。发芽启动时间，即萌发时滞，指从萌发试验开始到第1粒种子开始萌发所持续的天数。

1.2.3 无菌苗培养适宜培养基地筛选

根据本试验1.2.2的筛选结果，将培养效果较好的培养基上子叶展开的无菌苗分别接种到设置的5种培养基上培养。基本培养基为MS，分别添加6-BA 0.2、0.5 mg/L，NAA 0.2、0.5 mg/L。每个处理设3次重复，每个重复1个培养瓶，每个培养瓶接种3株幼苗。培养至第30 d，观察并统计无菌苗叶片数及生长状态。

1.2.4 数据处理

试验数据采用Excel工作表进行整理，SPSS 19.0进行差异显著性分析（P˂0.05）。

2 结果与分析

2.1 不同消毒处理对喜马拉雅紫茉莉种子消毒效果和发芽的影响

由表1可知，各消毒处理对喜马拉雅紫茉莉种子的消毒效果明显不同。在各处理先用75%乙醇消毒1 min的基础上，随着0.15% HgCl₂和2% NaClO消毒时间的延长，污染率呈下降趋势，褐化死亡率呈上升趋势，发芽率则呈先上升后下降的趋势。种子发芽率受到消毒时间和污染程度的双重影响，消毒时间较短则污染率较高，此时即使种子褐化死亡率低，但是随着杂菌的繁殖扩散污染到其他种子，则对种子发芽产生了一定的抑制作用。虽然0.15% HgCl₂对种子的消毒效果比2% NaClO的好，但是0.15% HgCl₂对种子的伤害较大，用0.15% HgCl₂对种子消毒8~12 min，褐化死亡率为16.12% ~ 88.91%。2% NaClO对种子的伤害较小，随着消毒时间的延长，种子的褐化死亡率较低，并且消毒效果比较好。用2% NaClO消毒15 min，虽然污染率为3.74%，褐化死亡率为1.33%，但是种子发芽率最高，为94.05%。

综上，剥去外种皮喜马拉雅紫茉莉种子最适消毒方法为75%乙醇1 min＋2% NaClO_{15 min。该消毒处理下的污染为细菌污染，可以在无菌苗子叶展开后进行继代接种操作时，不转接污染材料。}

2.2 不同基本培养基对喜马拉雅紫茉莉种子发芽的影响

将剥去外种皮的喜马拉雅紫茉莉种子用75%乙醇1 min＋2% NaClO_{15 min的方法消毒后，分别接种于1/2 MS和MS培养基上培养。由表2可知，种子在MS培养基上培养至4.33 d开始萌发，并且发芽率高于在1/2 MS培养基上培养的种子，幼苗茁壮、长势旺盛。因此，种子发芽适宜的基本培养基为MS。}

2.3 不同培养基对喜马拉雅紫茉莉无菌苗生长的影响

将子叶展开的无菌苗继代转接到所试的5种培养基上培养至第30 d，各培养基上无菌苗的生长情况明显不同。MS培养基上无菌苗的叶片数最少，生长较慢；当添加6-BA 0.2 ~ 0.5 mg/L时，无菌苗叶片数最多，并且叶片肥厚宽大，茎节间较短，生长旺盛；当添加NAA 0.2 ~ 0.5 mg/L时，无菌苗的叶片数比对照的有所增加，较低浓度的NAA有利于叶片体积的增长，而较高浓度NAA下，虽然增加了叶片数，但是叶片较小，茎徒长，无菌苗瘦弱。

综上分析，喜马拉雅紫茉莉无菌苗培养适宜的培养基为MS+6-BA 0.2 mg/L。将子叶展开的无菌苗转接到该培养基上培养，无菌苗生长旺盛，培养至第30 d时，无菌苗平均叶片数为15.33个，叶片肥厚宽大，茎节间较短，无菌苗茁壮。

3 讨论与结论

种子发芽容易受到病害的影响，许多病害都是由带菌种子引起的。消毒是植物组织培养中的首要工作。本研究探讨了不同消毒剂对喜马拉雅紫茉莉种子消毒效果及种子发芽的影响，结果表明剥去外种皮的喜马拉雅紫茉莉种子最适消毒方法为75%乙醇1 min＋2% NaClO 15 min。在几种常用消毒剂（75%乙醇、HgCl₂、NaClO、Ca(ClO)₂、H₂O₂）中，HgCl₂的消毒效果是最好的。在本研究中，0.15% HgCl₂的消毒效果优于2%NaClO，但是从喜马拉雅紫茉莉种子的发芽率来看，NaClO处理要明显高于HgCl₂处理。其原因可能是，喜马拉雅紫茉莉种子上残留的NaClO消毒液将随着培养时间的延长而分解为氯气挥发掉，从而减轻其对种子的毒害作用，而残留的氯化汞却不能被分解掉，从而对种子产生持续的毒害，导致种子褐化死亡，从而降低种子的发芽率。

在种子发芽基本培养基的筛选方面，已有较多的研究报道。有些学者认为MS培养基中无机盐浓度高，尤其硝酸盐、钾盐和铵盐含量均较高，对植物种子萌发起一定的抑制作用，低无机盐类培养基，如1/2 MS、1/4 MS，有利于种子萌发^[16,19]。而本试验结果与上述结论正好相反，高无机盐浓度的MS培养基对喜马拉雅紫茉莉种子萌发及幼苗生长的影响显著优于1/2 MS，这可能与物种间差异有关。因此，在进行种子萌发和无菌苗培养时应根据不同植物选用不同的培养基。

据报道^[20]，适量浓度的6-BA对喜马拉雅紫茉莉幼苗生长有明显的促进作用，有利于幼苗干物质的累积，NAA则不利于幼苗干物质的累积。本研究也得到相似的结果，在喜马拉雅紫茉莉无菌苗培养时，向MS培养基中分别添加0.2 mg/L、0.5 mg/L的6-BA或NAA，结果表明6-BA处理下无菌苗生长的叶片数量最多，叶片肥厚宽大、茎节间较短，无菌苗生长旺盛，NAA处理下虽然无菌苗的叶片数也有所增加，但是叶片小而薄，茎徒长，无菌苗瘦弱。

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基金资助

西藏农牧学院2022年大学生创新创业训练计划项目，林芝市科技计划项目—校地合作项目(XDHZ-2020-01)