牦牛bta-miR-146a对卵巢卵泡颗粒细胞自噬的影响研究

Effect of Yak bta-miR-146a on Autophagy of Ovarian Follicular Granulosa Cells

摘要

自噬是细胞广泛存在的程序性死亡机制，通过对细胞内衰老细胞器、长寿命蛋白以及外源病原微生物进行吞噬、降解，以维持细胞平衡。在卵巢中，卵泡颗粒细胞自噬对卵泡发育起着关键作用，失衡会导致闭锁。为探究miR-106a对牦牛卵泡颗粒细胞自噬的影响，本试验通过体外分离培养牦牛卵泡颗粒细胞后，分别转染bta-miR-146a模拟物（bta-miR-146a mimics）和bta-miR-146a抑制剂（bta-miR-146a inhibitor），利用荧光定量RT-PCR法、Western Blot和激光共聚焦法检测细胞的自噬相关基因mRNA和蛋白表达情况。结果显示，转染bta-miR-146a mimic组与mimic NC组相比激光共聚焦可检测到LC3B蛋白荧光强度降低（P<0.01）；荧光定量RT-PCR检测发现LC3B、Atg-5和Beclin-1自噬指示基因mRNA表达量均极显著降低（P＜0.01）；bta-miR-146a inhibitor组与bta-miR-146a inhibitor NC组相比LC3B、Atg-5和Beclin-1极显著升高（P＜0.01），bta-miR-146a mimic组与bta-miR-146a inhibitor组相比，LC3B、Atg-5和Beclin-1自噬指示基因mRNA表达量极显著降低（P＜0.01）。Western Blot检测发现bta-miR-146a inhibitor组自噬指示蛋白LC3B、Atg-5和Beclin-1表达最高，bta-miR-146a mimic组表达最低；bta-miR-146a mimic组与bta-miR-146a mimic NC组相比，LC3B、Atg-5和Beclin-1蛋白表达极显著降低（P＜0.01），bta-miR-146a inhibitor组与bta-miR-146a inhibitor NC相比LC3B、Atg-5和Beclin-1蛋白表达极显著升高（P＜0.01），bta-miR-146a mimic组与bta-miR-146a inhibitor组相比，自噬指示蛋白LC3B、Atg-5和Beclin-1的表达量极显著降低（P＜0.01）。上述结果表明bta-miR-146a mimic抑制牦牛卵泡颗粒细胞的自噬，而bta-miR-146a inhibitor促进牦牛卵泡颗粒细胞的自噬。

Abstract

Autophagy is a mechanism of programmed cell death, which can maintain cell balance by phagocytosis and degradation of senescent organelles, long-lived proteins and exogenous pathogenic microorganisms. In the ovary, the autophagy of follicular granulosa cells plays a key role in follicular development, and imbalance can lead to atresia. In order to explore the effect of miR-106a on autophagy of yak follicular granulosa cells (GCs), yak follicular GCs was isolated and cultured in vitro and transfected with bta-miR-146a mimic (bta-miR-146a mimics) and bta-miR-146a inhibitor (bta-miR-146a inhibitor). The expression of autophagy related gene mRNA and protein in GCs cells was detected by fluorescence quantitative RT-PCR, WesternBlot and laser confocal method. The results showed that the fluorescence intensity of LC3B protein in bta-miR-146a mimic group was lower than that in mimic NC group (P < 0.01); and the expression of LC3B, Atg-5 and Beclin-1 autophagy indicator gene mRNA was significantly decreased by fluorescence quantitative RT-PCR (P < 0.01). The expression of LC3B, Atg-5 and Beclin-1 in bta-miR-146a inhibitor group was significantly higher than that in bta-miR-146a inhibitor NC group (P < 0.01), while the expression of LC3B, Atg-5 and Beclin-1 autophagy indicator gene mRNA in bta-miR-146a mimic group was significantly lower than that in bta-miR-146a inhibitor group (P < 0.01). WesternBlot detection showed that the expression of autophagy indicator proteins LC3B, Atg-5 and Beclin-1 was the highest in bta-miR-146a inhibitor group, and the lowest in bta-miR-146a mimic group. The expression of LC3B, Atg-5 and Beclin-1 in bta-miR-146a mimic group was significantly lower than that in bta-miR-146a mimic NC group (P < 0.01), while the expression of LC3B, Atg-5 and Beclin-1 in bta-miR-146a inhibitor group was significantly higher than that in bta-miR-146a inhibitor NC group (P < 0.01). The expression of autophagy indicator proteins LC3B, Atg-5 and Beclin-1 in bta-miR-146a mimic group was significantly lower than that in bta-miR-146a inhibitor group (P < 0.01). These results suggest that bta-miR-146a mimic inhibits GCs autophagy in yak follicles, while bta-miR-146a inhibitor promotes GCs autophagy in yak follicles.

Graphical abstract

关键词

牦牛 / bta-miR-146a / 颗粒细胞 / 自噬

Key words

Yak / Bta-miR-146a / Granulosa cell / Autophagy

细胞自噬（autophagy）是一个生物学概念，源自希腊语，其中“auto”意为“自己的”，而“phagein”意为“吃”。因此，细胞自噬的字面意思即为“细胞吃掉自己”。近年来，细胞自噬的研究取得了显著进展，其中，2016年日本科学家大隅良典（Yoshinori Ohsumi）因揭示细胞自噬的分子机制与生理功能，荣获诺贝尔生理学或医学奖^[1]，由此自噬引起人们在生理和病理研究领域更加广泛的关注。细胞自噬作为Ⅱ型程序性细胞死亡，是一种普遍的细胞程序性死亡机制，常见于真核细胞中，是一种常规的分解代谢过程。它在维持细胞能量平衡方面扮演着关键角色，通过分解并再利用细胞内各类物质的降解产物，为细胞稳态的维持提供必要的能量支持^[2]。在卵泡发育与闭锁的复杂过程中，卵泡颗粒细胞（granulosa cell，GC)的自噬现象占据了举足轻重的地位^[3]，这种自噬现象并非局限于某一特定阶段，而是可以贯穿于卵泡发育的多个不同环节。卵泡颗粒细胞的自噬一旦失衡，便会干扰卵泡内部的稳态，进而引发卵泡的闭锁现象^[4]。

非编码RNA（non-coding RNA，ncRNAs）是指一类不直接参与蛋白质编码的RNA分子。这些RNA在生物体内发挥着关键的作用，它们能够影响染色体的结构，参与表观遗传学的调控，并对基因转录过程施加影响。具体来说，ncRNAs涵盖了多种类型，如长链非编码RNA（lncRNA）、环状RNA（circRNA）、核仁小RNA（snoRNA）、piwi蛋白互作RNA（piRNA）以及miRNA等。这些RNA分子在生物体内广泛存在，并且拥有广泛的调控功能^[5]。miRNAs，作为一种内源性非编码RNA，其长度大约为20至25个核苷酸，这些miRNAs源自单链RNA分子，并具有独特的“发卡结构”，在基因表达调控中发挥着至关重要的作用，它们通过与互补的靶基因mRNA结合来抑制其表达；miRNAs的前体经历内啡肽酶的加工处理，进而形成成熟的miRNA分子，这些成熟的miRNA随后被加载到RNA诱导的沉默复合物中，以实现其生物学功能；成熟的miRNAs在细胞发育、分化以及疾病进程中扮演着关键角色，对生物体的调控机制具有重要意义^[6]。

近年来越来越多的证据表明，miRNAs参与细胞自噬调控过程。miRNA通过其靶基因控制包括卵泡闭锁在内的多种生物学过程，并在自噬调控中发挥作用^[7-11]。miR-146在脊椎动物进化过程中序列保守，人类基因组miR-146家族由两个成员基因组成，即miR-146a和miR-146b。这两个微RNA分别位于5号和10号染色体上，在许多情况下表现出不同的调节^[12]。然而，它们在序列上几乎相同，共享一个种子区域，因此被预测会针对同一组基因^[13]。基因敲除研究表明，miR-146a缺乏会导致IL-6和TNFα产生过多、骨髓增生综合征、慢性炎症以及造血干细胞数量和质量下降^[14-15]。在miR-146a表达缺失的情况下，由于Stat1过表达，调节性T淋巴细胞失去其抑制作用，导致IFN-γ分泌减少^[16]。为探究bta-miR-146a对牦牛卵泡GC自噬的影响，本试验通过体外分离培养牦牛卵泡GC，分别转染bta-miR-146a模拟物和抑制剂，了解其对牦牛卵泡GC自噬的影响，这有助于进一步阐明牦牛卵泡发育和闭锁的分子调控机制。

1 材料与方法

1.1 主要试剂与仪器

DPBS缓冲液、青链霉素混合液、DMEM培养液、Trypsin-EDTA、胎牛血清，购自美国Gibco公司；Trizol试剂，购自美国Invitrogen公司；mRNA反转录试剂盒，购自北京庄盟国际生物基因科技股份有限公司；RNA wait，购自Biosharp公司；AceQ qPCR SYBR Green预混液（无ROX），购自南京诺唯赞生物科技有限公司；PCR Premix Taq^TM、DEPC，购自宝日医生物技术北京有限公司；Lipofectamine^TM 3000、BCA蛋白定量试剂盒，购自美国Thermo Fisher公司；ECL显影液、硝酸纤维素NC膜，购自美国Sigma公司。

蛋白电泳装置（Criterion^®，美国Bio-rad公司）；荧光定量PCR仪（CFX Opus 96，美国Bio-rad公司）；台式低速离心机（HDL-4，常州华奥仪器制造有限公司）；全自动化学发光分析系统（Tanon 5200，上海天能生命科学有限公司）；激光共聚焦显微镜（Stellaris 5，德国徕卡公司）；CO₂培养箱（CCL-170B-8，新加坡艺思高科技有限公司）；高速冷冻离心机（Centrifuge 5430，德国Eppendorf公司）；荧光倒置显微镜（IX3-SVR，日本Olympus公司）；多功能酶标仪（Multiskan FC，美国Thermo Fisher ScientificOy公司）；超微量分光光度计（NanoDrop 2000，美国Thermo Fisher公司）。

1.2 牦牛卵泡原代GCs分离培养及传代

将卵巢放入无菌烧杯中，用含1%双抗的37℃ DPBS冲洗2~3次。使用12号针头的注射器预吸5 mL 37 ℃含1%双抗的DPBS，再吸取卵巢表面颜色明亮和血管丰富的卵泡（直径2~8 mm）。将吸取的卵泡液置于15 mL离心管中，37 ℃静置10 min弃上清，重复2~3次。加入5 mL 37℃ DPBS重悬沉淀，经70 μm细胞筛过滤，1 000 r/min离心5 min弃上清。将沉淀移至1.5 mL离心管中，用含10%胎牛血清的培养液重悬GCs，倒置显微镜下进行细胞计数。根据细胞数量，将GCs密度调整为0.3×10⁶个接种于35 mm细胞培养皿中。在37 ℃、5% CO₂、95%相对湿度的培养箱中进行培养。

待原代GCs生长至90%左右时，弃去培养液，用预热的37 ℃ DPBS缓冲液洗涤细胞2~3次，然后加入0.5 mL 0.25%胰酶消化液，放入培养箱消化2~5 min。随时在倒置显微镜下观察胰酶消化情况，当细胞质回缩，胞体变圆时立即终止消化。加入GCs培养液吹打，制成细胞悬液，1 000 r/min离心4 min，弃上清，重复2次，再加入1 mL细胞培养液重悬，一传三接种于35 mm细胞培养皿中，继续培养。

1.3 牦牛bta-miR-146a mimics、inhibitors合成及转染效率测定

参考miRBase数据库中bta-miR-146a序列（登录号：MIMAT0009236），由广州锐博生物公司合成bta-miR-146a mimics、bta-miR-146a inhibitors NC、bta-miR-146a mimics NC和bta-miR-146a inhibitors。利用Lipo 3 000转染试剂将mimic/inhibitor分别稀释，按照20 μmol∙L^-1的浓度分别转染牦牛GCs，经qPCR法检测其在牦牛GCs的转染效率达70%左右，再用于后续的试验。

1.4 miR-146a mimics和miR-146a inhibitors转染GCs

牦牛原代GCs经2次传代，细胞生长状态较好并呈对数生长期时，开始准备转染。在6孔板中，每孔接种1×10⁶个细胞，每孔加2 mL的细胞培养液，放入CO₂培养箱中培养24 h。然后按照Lipofectamine 3 000转染试剂说明书进行转染，取250 μL Opti-MEM培养液稀释6 μL载体/50 nM siRNA/miR-146a mimics/miR-146a inhibitors，250 μL Opti-MEM 培养液稀释 6 μL的 Lipofectamine 3 000转染试剂，室温静置5 min。轻轻吹打混匀，静置20 min后，缓慢加入至GCs细胞内，转染6 h后更换为新鲜细胞培养液，继续培养48 h。

细胞分为4组：（1）bta-miR-146a抑制剂组（bta-miR-146a inhibitor）；（2）bta-miR-146a抑制剂对照组（inhibitor NC）；（3）bta-miR-146a过表达组（bta-miR-146a mimic）组；（4）bta-miR-146a过表达对照组（mimic NC）；转染6 ~ 8 h后，更换为正常培养基继续培养，24 h收取细胞总RNA进行实时荧光定量PCR检测，48 h后收取细胞总蛋白进行Western blot试验和激光共聚焦检测。

1.5 总RNA提取及反转录

采用Trizol法提取细胞总RNA，具体操作步骤参照试剂盒说明书进行，使用NanoDrop 2 000超微量分光光度计检测RNA浓度和纯度（D260 nm/D280 nm=1.8 ~ 2.0），-80 ℃保存。

根据反转录试剂盒Reverse Transcriptase kit说明进行mRNA反转录合成cDNA，具体操作如下：反转录体系为20 μL，在冰上操作，在无RNA酶的离心管中加入总RNA 2 μL、RT Enzyme Mix 3 μL、RT Reaction Mix 7 μL、RNase-Free ddH₂O 8 μL；反应条件为45 ℃ 50 min，72 ℃ 15 min，RT-PCR产物-20℃保存备用，用于后续基因实时荧光定量PCR检测。

1.6 实时荧光定量PCR检测

使用实时荧光定量RT-PCR方法检测基因mRNA表达水平，引物序列见表1，以β-actin为内参基因。PCR反应体系10 μL：SYBR qPCR Master Mix 5.0 μL，上、下游引物（10 μmol∙L^-1）各0.4 μL，RT产物1.0 μL，ddH₂O 3.2 μL。PCR反应条件：95 ℃预变性5 min；95 ℃变性30 s，60 ℃退火30 s，72℃延伸45 s，共42个循环；熔解曲线温度为65 ℃~95 ℃，每隔0.05 ℃读板1次，温度恒定0.5 s后读板。每组cDNA样品重复3次，通过熔解曲线分析并确定实时荧光定量PCR产物特异性。根据2^-△△Ct法计算相对表达量。

1.7 细胞总蛋白提取和Western blot检测

将转染后的细胞使用DPBS洗涤3遍，弃除PBS。在6孔细胞培养板内加入600 μL RIRA蛋白裂解液，收集蛋白样品，转移至1.5 mL EP管中，将EP管置于冰盒，静置裂解30 min，4 ℃ 12 000 r/min离心10 min。再使用BCA蛋白定量试剂盒测定蛋白质的浓度。

吸取30 μg蛋白质样品与5×上样缓冲液混合，在100 ℃变性10 min。将变性后样品按20 μL/孔加入样品孔，浓缩胶选择电压80 V电泳30 min，分离胶选择电压120 V电泳2 h。后取出凝胶，切下目的蛋白条带所在的凝胶，并在转膜缓冲液中漂洗数秒，覆上NC膜，然后200 mA恒流条件下转膜2 h将目的蛋白条带转移至NC膜上。将NC膜转移至湿盒中，加入5%脱脂牛奶，置于摇床封闭2 h。TBST洗脱3次，每次5 min，加入（1：1 000）一抗，摇床上轻轻摇晃，4 ℃孵育过夜。TBST洗脱3次，每次5 min，加入（1：2 000）二抗，室温孵育2 h。加入ECL发光液，使用全自动化学发光成像分析系统进行曝光检测目的蛋白条带。使用Image J软件分析目标条带的光密度值，以目的条带和内参条带的比值代表目的蛋白的表达水平，实验重复3次。

1.8 激光共聚焦检测

将处理后的牦牛GCs加入预冷的DPBS洗3遍后用胰酶消化7 min，移去胰酶，用含10% FBS和1%双抗的DMEM培养基重悬细胞，按照1×10⁶个/孔铺于含有细胞玻片的12孔细胞培养板中。弃掉培养液，用DPBS洗2~3次；弃DPBS后加1 mL预冷的4%多聚甲醛，固定细胞，37 ℃温箱中静置30 min；弃多聚甲醛后加入每孔加入1 mL DPBS，洗3次，5 min/次；弃DPBS后加600 μL 0.1%的Triton-100，室温透膜静置20 min；弃掉后加DPBS，洗3次，5 min/次。5% BSA，室温静置封闭1 h；按照1：200的比例将山羊抗兔LC3B一抗稀释于5% BSA中，按1 mL/孔的量加入，4 ℃过夜孵育；PBST洗5遍；将山羊抗兔TIRTC二抗用5% BSA按照1：200比例稀释后按1 mL/孔的量加入，37 ℃温箱中避光孵育1 h；PBST洗5遍；加入4，6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）室温避光孵育15 min以标记细胞核；PBST洗5遍；最后，用激光共聚焦显微镜观察LC3B蛋白在牦牛卵巢GCs中的表达情况。

1.9 统计分析

使用Image J软件，进行荧光强度和蛋白曝光后的图像进行数据处理。组数据之间进行t检验；多组数据先采用One-way ANOVA进行组间分析，再利用LSD和Duncan法进行多重比较。利用GraphPad Prism 8作图。实验结果采用平均值±标准差（Mean±SD）表示，设置显著水平为P＜0.05或P＜0.01。

2 结果

2.1 牦牛卵泡原代GCs分离培养结果

在倒置显微镜下观察发现，分离的原代牦牛GCs呈球形，均匀地悬浮在培养液中（图1A），随着培养时间的增加，72 h时GCs呈现聚集生长趋势，聚集成团块状（图1B）。继续培养96 h后，GCs开始延伸呈分散型生长（图1C）。继续培养120 h时，GCs长满培养皿底部，形成单层的GCs（图1D）。

2.2 牦牛bta-miR-146a对牦牛GCs自噬的影响

牦牛卵泡GCs分别转染bta-miR-146a mimics和bta-miR-146a inhibitors，探究bta-miR-146a对牦牛卵泡GCs自噬的影响。利用激光共聚焦检测牦牛GCs中LC3B蛋白荧光的表达，结果显示bta-miR-146a mimics组与mimic NC组相比LC3B蛋白荧光强度降低（图2A，P＜0.01）。实时荧光定量RT-PCR结果如图2B所示，bta-miR-146a inhibitors组自噬指示基因LC3B、Atg-5和Beclin-1表达最高，bta-miR-146a mimics组表达最低；bta-miR-146a mimics组与bta-miR-146a mimics NC组相比，LC3B、Atg-5和Beclin-1自噬指示基因表达量极显著降低（P＜0.01），bta-miR-146a inhibitors组与bta-miR-146a inhibitors NC组相比LC3B、Atg-5和Beclin-1极显著升高（P＜0.01），bta-miR-146a mimics组与bta-miR-146a inhibitors组相比，LC3B、Atg-5和Beclin-1自噬指示基因表达量极显著降低（P＜0.01）。Western Blot检测结果如图2C所示，bta-miR-146a inhibitors组自噬指示蛋白LC3B、Atg-5和Beclin-1表达最高，bta-miR-146a mimics组表达最低；bta-miR-146a mimics组与bta-miR-146a mimics NC组相比，LC3B、Atg-5和Beclin-1蛋白表达极显著降低（P＜0.01），bta-miR-146a inhibitors组与bta-miR-146a inhibitors NC相比LC3B、Atg-5和Beclin-1蛋白表达极显著升高（P＜0.01），bta-miR-146a mimics组与bta-miR-146a inhibitors组相比，自噬指示蛋白LC3B、Atg-5和Beclin-1的表达量极显著降低（P＜0.01）；上述结果表明bta-miR-146a mimics抑制牦牛卵泡GCs的自噬，而bta-miR-146a inhibitors促进牦牛卵泡GCs的自噬。

3 讨论

卵巢卵泡中的GC（颗粒细胞）是不可或缺的功能性细胞，它们通过产生激素促进生殖器官的生长和发育，并在特定模式下调节卵母细胞的成熟与卵泡的生长^[17-18]。在本研究中，我们成功地在体外分离并培养了牦牛的原代GCs。起初，这些细胞呈球形，悬浮在细胞培养液中。随着培养时间的推进，GCs开始呈现聚集生长的态势，形成团块状。随后，它们又开始延伸，展现出分散型生长的模式。这些观察结果与王立斌^[19]、唐紫雯^[20]和王强龙^[21]等人体外分离的牦牛GCs的形态和培养特性相似，表明本试验成功体外分离和培养出牦牛的卵泡GCs。

GC的自噬现象与卵泡闭锁之间存在着紧密的联系^[22]。自噬是一个依赖溶酶体空泡的过程，它选择性地降解并回收细胞内的胞浆成分^[23]。这一机制在维持细胞能量平衡中发挥着关键作用，因为它能够分解细胞内易于聚集的蛋白、脂类和细胞器等物质，并将这些分解产物回收再利用^[24-25]。GC的自噬活动在卵泡发育和闭锁过程中具有显著影响，特别是在卵泡内部稳态失衡时，自噬作用可能导致卵泡闭锁，而GC的自噬可发生在卵泡发育的不同阶段^[3-4]，因此研究GCs自噬的分子调控机制有助于全面了解卵泡发育和闭锁。

miRNAs通过与靶基因mRNA的3′-UTR区域互补结合，调节靶mRNA的翻译过程^[26]，进而影响包括卵泡闭锁在内的多种生物学过程，并在自噬调控中发挥重要作用^[7]。例如，miRNA-21-3p能够抑制牛卵巢颗粒细胞的自噬^[8]；在卵巢早衰疾病中，miR-15a-5p在GCs中被上调，并通过PI3K-Akt-mTOR通路促进GCs自噬^[9]；在小鼠GC细胞中，miRNA let-7g通过抑制IGF-1R的表达和调节蛋白激酶B的磷酸化作用来影响自噬活性^[10]；在牛卵泡发育的研究中，GCs自噬被证明是导致卵泡闭锁的原因之一，而miRNA-21-3p则通过AKT/mTOR通路抑制牛卵泡GCs的自噬^[8,11]。miR-146a位于5号染色体上，其序列在脊椎动物进化过程中高度保守，并在多种情况下表现出不同的调节功能^[12]。已有研究表明，miR-146a能够调控细胞自噬过程，例如，它可以通过调节Beclin-1的表达来增强前列腺癌症细胞的自噬^[27]；同时，miR-146-5p还能靶向高度富集在人的血细胞内与信号传导相关的自噬途径^[28]；在癌症相关的蛋白质途径及其调节方式中，miR-146被视为调控自噬过程的候选基因^[29]。在不同动物的繁殖调控方面的研究表明，miRNAs也可通过靶向Smad4影响卵泡GCs的功能。例如，miR-146通过抑制Smad4基因的表达而参与到TGF-β信号通路的调节过程中^[30-31]，且在牦牛方面的研究表明Smad4基因是bta-miR-146a的靶基因^[32]。本研究在此基础上进一步探究，结果显示过表达bta-miR-146a会降低牦牛GC的自噬水平，而使用bta-miR-146a的抑制剂则会产生相反的效果。这充分说明了bta-miR-146a在牦牛卵泡颗粒细胞自噬调控中的重要作用，但其具体机制仍需进一步地研究和探讨。

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基金资助

国家自然科学基金(31960661)

西藏自治区科学技术厅区域科技协同创新专项(QYXTZX-NQ2022-04)

西藏自治区科技厅重点研发计划项目(XZ202301ZYO003N04)