紫花亚菊抗结核分枝杆菌活性研究

A Study of Ajania purpurea Activity Against Mycobacterium tuberculosis

摘要

通过制备紫花亚菊（Ajania purpurea）的乙醇粗提物及其有机溶剂萃取物，采用MABA法追踪紫花亚菊抗结核分枝杆菌（Mycobacterium Tuberculosis）的活性成分并利用分子对接、GO功能等探究其活性成分抗结核分枝杆菌潜在机制，以期为开发新型抗结核分枝杆菌药物提供实验数据。结果表明，紫花亚菊乙醇粗提物体外抗结核分枝杆菌活性MIC（最低抑菌浓度（Minimum Inhibitory Concentration， MIC）是指在体外培养细菌18至24 h后能抑制培养基内病原菌生长的最低药物浓度，是测量抗菌药物的抗菌活性大小的一个指标。）为152.34 μg/mL；紫花亚菊石油醚、乙酸乙酯、正丁醇以及水相萃取物体外抗结核分枝杆菌MIC分别为 101.56 μg/mL、95.61 μg/mL、1 647.81 μg/mL、1 000 μg/mL。紫花亚菊的两种主要药物活性成分作用靶点主要聚集在结核分枝杆菌菌内细胞溶质、细胞壁、质膜这三种细胞功能途径上。综上所述，紫花亚菊乙酸乙酯萃取物体外抗结核分枝杆菌活性最好，紫花亚菊可能通过细胞溶质、细胞壁、质膜这三种细胞功能途径进而发挥抗结核分枝杆菌作用。

Abstract

By preparing the ethanolic crude extract and organic solvent extract of Ajania purpurea, the active ingredients of Ajania purpurea against Mycobacterium tuberculosis were traced by MABA method and the potential mechanism of the active ingredients against Mycobacterium tuberculosis was investigated by molecular docking and GO function, which is to provide experimental data for the development of new anti-Mycobacterium tuberculosis drugs. The results showed that the in vitro anti-Mycobacterium tuberculosis MIC(Minimum Inhibitory Concentration (MIC) refers to the minimum drug concentration that can inhibit the growth of pathogenic bacteria in the culture medium after 18 to 24 hours of in vitro cultivation of bacteria, and is an indicator for measuring the antibacterial activity of antibiotics) of the ethanolic extract of Ajania purpurea was 152.34 μg/mL; the in vitro anti-Mycobacterium tuberculosis MIC of petroleum ether, ethyl acetate, n-butanol and aqueous phase extraction of Ajania purpurea were 101.56 μg/mL, 95.61 μg/mL, 1 647.81 μg/mL and 1 000 μg/mL, respectively. The targets of the two main active ingredients of Ajania purpurea were mainly concentrated in the three cellular functional pathways of cytosol, cell wall and plasma membrane in Mycobacterium tuberculosis. In summary, it was concluded that the best in vitro activity against Mycobacterium tuberculosis was achieved by ethyl acetate extraction of Ajania purpurea. The anti-Mycobacterium tuberculosis effect may be achieved by affecting the production of some essential functional proteins in Mycobacterium tuberculosis, disrupting the integrity of the cell wall, disrupting intracellular homeostasis, disrupting energy metabolism, and affecting the synthesis of lipid components of the cell wall of Mycobacterium tuberculosis.

Graphical abstract

关键词

紫花亚菊 / 结核分枝杆菌 / 结核病

Key words

Ajania purpurea / Mycobacterium tuberculosis / Tuberculosis

结核病是一种由结核杆菌引起的强传染性的人畜共患病^[1],养殖从业者、基层兽医工作人员和教学实训场所的师生均属于人畜共患病感染高危人群^[2]。随着我国经济的不断发展,人们的生活水平也越来越高,人们对于新鲜牛奶的需求量也是逐年增高,加速了奶牛的饲养数量^[3]。然而，目前我国奶牛的防疫措施仍存在不足，导致结核病的发生和传染。其中，牛类最易感染,猪、猴也有发生,马羊少见,人也可感染^[3]。结核病的病原菌可通过人畜呼吸道、消化道、生殖道或皮肤、黏膜进行传播，人类接触带菌动物或食用带菌的乳制品或未煮的肉类均可被感染^[2]。目前，尚无能够有效预防牛羊结核病的疫苗，也没有特效药物可供治疗^[4]。然而，一些兽医人员在对患病畜禽进行诊治的过程中倾向于使用抗生素，通常通过在饲料中添加抗生素的方式治疗^[5]。目前，在国内外普遍采用链霉素、异烟肼以及氨基水杨酸钠等肌肉注射以及配合口服的方式治疗阳性病牛^[6]，但是其实这样的治疗方式并不可取。虽然在发病初期对病情有所改善，然而并不能根治该病，同时该方法治疗周期较长、费用花费较大、治疗效果也并不理想^[6]。另外，抗生素都具有比较特殊的性质，所以在畜禽体内发生残留的概率非常大，之后畜禽的肉品及其制品进入人类的餐桌之后，就会存在食用这些具有抗生素残留的肉类而严重影响人体的健康状况^[5]。因此，中草药制剂作为一种无害化、低污染、低毒性的产品，成为替代化学合成抗生素的最佳选择，对畜牧业的健康绿色发展至关重要^[7]。

藏药作为民族医药的重要组成部分，具有独特的医药理论体系，并在维护当地人民健康以及地区文化的传承方面都起到了重要的作用^[8]。藏医药在疾病防治方面积累了丰富的临床经验，从藏药中寻找和开发相关治疗药物是可行途径之一^[9]。紫花亚菊为菊科亚菊属植物，是我国特有植物，据文献记载，紫花亚菊具有清肺止咳、祛痰、散热、解毒的功效^[10]。然而，关于紫花亚菊在治疗结核病方面的研究还较少，本文旨在通过基础实验探究藏药紫花亚菊体外抗结核分枝杆菌的活性，并探讨其潜在机制，为后续开发治疗结核病的药物提供理论基础。

1 材料和方法

1.1 药材与菌株

紫花亚菊（Ajania purpurea）属于菊科植物、亚菊属，小半灌木，高可达25 cm，采自西藏山南地区，经本校植物学教授鉴定，本品自留一部分存于实验室，以备后期查验。实验菌株为结核分枝杆菌菌株H37Ra (ATCC 25177)。

1.2 试剂与耗材

乙醇、石油醚、正丁醇、乙酸乙酯、吐温80、二甲基亚砜（均购自成都金山化学试剂有限公司），Middlebrook 7H9干粉培养基、Middlebrook OADC（均购自美国BD公司），孔雀石绿（购自生工生物上海股份有限公司），谷氨酸钠、柠檬酸镁、七水硫酸镁等（均购自成都市科龙化工试剂厂）。

1.3 改良罗氏培养基制备

超净工作台中，无菌操作下进行将匀质全卵液：改良罗氏培养基基础液：2%孔雀石绿溶液=5：3：0.1的比例混匀^[11]。因西藏自治区拉萨市处于高原地区，其具有独特的高原气候特色，如气压低、沸点低（仅为78.5 ℃～80 ℃），因此将混匀的液体进行分装置于25 ml的罗氏培养管中，约7 ml～8 ml/管，略微旋管盖后置于罗氏培养管架。将罗氏培养管架倾斜30°置于蒸汽凝固器中分3次进行凝固；第一次凝固条件设置为72 ℃，50 min，冷却并放置过夜；第二次凝固条件设置为78 ℃，30 min，冷却并放置过夜；第三次凝固条件设置为82 ℃，20 min，冷却并放置过夜；经无菌试验后，4 ℃保存备用。

1.4 实验药材的粗提物及萃取物制备

将紫花亚菊进行阴干、粉碎，过20目筛，称取50 g，以1:10比例分别利用75%～95%～65%不同浓度的乙醇室温浸泡24 h后超声提取30 min。粗提液经旋转蒸发浓缩后真空冷冻干燥，4 ℃保存备用。将紫花亚菊的乙醇粗提物以蒸馏水溶解，然后依次使用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇进行萃取（粗提物水溶液与萃取溶剂体积比为1:1），萃取液经旋转蒸发浓缩后真空冷冻干燥，4 ℃保存备用。

1.5 阿尔玛蓝（MABA）法

对96孔板进行如下标记：实验组、对照组、空白对照组、菌液对照组、日期。按照要求加入药物原液并进行依次2倍稀释，利用比浊仪配置1麦氏浓度的结核分枝杆菌溶液并按照1：10进行稀释后备用，设置只含7H9液体培养基的空白对照组和只含结核分枝杆菌H37Ra菌液的菌液对照组，后将96孔板置于湿盒中，恒温培养箱中37 ℃培养6 d；37 ℃恒温培养箱中培养第7 d，使用8通道移液器依次向各孔加入刃天青试剂，32.5μL/孔；将96孔板置于37 ℃恒温培养箱中继续培养24 h后观察各孔颜色变化，孔内颜色由蓝色变为粉红色者，提示有菌生长，反之视为无菌生长。

1.6 紫花亚菊的主要成分获取

经检索与查阅相关文献，紫花亚菊的相关文献较少，相关研究学者通过LC-MS分析得出紫花亚菊的主要成分为胡椒碱和绿原酸^[12]。

1.7 结核分枝杆菌核心靶点基因及其相应蛋白质结构

利用NCBI数据库，以“Mycobacterium tuberculosis H37Rv”为检索名称，共检索出4 009个靶点基因，将其导入String数据库构建PPI拓扑图，见图2。下载其tsv格式数据并导入Cytoscape 3.6.1软件，以“degree值≥44”筛选出结核分枝杆菌MTB H37Rv核心靶点基因共计73个，见表6，图3。通过PDB数据库下载核心靶点基因蛋白结构，根据分子对接蛋白结构六大原则^[13]，共计获取31个核心靶点基因相应的蛋白结构，其相应核心靶点基因为adk、nadk、eccA5、fadB、fas、gltS、groEL2、groES、guaB2、gyrB、leuA、mas、mbtL、mdh、pkg、pheT、pks13、ppsB、ppsC、pykA、recA、ribA2、rpoA、rpoB、rpoC、tuf、tsf、tfi、topA、rpsG、rpsA。

1.8 药物-靶点基因蛋白结合活性（分子对接）分析

将检索所获药物活性成分导入Discovery Studio Client 2019软件，选择View、Graphics，在Small Molecules中选择prepare Ligands进行药物活性分子对接前的准备。将筛选出的结核分枝杆菌MTB H37Rv的核心靶点基因蛋白导入Discovery Studio Client 2019软件进行分子对接^[14]。

1.9 生物通络富集分析

利用DAVID数据库(https://david.ncifcrf.gov/)^[15]，将筛选出的结核分枝杆菌MTB H37Rv的核心靶点基因蛋白导入，设置物种为“Mycobacterium tuberculosis H37Rv”、Identifier选择为“OFFFICIAL-GENE-SYMBOL”分析条件后，对结核分枝杆菌MTB H37Rv的核心靶点基因进行GO功能和KEGG通路富集分析，设定标准为P＜0.01，并对结果构建桑基图、条形图进行可视化分析。

2 结果

2.1 紫花亚菊体外抗结核分枝杆菌的活性结果

本研究通过MABA的方法探究紫花亚菊体外抗结核分枝杆菌的活性研究发现，紫花亚菊的乙醇粗提物体外抗结核分枝杆菌的MIC值为152.34 μg/mL；紫花亚菊的石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物、正丁醇萃取物、水相萃取物体外抗结核分枝杆菌的MIC值分别为101.56 μg/mL、95.61 μg/mL、1 647.81 μg/mL、1 000.00 μg/mL，具体见表1。

2.2 分子对接结果

利用ZinC数据库进行检索并下载获得胡椒碱和绿原酸两种药物活性分子3D分子结构式，并通过StoneMIND Collector软件进行结构识别和修饰，利用Discovery Studio Client 2019对药物活性成分和利用PDB数据库检索、筛选并获得的31个结核分枝杆菌MTB H37Rv核心靶点蛋白，其后再进行药物活性成分与核心靶点蛋白对接前的准备并完成药物活性成分与核心靶点蛋白结构的分子对接。结果表明，胡椒碱与MTB的tpi, ppsC, pheT, mas, guaB 2等靶点蛋白分子接合颜色较红,绿原酸与MTB的ppsC, pgk, mdh, guaB 2等靶点蛋白分子接合颜色较红，颜色越红，表示对接效果越好，无法对接（对接失败）即评分为0分，用深蓝色表示，具体结果如图1所示。

2.3 生物通络富集分析结果

根据分子对接结果，将胡椒碱药物活性成分对接成功的结核分枝杆菌基因和绿原酸药物活性成分对接成功的结核分枝杆菌基因分别导入DAVID数据库，限定物种为“Mycobacterium tuberculosis H37Rv ”、选择Identifier为“OFFFICIAL-GENE-SYMBOL”进行GO功能富集分析，设定标准为P<0.01，将胡椒碱药物活性成分对接成功的结核分枝杆菌基因进行GO功能分析共计获得16条GO功能条目，其中GOTERM_BP_ALL共计4条，GOTERM_CC_ALL共计3条，GOTERM_MF_ALL共计9条，如图2所示。绿原酸药物活性成分对接成功的结核分枝杆菌基因进行GO功能分析获得12条GO功能条目，其中GOTERM_BP_ALL共计3条，GOTERM_CC_ALL共计3条，GOTERM_MF_ALL共计6条，如图3所示。从结果上看紫花亚菊的两种主要药物活性成分作用靶点主要聚集在结核分枝杆菌菌内细胞溶质、细胞壁、质膜这三种细胞功能途径上。

3 讨论

实验结果显示，紫花亚菊的石油醚和乙酸乙酯萃取物具有较好的体外抗MTB H37Rv菌株效果，这可能和石油醚和乙酸乙酯萃取物多为小极性成分，其分子量一般＜100，直径一般＜0.4 nm，易穿过细胞膜。结核分枝杆菌细胞壁含有大量的脂类，其细胞壁对大极性分子通透性差，对小极性分子通透性较大，这可能是石油醚和乙酸乙酯提取物效果较好的原因。

从分子对接结果上看，紫花亚菊的主要成分胡椒碱和绿原酸两种药物活性成分均对结核分枝杆菌有一定潜在作用。胡椒碱与MTB的tpi，ppsC，pheT，mas，guaB2等靶点蛋白分子结合活性分数较高， 胡椒碱是一种从胡椒属植物中提取的生物碱，主要存在于胡椒、荜茇、葛花、肉豆蔻、乌梅、辣椒、丁香等中草药中。研究表明，胡椒碱具有抗感染、抗氧化、抗惊厥、抗炎、免疫调节和抗肿瘤等广泛的药理作用^[16]。提示胡椒碱可能通过参与结合分枝杆菌的糖异生代谢和合成结合分枝杆菌细胞壁脂质成分以及调节能量代谢过程中某些酶的合成来发挥抗结核分枝杆菌作用。也有研究发现，胡椒碱可以通过抑制NF-κB的活化和NF-κB抑制蛋白的降解，进而减轻脂多糖诱导的小鼠急性肺损伤模型中LPS诱导的肺水肿、中性粒细胞在肺内的浸润和炎性细胞因子TNF-α、白细胞介素-6(IL-6）和白细胞介素-1β（IL-1β）的产生^[17]。绿原酸与ppsC,pgk,mdh,guaB2等靶点蛋白分子结合活性分数较高，绿原酸是由奎尼酸和咖啡酸缩合合成的有机酚类化合物，主要存在于川芎、菊花、黄连蔓荆子、当归等中草药中。研究发现绿原酸具有抗菌、抗病毒、保肝利胆、抗肿瘤、降血压、清除自由基和兴奋中枢神经系统等作用^[18]，其抗菌机制主要是破坏细菌的细胞壁的完整性，造成胞膜的通透能力的变化，进而引起相关电解质、酶及DNA、RNA泄出，从而破坏结构的稳定，导致细菌死亡^[19]。也有研究发现绿原酸可以通过miR-223/NLRP3轴，增加miR-223表达，进而抑制NLRP3表达，从而达到减轻LPS诱导的急性肺损伤小鼠的肺组织病理损伤的目的^[20]。

从GO功能分析结果上看，紫花亚菊的两种主要药物活性成分作用靶点主要聚集在结核分枝杆菌菌内细胞溶质、细胞壁、质膜这三种细胞功能途径上。胡椒碱和新绿原酸这两种药物活性成分杀灭结核分枝杆菌，可能主要是药物活性成分进入结核分枝杆菌通过影响其菌内细胞溶质、细胞壁、细胞膜这三种细胞功能途径发挥抑制或杀死结核分枝杆菌。结核分枝杆菌的细胞溶质通路介导ESX-1底物ESAT-6的吞噬体破坏活动，结核分枝杆菌ESX-1分泌系统似乎是一种用于攻击宿主膜靶向蛋白的专门系统，其主要功能是阻断宿主的先天免疫机制中的关键步骤。因此筛选的中草药药物活性成分可能通过阻断ESX-1系统发挥抗结核分枝杆菌作用^[21-22]。活性成分也可能通过菌细胞壁分子表达的变化导致细胞壁通透性以及对环境压力和药物的抗性改变，进而影响结核分枝杆菌的存活^[23-24]。不可否认网络药理学分析存在一定不足，原因是不同数据库筛选出来的靶点基因或成分可能会有所不同，存在一定程度上的误差；分子对接计算模拟结合活性结果也存在一定不确切性，需后期进一步用实验进行验证。但本研究的结果仍具有一定的价值，可为后续进一步深入研究这些藏药材的抗菌活性提供一定的研究方向。

4 结论

综上所述，本研究发现紫花亚菊药物活性成分可能主要通过结核分枝杆菌菌内细胞溶质、细胞壁、质膜这三种细胞功能通过影响结核分枝杆菌菌内部分必要功能蛋白的产生、破坏细胞壁的完整性、菌内稳态紊乱、能量代谢紊乱、影响合成结合分枝杆菌细胞壁脂质成分等生理生化功能进而发挥抗结核分枝杆菌作用。

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基金资助

西藏大学研究生“高水平人才培养计划”项目(2020-GSP-S074)