基于糖酸与氨基酸组成的苹果风味评价

Apple flavor evaluation based on the composition of sugar acid and amino acid

摘要

本文通过比较西藏林芝地区主要栽培七种苹果果实中糖酸含量、游离氨基酸含量及其滋味强度，选择适合林芝苹果风味的综合评价指标，为林芝主产苹果果实的风味品质评价提供参考。按国标测定苹果果实糖酸含量，采用高效液相色谱法测定游离氨基酸组分含量并结合味道阈值分析TAV值。7个品种果实总糖含量的变幅为89.75 ~ 111.8 mg·g^-1，果糖含量均值占总糖的49%，其次为蔗糖与葡萄糖。总酸的变幅为2.81 ~ 5.99 mg·g^-1，苹果酸占总酸含量91.1%，各有机酸糖含量高低顺序为苹果酸＞奎宁酸＞柠檬酸＞草酸。西藏林芝地区主要栽培七种苹果果实甜度大小顺序为黑钻>华硕> 红富士>红将军>锦绣红>日本富士>黄香蕉。西藏林芝地区主要栽培7个苹果中果糖含量占比较高，苹果酸占有机酸的主导地位，总酸含量是影响果实风味的重要因素，以甜度值、甜酸强度比、糖酸比、甜酸度评价苹果风味较真实，19种FAA对林芝地区苹果的芳香味贡献最大，对鲜味、苦味、甜味和酸味的贡献较小。通过本研究确定适合林芝苹果风味的综合评价指标。

Abstract

In this paper, the comprehensive evaluation indexes suitable for the flavor of Nyingchi apple were selected by comparing the content of sugar and acid, the content of free amino acids and the taste intensity of seven kinds of apple fruits cultivated in Nyingchi, Tibet, so as to provide reference for the evaluation of the flavor quality of the main apple fruits produced in Nyingchi. The content of sugar and acid in apple fruit was determined according to the national standard. The content of free amino acid components was determined by high performance liquid chromatography and the TAV value was analyzed by combining the taste threshold. The total sugar content of the seven varieties ranged from 89.75 to 111.8 mg·g-1, and the average fructose content accounted for 49 % of the total sugar, followed by sucrose and glucose. The total acid content ranged from 2.81 mg·g^-1 to 5.99 mg·g^-1. Malic acid accounted for 91.1 % of the total acid content. The order of organic acid sugar content was malic acid > quinic acid > citric acid > oxalic acid. The order of fruit sweetness of seven main cultivated apples in Linzhi area of Tibet is Black Diamond > Asus > Red Fuji > Red General > Rust Red > Japanese Fuji > Yellow Banana.Fructose content is relatively high in 7 main cultivated apples in Linzhi area of Tibet, malic acid is the dominant organic acid, and total acid content is an important factor affecting fruit flavor. The sweetness value, sweet-acid strength ratio, sugar-acid ratio and sweet acidity are used to evaluate apple flavor. The 19 FAAs contribute the most to the aroma of apples in Linzhi area, and contribute less to umami, bitterness, sweetness and sourness. Through this study, the comprehensive evaluation index suitable for the flavor of Linzhi apple was determined.

Graphical abstract

关键词

林芝 / 苹果 / 糖酸组分 / 游离氨基酸 / 风味品质

Key words

Linzhi / Apple / Sugar acid components / Free amino acids / Flavor quality

苹果是全球第一大水果，我国则是全球第一大苹果生产国和消费国。国内栽培品种众多，各产区根据各自的地理气候特点均已培育并推广自己的特色品种。林芝地区尼洋河畔有大片的干热河谷型的气候地带，是西藏高原上难得的苹果种植地带，以嘎玛果园为主几十个规模不一的林芝苹果园是当前全西藏本土苹果主要供应基地，据西藏统计年鉴，2017年苹果栽培面积2 876 hm²，产量11 044 t。其中林芝地区苹果产量占全区总产量的58.1%，约6 400 t，随着品种与产量的增加，其中“黑钻”、“华硕”等作为优质商品畅销内地市场，售价高达每公斤40 ~ 80元。目前林芝苹果产业的工作重点为选育与增产，对苹果品质研究较少，尤其是对风味品质的研究更少。

食物风味是由滋味和气味综合决定的，二者可相互作用。氨基酸、蛋白质、核苷酸等含氮和糖、有机酸等非含氮物质决定滋味，醇、醛、酸、酯等挥发性组分决定气味^[1]。糖酸含量与组成是水果风味的重经指标，不少学者研究了苹果果实糖酸特性及其与风味关系^[2-4]。Danshi Zhu^[5]等采用电子鼻和电子舌结合气相色谱-质谱联用技术，对五种流行苹果品种，结果表明，苹果中含量最高的挥发性化合物是酯类，通过主成分分析（PCA），丁酸己酯，(E)-2-己烯醛和α-法呢烯是苹果中重要的挥发性化合物。Benjamin Orcheski^[6]研究发现不同品种的特定挥发物和相对丰度存在习显著差异，与苹果的风味特征有关。苹果倾向于产生乙酯或醋酸酯，这表明这两种酯类型存在不同的遗传控制。此外，酯类通常具有较大的广义遗传力，这表明它们可能是改变苹果风味的更容易的物质。苹果风味不是甜味和酸味的简单叠加，是糖和酸共同作用的结果，既取决于糖和酸的含量水平，苹果的风味除取决于糖、酸含量的绝对值外，还取决于糖、酸的比例，即糖酸比。糖酸比越大味感越甜，糖酸比越小则味感越酸。氨基酸组成对食物滋味的贡献在肉类、菌类等蛋白质含量高的食物中尤为重要，Lili Fan^[7] 评估了两种毛竹物种（即毛竹和紫竹）的两种成分（即芽肉 (BSF) 和隔膜 (BSD)）的营养和风味差异，并分析了任何位置变化，结果表明，竹笋品质受风味化合物差异的影响，并且种间成分和竹笋成分相互作用。近年来氨基酸组成对苹果、苹果汁、苹果酒的风味影响的研究也备受关注^[8-11]。孙燕霞^[12]等对3种中熟苹果的果实品质分析，检测出了3种氨基酸，对其苹果的风味有着一定的影响。

本研究以西藏林芝地区主要栽培7个苹果品种果实为对象，通过测定不同苹果果实糖酸及氨基酸的含量和组分差异，以总甜度值、甜酸强度比、糖酸比、甜酸度、TAV值指标从风味角度分析评价，选择适合林芝苹果风味的综合评价指标，为林芝主产苹果果实的风味品质评价提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

分别在西藏林芝市的林芝县、米林县、工布江达县的商业果园中于商业采收期采收‘黑钻石’、‘红富士’、‘日本富士、‘华硕’、‘锦绣红’、‘红将军’、‘黄香蕉’7种主栽苹果品种果实。所有果实采摘后立即送至实验室，选择大小均匀及无机械损伤的果实放置于0 ℃ ~ 2 ℃，相对湿度85% ～ 90%的冷库中贮藏。10 d 内将苹果样品利用四分法，取果皮和果肉的混合鲜样测定各指标。七种苹果品种样品信息见表1：

1.2 试剂与仪器

1.2.1 试剂

19种氨基酸标准品为色氨酸Trp、缬氨酸Val、蛋氨酸Met、亮氨酸Leu、异亮氨酸Ile、精氨酸Arg、苏氨酸Thr、组氨酸His、丝氨酸Ser、脯氨酸Pro、甘氨酸Gly、丙氨酸Ala、谷氨酸Glu、天冬氨酸Asp、赖氨酸Lys、半胱氨酸Cys、酪氨酸Tyr、苯丙氨酸Phe、天冬酰胺Asn（北京中科质检生物技术有限公司，纯度≥ 98.2%），三乙胺（国药集团化学试剂有限公司，优级纯，纯度≥ 99.0%），异硫氰酸苯酯（国药集团化学试剂有限公司，纯度≥ 98.0%），乙腈（色谱纯）

1.2.2 主要仪器设备

UV-6100紫外可见光分光光度仪：上海元析仪器有限公司；Vortex 2涡旋混合器：德国IKA公司；PURIST超纯水仪：上海乐枫生物科技有限公司；1260高效液相色谱仪，Agilent extend-C18色谱柱(250 ×4.6 mm，5 μm)：美国安捷伦；PAL-1数显折射计：日本ATAGO。台式冷冻离心机：湖南湘仪实验室仪器开发有限公司

1.3 方法

1.3.1 糖酸组分测定

可溶性糖测定参考李娅楠等^[4]的方法，样液制备取经组织捣碎后的样品5 g加水定容至50 mL，于80 ℃水浴锅中旋转30 min，超声清洗器上超声混合提取40 min，冷却后10 000 r·min^-1离心20 min，上清液通过0.45 μm滤膜，加入样品瓶备用。有机酸含量测定以流动相为甲醇-0.01 mol/LKH₂PO₄(3:97)溶液，用H₃PO₄调节pH值至2.5（过滤）。色谱柱：ZORBAX SB-C18柱(4.6×250 mm，5 μm)；柱温30 ℃；流速0.5 mL/min；进样量10 μL，检测波长210 nm，采用外标法定量。

1.3.2 可溶性总糖、总酸与可滴定酸含量测定

参照国家农业行业标准 NY/T 1278—2007《蔬菜及其制品中可溶性糖的测定铜还原碘量法》中可溶性总糖的测定方法进行测定；可滴定酸含量使用数字水果酸度计进行测定。总酸含量为各有机酸组分含量的总和。

1.3.3 游离氨基酸含量测定与味觉活度分析

（1） 样品溶液制备与衍生化

取样品约20.0 g于50 mL离心管中，加入0.1 mol/L的盐酸，定容至50 mL，涡旋混匀后超声30 min，离心机离心，取上层清液作为样品溶液。

衍生：取标准氨基酸混合工作液或样品溶液100 μL置4 mL离心管中,加入衍生试剂100 μL,涡旋20 s,放置60 min,加水800 uL、正己烷0.5 mL,涡旋1 min,静置10 min,移去上层,再次加正己烷0.5 mL,涡旋1 min,静置10 min,取下层溶液,用0.22 μm滤膜过滤后取20 μL进行色谱分析。

（2） 色谱条件

采用Agilent extend-C18色谱柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，流动相A相为0.1 mol/L乙酸钠水溶液（醋酸调pH至5.0），B相为乙腈-水（5：1）；梯度洗脱条件为0 min，5% B；10 min，9% B；20 min，11% B；21 min，21% B；34 min，23% B；35 min，25% B；43 min，32% B；44 min，80% B；49 min，90% B；50 min，5% B；53 min，5% B，流速1.0 mL/min，柱温30 ℃，检测波长254 nm，进样量20 μL。

（3） 味觉活度分析

味觉活度值（taste activity value，TAV）计算公式如下^[13]：

TAV=\frac{Ti}{C\mathrm{i}}（1）

式中：

Ti--某呈味物质的绝对浓度（%）

Ci--为该物质在水中的阈值（μg/kg）

1.3.4 数据分析

采用excel进行数据基础统计，IBM SPSS Statistics 22进行显著性检验，用origin 9.3作图。

2 结果与分析

2.1 果实的糖组分含量及差异分析

如表2所示，各品种蔗糖含量除‘黑钻’及‘锦绣红’外，其余5个品种间存在显著差异（P＜0.05 下同），其变幅为22.76 ~ 39.54 mg∙g^-1，占总糖比例30.3%，变异系数为22.95%；对应蔗糖含量最高的为‘锦绣红’和黑钻，分别为39.54 mg∙g^-1和37.48 mg∙g^-1，‘黄香蕉’为21.83 mg∙g^-1，含量最低。果糖变幅为38.64 ~ 58.83 mg∙g^-1，果糖含量较高，占总糖比例为49%，变异系数为15.29%；除‘黑钻’和‘红将军’外，其它品种间存在显著差异，果糖含量最高的是华硕，‘日本富士’、‘锦绣红’、‘黄香蕉’三者果糖含量较低，均低于平均值49.91 mg∙g^-1。葡萄糖变幅为11.79 ~ 29.28 mg∙g^-1，占总糖比例为20.6%，变异系数最高为28.25%；不同品种苹果果实葡萄糖含量较低，最低的是‘红富士’，含量最高的是为‘黄香蕉’，‘黄香蕉’果实中各类糖组分含量均低于其它品种，而葡萄糖含量不但高于其它品种，并与其它品种存在显著差异。本实验总糖以蔗糖、果糖、葡萄糖三者之和，总糖含量变化为89.75 ~ 111.8 mg∙g^-1，变异系数为8.90%，对应含量最高的是‘华硕’，与‘黑钻’、‘锦绣红’‘红将军’‘红富士’含量接近且差异不显著，但与其它品种间存在显著差异，总糖含量最低的是‘黄香蕉’与‘日本富士’，与含量最高相差22.05 mg∙g^-1；所有品种苹果间可溶性总糖以果糖为主，占比为49%，葡萄糖含量最低，占总糖含量的20.6%，可溶性糖含量最高的是‘黑钻’为16%，最低的是‘黄香蕉’为12.45%，与总糖的分析结果一致。

2.2 果实的酸组分含量及差异分析

如表3所示，不同品种苹果果实中苹果酸含量较高，占总酸含量的91.1%，变化范围在2.40~5.52 mg∙g^-1之间，变异系数为26.92%，其中苹果酸含量最高的是‘黄香蕉’，并显著高于其它品种，‘黑钻’的含量最低。柠檬酸在有机酸含量中占比较低，为1.1%，其变化范围在0.03 ~ 0.07 mg∙g^-1之间，变异系数为35.40%，‘黄香蕉’柠檬酸含量要显著高于其它品种，‘黑钻’、‘红富士’、‘红将军’三者柠檬酸含量一致且为最低。苹果果实中奎宁酸的比例仅次于苹果酸，占有机酸含量的7.6%，变化范围在0.21 ~ 0.42 mg∙g^-1之间，变异系数最低为25.77%，‘日本富士’的奎宁酸含量最高，‘红将军’奎宁酸含量最低。草酸占有机酸含量比例最低为0.3%，变化范围在0.01 ~ 0.02 mg∙g^-1之间，变异系数最高为78.73%，‘黄香蕉’及‘华硕’草酸含量最低显著区别于其它品种，在‘日本富士’及‘锦绣红’中未曾检出。可滴定酸含量变化范围在0.29 %~ 0.61%之间，变异系数为28.79%，‘黄香蕉’可滴定酸显著高于其它果种为0.61%，‘黑钻’含量最低为0.29%。通过分析不同品种苹果有机酸组分含量发现，各有机酸占总酸比例从高到低排列为：苹果酸＞奎宁酸＞柠檬酸＞草酸，品种‘黑钻’在苹果酸、柠檬酸、可滴定酸及总酸中含量均为最低，而‘黄香蕉’的在以上有机酸中含量为最高。

2.3 果实的糖酸组分含量及比例分析

水果甜酸风味主要由糖、酸含量及其比例决定。果糖、蔗糖和葡萄糖的甜度分别为1.75、1和0.75，不同糖组分对甜度的贡献不同，因而水果的甜度和口感与糖组分的种类和构成比例有很大关系。水果的酸味和口感与有机酸组分的种类和构成比例有关。不同的有机酸，其酸味强度有差异，以含一个结晶水的柠檬酸为基准（定为100），乳酸（50%）、无水柠檬酸、苹果酸、酒石酸和富马酸的酸味强度分别为60、110、125、130和165^[1,2]。因此，果实酸甜风味是各类糖酸的含量和比例差异的综合评价，以总糖与总酸的比例评价水果甜酸味感不够真实。综合比较考虑，本实验以甜度值、甜酸强度比、糖酸比、甜酸度比作为苹果风味评价指标。

从表4可知，7个品种苹果与各项风味指标间之间存在显著差异，而部分品种苹果和个别风味指标之间差异不显著。可溶性糖含量高低次序为‘华硕、黑钻、红将军、锦绣红、红富士、日本富士、黄香蕉’，根据三种单体糖计算出的甜度值，则‘锦绣红’高于‘红将军’。

可滴定酸含量高低次序为‘黄香蕉、日本富士、锦绣红、红将军、华硕、红富士、黑钻’，不同的有机酸，其酸味强度有差异，本研究以柠檬酸酸味强度为1，苹果酸为1.25^[8]，其它酸的强度未查到，因含量低，推测对整体酸强度影响小，将其酸味强度当作1。由此计算出酸味强度分别为：黄香蕉7.28±0.51、锦绣红6.49±0.37、日本富士5.93±0.31、红将军4.89±0.18、红富士4.58±0.26、华硕4.03±0.24、黑钻3.33±0.20，甜酸度比显示 ‘黑钻’>‘华硕’> ‘红富士’>‘红将军’>‘锦绣红’>‘日本富士’>‘黄香蕉’与糖酸比一致。

一般认为鲜食优质苹果，其果实的含酸量0.2% ～ 0.5%^[10]，贾定贤认为^[2]，优质苹果的风味以酸甜适度为主，含酸量中等、糖酸比大致在20 ~ 60，综上分析，除‘黄香蕉’外，其它品种均符合鲜食优质苹果，‘华硕’、‘黑钻’两个品种苹果风味较佳。

2.4 游离氨基酸对苹果风味品质的影响

各种游离氨基酸(FAA)可呈现出鲜、甜、酸、苦及涩等味感，从而形成食物的不同风味。游离氨基酸的含量和种类也常作为评价食品营养价值及口感风味的重要指标之一^[13,14]。按照呈味特点游离氨基酸分为4类，分别为苦味氨基酸，由Val、Met、Leu、Ile、Arg 组成；甜味氨基酸，包括Thr、His、Ser、Pro、Gly、Ala；鲜味氨基酸，包括Glu、Asp、Lys；芳香族氨基酸包括Cys、Tyr、Phe；Asn呈酸味^[15]。

用1.3.3方法测定林芝各种苹果的19种FAA含量，按文献方法^[15,19]将各种FAA归为苦味、甜味、鲜味、芳香味和酸味5类，见表5，根据各FAA含量的计算出TAV值，统计各类味觉的总TAV值作滋味雷达图1，由图1可知，19种FAA对林芝地区苹果的芳香味贡献最大，对鲜味、苦味、甜味和酸味的贡献较小；由FAA所形成的芳香味可以得出，华硕>黄香蕉>锦绣红>红将军>日本富士>黑钻>红富士，其中红富士的芳香味远小于其它品种。

3 讨论

水果的糖酸组分含量和比例不同，苹果主要为果糖积累型，果糖是苹果果实可溶性糖的主要组分，其次是葡萄糖、蔗糖^[19]。本实验研究的林芝7个品种中均以果糖含量占总糖比例为最高，均值占比为49%，除品种‘黄香蕉’和‘日本富士’葡萄糖含量高于蔗糖外，其它品种均是蔗糖高于葡萄糖；Ferit CELIK^[20]等研究中，四个苹果的糖以果糖为主，与本实验结果类似；水果根据可溶性糖成分可划分为单糖积累型与蔗糖积累型，苹果、梨、草莓等属于单糖积累型^[3]，由实验可知苹果可溶性糖中占比较高的单糖为果糖。

不同有机酸的组成和含量差异使各类水果口感各具风味，苹果是苹果酸积累性果实，苹果酸为主要有机酸，其次是奎宁酸、柠檬酸、草酸、莽草酸、酒石酸等^[21]；苹果酸酸味爽口，微有涩苦，呈味速度较缓慢，酸感维持时间长于柠檬酸，而柠檬酸产生酸感快、持续时间短^[22]；本研究中通过测量7个品种苹果有机酸含量和比例发现，苹果酸为主要有机酸，均值占总酸比值为91.1%，其次是奎宁酸和柠檬酸，草酸在‘日本富士’与‘锦绣红’中未检出，这可能因测量时间、方法和西藏海拔的差异而会引起环境气候的多项组分变化，如温度、光照、湿度等生态因子的改变造成^[23,24]。

果实的酸甜风味主要由糖酸组分的含量和比例构成^[3]，梁俊^[25]等研究认为风味较甜的苹果含糖量不一定很高，但有机酸含量一定很低，总酸含量在苹果风味评价方面起重要作用。而各有机酸的酸味强度不一致，可将酸味强度设置为1进行计算评价，本试验中，‘锦绣红’、‘日本富士’、‘黄香蕉’三个品种因总酸含量较高而酸味强度值较高，故甜酸度比与糖酸比较低，果实风味不佳；‘红将军’与‘锦绣红’两者甜度值无显著差异，但‘锦绣红’酸味强度值稍高，以至于果实风味评价不如‘红将军’，本试验中甜酸度比（可溶性糖与可滴定酸比）与糖酸比评价结果一致；李娅楠^[4]等通过分析甜酸比与总酸含量相关性分析结果呈极显著负相关，相关性高于甜度值相关性，同样说明酸组分对风味评价的重要影响，对苹果品种进行动态聚类分析认为低糖高酸的苹果不宜鲜食，这与本试验对‘黄香蕉’的评价结果一致；结合综上所述认为，果实中有机酸含量高低直接影响果实风味的评价，而根据各组分糖酸含量、比例、酸味强度值计算出甜度值、甜酸强度比、糖酸比、甜酸度指标评价苹果风味较为真实。

4 结论

苹果果实中的可溶性糖主要为果糖，其次是蔗糖与葡萄糖，部分品种葡萄糖含量与蔗糖含量相等或高于蔗糖。苹果酸占苹果有机酸含量的主导地位，其次是奎宁酸、柠檬酸、草酸。有机酸含量高低对果实风味的影响较为重要，以甜度值、甜酸强度比、糖酸比、甜酸度指标评价苹果风味较为真实，低糖高酸的苹果鲜食风味不佳。19种FAA对林芝地区苹果的芳香味贡献最大，对鲜味、苦味、甜味和酸味的贡献较小；由FAA所形成的芳香味可以得出，华硕>黄香蕉>锦绣红>红将军>日本富士>黑钻>红富士。

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基金资助

高原特色资源创新利用与发展研究(2023-XYQ-006)

西北农林科技大学西藏农牧学院联合基金项目(2452020045)