E.Coli O78 和 LAB 对牦牛肠道上皮细胞MAPK/Zonulin通路的影响

Effects of Ecoli O78 and LAB on MAPK/Zonulin pathway of intestinal epithelial cells in yaks

摘要

为探究牦牛 致病性大肠杆菌（E.coli O78）和乳酸杆菌（LAB）对牦牛肠道上皮屏障MAPK/Zonulin通路的影响作用，采用牦牛上皮细胞作为实验模型，Transwell构建单层上皮细胞屏障，设立阴性对照组（Control组）、阳性对照组（Model组，加入1x10⁵ CFU E.coli O78）、低剂量组乳酸杆菌组（LLAB组，加入1x10⁵ CFU E.coli O78和1x10⁵ CFU LAB）、高剂量乳酸杆菌组（HLAB组，加入加入1x10⁵ CFU E.coli O78和 1x10⁷ CFU LAB），采用RT-qPCR和Western-blot 技术测定各组P38、ERK、JNK、Zonulin的基因和蛋白表达水平。 结果 与Control组相比，Model组的P38、ERK、JNK、Zonulin的基因表达水平极显著上升（P＜0.01），而其蛋白表达水平呈现显著上升的趋势（P＜0.05）；与Model组相比，LLAB组 P38的基因表达水平极显著下降（P＜0.01），ERK、 JNK、 Zonulin的基因表达水平表现显著下降的趋势（P＜0.05）， P38、 ERK、 Zonulin的蛋白表达水平则呈现极显著下降的趋势（P＜0.01）， JNK的蛋白表达水平表现为显著下降（P＜0.05）；与Model组相比，HALB组P38、ERK、JNK的基因的表达水平表现为显著下降（P＜0.05），Zonulin的基因表达水平表现为极显著下降（P＜0.01），P38、ERK、JNK、Zonulin的蛋白表达水平呈现极显著下降的趋势（P＜0.01）。 结论 E.coli O78可通过上调MAPK通路关键基因P38、ERK、JNK的基因表达水平，同时上调zonulin蛋白使肠道屏障受损；LAB可以减轻E.coli O78引起的肠道屏障受损，这一作用是通过下调MAPK通路关键基因P38、ERK、JNK的基因表达水平，同时下调zonulin蛋白表达水平来实现的。

Abstract

To investigate the effects of E.coli O78 and LAB on the MAPK/Zonulin pathway of the intestinal epithelial barrier in yak, an experimental model using yak epithelial cells was established, and the single-layer epithelial cell barrier was constructed using a Transwell. A control group (Control group), a model group (Model group, with 1x10⁵ CFU E.coli O78 added), a low-dose group (LLAB group, with 1x10⁵ CFU E.coli O78 and 1x10⁵ CFU LAB added), and a high-dose group (HLAB group, with 1x10⁵ CFU E.coli O78 and 1x10⁷ CFU LAB added) were set up. The gene and protein expression levels of P38, ERK, JNK, and Zonulin in each group were measured using RT-qPCR and Western-blot techniques. The results showed that compared with the Control group, the gene expression levels of P38, ERK, JNK, and Zonulin in the Model group were significantly increased (P<0.01), while their protein expression levels showed a significant upward trend (P<0.05); compared with the Model group, the gene expression levels of P38 in the LLAB group were significantly decreased (P<0.01), while the gene expression levels of ERK, JNK, and Zonulin showed a significant downward trend (P<0.05), and the protein expression levels of P38, ERK, and Zonulin showed an extremely significant downward trend (P<0.01), while the protein expression level of JNK showed a significant downward trend (P<0.05); compared with the Model group, the gene expression levels of P38, ERK, and JNK in the HLAB group were significantly decreased (P<0.05), while the gene expression level of Zonulin was significantly decreased (P<0.01), and the protein expression levels of P38, ERK, JNK, and Zonulin showed an extremely significant downward trend (P<0.01). Conclusion E.coli O78 can damage the intestinal barrier by upregulate the key gene P38, ERKand JNK in the MAPK pathway, as well as the upregulation of zonulin protein; LAB can alleviate intestinal barrier damage caused by E.coli O78 by downregulating the key gene P38, ERK and JNK in the MAPK pathway, while downregulating the expression level of zonulin protein.

Graphical abstract

关键词

致病性大肠杆菌O78 / 乳酸杆菌 / MAPK通路 / Zonulin

Key words

Pathogenic Escherichia coli O78 / Lactobacillus / MAPK pathway / Zonulin

1 引言

牦牛在青藏高原上被认为是主要牲畜物种和宝贵资源。牦牛为当地牧民提供奶、肉、羊毛、动力、燃料和其他日常必需品，是高原地区不可或缺的物种^[1-2]。大肠杆菌是导致犊牛腹泻和败血症的最常见原因之一，影响奶牛和牛肉的生产^[3]。由大肠埃希氏菌引起的犊牦牛大肠埃希氏菌病（俗称“牦牛瘦死病”），主要表现为高热、食欲废绝、呼吸困难、下痢等^[4]，对牦牛养殖业的养殖与发展产生了不可忽视的影响作用。菌株血清型以O78、O26、O158、O142、O117和O8为主，其中检出率最高的是O78，占68.75%，发病率及死亡率均较高^[5]。目前治疗该疾病的主要是利用抗生素进行治疗，但由于对抗生素的过度依赖和滥用，导致西藏地区牦牛大肠埃希氏菌耐药性高，多重耐药现象十分严重^[4]。因此，需要寻找其他有效且风险较低的治疗药物用以替代抗生素治疗。乳酸菌是革兰氏阳性菌，是正常微生物群的一个重要组成部分，主要以分泌乳酸为最终产物，能够促进健康，预防肠道致病菌感染、参与免疫调节、稳定微生物群落^[6]。研究发现，乳酸杆菌可以调节牛瘤胃内的微生物，改善瘤胃环境和动物生产性能^[7]。由于现阶段开发的乳酸杆菌制品并不能很好的适应西藏地区畜牧业的需求，为此我们筛选出了适宜高原使用的牦牛源乳酸杆菌菌种^[8]。

MAPK（mitogen-activated protein kinases）是一组进化保守的丝/苏氨酸蛋白激酶，它们会被一系列细胞外的刺激信号激活并介导信号从细胞膜向细胞核传导；包括MAPK激酶激酶（MAP kinasekinase kinase，MKKK）、MAPK激酶（MAPkinase kinase，MKK）和MAPK，这三种激酶能依次激活，它们调控着许多生理活动，如细胞增殖、分化、凋亡、转化、癌化、应激、炎症、功能同步化等信号转导^[9]。炎症通路MAPK家族的信号通路主要包括P38信号通路、ERK信号通路以及JNK信号通路。ERK信号转导通路是由蛋白激酶C（PKC）或Ras传递的信号触发，激活 Raf 进而启动包括丝裂原活化蛋白激酶激酶（MAPK kinase,MEK）及ERK活化的级联反应^[10]。蛋白激酶C（Protein kinase C,PKC）是一类由多种同工酶组成的钙磷依赖性的苏氨酸/丝氨酸蛋白激酶，受到外界刺激后PKC向细胞膜移动，并由于多种膜蛋白的磷酸化改变构象，可以识别和激活MAPK通路，参与细胞增殖、分化、凋亡等多种信号传导过程^[11]。有报道显示，MAPK信号通路在调控Occludin等TJ蛋白和Zonulin表达及其磷酸化过程中发挥着重要作用^[12]。

近年来，肠道屏障在维持整体健康方面的关键作用在科学界得到了越来越多的关注^[13,14]。研究发现，在肠道内存在一种调节紧密连接的结构和功能的蛋白质，即Zonulin，其也是目前所知唯一的调节紧密连接的因子，通过增加 Zonulin 表达，使得肠道屏障功能的丧失是启动炎症过程的一个必要步骤^[15]。研究发现，肠道菌群的失衡也可导致肠上皮细胞对Zonulin的释放，引起肠道内容物通过上皮屏障，促进炎性细胞因子的释放，引起肠道的慢性炎症疾病，甚至引起全身慢性炎症疾病^[16]。同时，消化系统疾病患者肠道完整性的改变可导致菌群变化，而菌群的改变反过来也会通过增加Zonulin的释放引起紧密连接的改变，可进一步加剧黏膜的破坏，影响疾病的发展进程^[17]。因此，Zonulin被认为是肠道细胞间紧密连接的调节因子，且Zonulin变化与肠道病原微生物有着密不可分的关系。有研究表明，益生菌可降低坏死性小肠结肠炎（NEC）肠道炎症损伤，维持肠道紧密蛋白完整性，降低肠道通透性^[17]。Liu等研究证实对结直肠手术术后的患者给予益生菌治疗可降低其肠道通透性，增强肠道屏障功能，且血清Zonulin水平与肠道通透性呈正相关，提示益生菌可能是通过抑制P38 MAPK的表达来调控 Zonulin 的表达^[18]。肠道通透性增加是腹泻发病机制中的一个重要组成部分，Zonulin是肠道通透性的生理性调节蛋白，参与上皮和内皮屏障功能调节^[19]。病原菌可引起肠黏膜Zonulin的生成增多，通过自分泌或旁分泌方式与肠黏膜上受体结合，从而提高肠道通透性，促进肠道炎症反应，进而增加病原菌易位能力^[20]。我们前期的研究表明，利用Transwell小室体外构建肠上皮，加入E.coli O78可以降低肠上皮的跨膜电阻，加入E.coli O78 2h后再加入LAB可提高肠上皮的跨膜电阻^[21]。该作用是通过哪种机制实现的？尚待进一步研究。

本研究拟通过 RT-qPCR和 Western-blot技术检测牦牛肠道上皮细胞MAPK通路关键基因P38、ERK、JNK以及牦牛肠道上皮细胞屏障调节因子Zonulin的基因和蛋白表达水平，揭示致病性E.coli O78和LAB对牦牛肠道上皮细胞MAPK通路的作用，以及它们与 Zonulin的相关性。

2 材料与方法

2.1 材料

2.1.1 菌种来源

牦牛源致病性大肠杆菌O78由索朗斯珠教授惠赠。

牦牛源约氏乳杆菌 Lac-2由西藏农牧学院动物科学学院临床重点实验室分离和保存。

2.1.2 主要仪器

超净工作台（CJ-DRGZT，苏州清源）、CO2恒温细胞培养箱（4110，美国Thermo Fisher Scientific®）、倒置显微镜（Ti-U，日本Nikon®）、-85 ℃超低温冷冻存储箱（BIO-MEDICAL，中国Haier®）、聚丙烯酰胺凝胶电泳仪（Bio-Rad）（PowerPac Universal，美国Bio-Rad®）、微量分光光度计（NANO DROP ONE，美国Thermo Fisher Scientific®）、ChemiDoc MP成像系统（(cDNA library) S.pombe; After+HUγMMS h-L972，美国Bio-Rad®）、实时荧光定量 PCR 系统（4351107，美国Thermo Fisher Scientific®）、恒温恒湿培养箱（HWHS-150，江苏jintan ShengWei）、96孔荧光定量pcr板（MQ50801S，苏州Monad®）、小型蛋白垂直电泳转印系统（Mini-PROTEAN，美国Bio-Rad®）、恒温生化培养箱（LRH-150，金坛市盛蓝仪器制造公司）、台式智能精密摇床（BSD-TF370，上海博讯医疗生物仪器股份有限公司）。

2.1.3 主要试剂

P38兔多克隆抗体（A0027）、ERK兔多克隆抗体（AP1120）、JNK兔多克隆抗体（A18678）、Zonulin兔多克隆抗体（A1571）、β-Actin兔单克隆抗体（高敏感）（AC026）、0.2 um NC膜（RM02801）均购自爱博泰克生物科技（中国）有限公司；HRP标记羊抗兔IgG（H+L）（A0208）购自碧云天生物技术（上海）有限公司；胰酶（添加EDTA，酚红）（25200056）、DMEM/F12培养基（11330032）、Maxima H Minus第一链 cDNA 合成试剂盒（K1652）、PowerUp SYBR Green 预混液（A25741）、0.45 um PVDF膜（E-BC-R266）均购自赛默飞世尔科技（中国）有限公司；特级胎牛血清（四季青®13011-8611）购自浙江天杭生物科技股份有限公司；PBS缓冲液（BL601A）、SDS-PAGE蛋白上样缓冲液（5×）（BL502B）、RIPA裂解液（BL504A）均购自兰杰柯科技有限公司；青链霉素混合液细胞培养专用（P1400）购自北京索莱宝科技有限公司；动物组织总RNA抽提纯化试剂盒（DP431）购自天根生化科技（北京）有限公司；无水乙醇（AR）（64-17-5）购自成都科龙化学试剂公司；异丙醇（AR）购自四川西陇科学有限公司；氯化钠（10019318）购自国药集团化学试剂有限公司；SDS（EZ6470EE3A）、甘氨酸（EZ65A7898）、Skim milk powder（EZ63FCCF1C）、Tris（EA63B43DD9）均购自上海金畔生物科技有限公司；伊红美蓝琼脂（EMB）（HB0107）、营养肉汤（NB）（HB0108）、MRS培养基（HB0384-5）均购自青岛高科技工业园海博生物技术有限公司。

2.2 方法

2.2.1 致病性大肠杆菌O78和乳酸杆菌的制备

致病性大肠杆菌O78来源于西藏自治区林芝市腹泻病牦牛，由西藏农牧大学畜牧学院临床重点实验室保存。复活所提取的致病性大肠杆菌O78菌株，接种在营养琼脂培养基上，置于37 ℃恒温培养箱中培养24 h。然后在超净台中挑取单个菌落转移到营养肉汤培养基中，在37 ℃恒温的摇床培养箱中过夜培养。采用伊红-亚甲基蓝琼脂进行菌种检测，菌落形成单位(CFU)计数法确定所需的菌种浓度。

从牦牛中分离到的约氏乳杆菌Lac-2也由西藏农牧学院动物科学学院临床重点实验室保存。前期体外抑菌试验证明了该菌株对大肠杆菌、沙门氏菌和葡萄球菌的有效性^[6]。复苏所保存的乳酸菌菌株接种于 MRS琼脂培养基上，取单个菌落接种于MRS液体培养基中，37 ℃恒温培养箱培养24 h。用CFU计数法测定菌株浓度。

2.2.2 细胞培养与分组

从林芝市屠宰场获取 30 ~ 60 日龄牦牛胚胎中分离出牦牛肠上皮细胞。取肠道组织1 mm³，用无菌PBS冲洗。牦牛肠上皮细胞用 DMEM-F12(Invitgen，CA，USA)+ 10%胎牛血清(PAN，Adenbach，德国)在5% CO₂和37 ℃培养箱中培养。待细胞长满培养瓶的 80%后，使用胰酶消化将细胞转移到孔径为0.4 mm的PC膜Transwell小室中培养，细胞数为1×10⁵ 个/孔。2 d后更换培养液，继续培养12 h。实验分组如下：正常组(Control组，正常培养)，模型组(Model组，1×10⁵ CFU E.coli O78 培养4 h)，低剂量组(LLAB组，1×10⁵ CFU E.coli O78，1×10⁵ CFU LAB培养4 h)，高剂量组(HLAB组，1×10⁵ CFU E.coli O78，1×10⁷ CFU LAB培养4 h)。每组5个重复。

2.3 肠上皮细胞 MAPK通路关键基因P38、ERK、JNK的基因表达水平测定

采用实时荧光定量逆转录聚合酶链式反应(RT-qPCR)检测P38、ERK、JNK的mRNA表达水平。用R701，Vazyme，南京，中国试剂盒提取总RNA，用紫外分光光度计Nano Drop One (Thermo Fisher Science，美国，北卡罗来纳州威尔明顿)测定其纯度、完整性和浓度。使用第一链cDNA合成试剂盒(K1622，Thermo Fisher Science，威尔明顿，北卡罗来纳州，美国)按照试剂盒方案从1 mg总RNA中进行互补cDNA合成。由擎科生物科技公司(擎科，北京，中国)合成引物，引物序列如表1所示。荧光测定(SYBR Green Master Mix，A25742，Thermo Fisher Science，Wilmington，NC，USA)使用ABI Prism 7500实时荧光聚合酶链式反应系统(应用生物系统，CA，美国)。以GAPDH为内参，用2^-△△CT法计算基因的相对表达量。

2.4 肠上皮细胞 MAPK通路关键基因P38、ERK、JNK的蛋白表达水平测定

采用Western-blot技术检测P38、ERK、JNK的蛋白表达水平。弃去细胞培养基，每组细胞使预冷的PBS洗涤，用RIPA裂解缓冲液(BL504A型，北京拉贝吉，中国)于冰上裂解30 min，4 ℃ 12 000 rpm离心10 min收集上清液，使用紫外分光光度计Nano Drop One测定蛋白质的浓度和质量，添加5 × Loading Buffer制备好蛋白上样缓冲液。用10% SDS-PAGE分离各组总蛋白，采用湿转移法将蛋白转移到NC膜上，并用5%脱脂奶在振荡器上密封1 h。使用5%的脱脂牛奶配制一抗(Zonulin，A1571，Abclon，中国；P38，A0 027，Abclon，中国；ERK，AP1 120，Abclon，中国；JNK，A18 678，Abclon，中国；β-肌动蛋白（β-actin），AC026，抗体，中国)孵育2 h，用1X TBST洗膜5次，二抗(HRP山羊抗兔 IgG H+L，AS014，Abclonal，中国)孵育1 h后，再次使用1X TBST洗膜5次，采用化学发光法测定各条带的灰度值，以β-肌动蛋白（β-actin）为内参照。用ImageJ软件对条带进行灰度值分析，进行标准化处理。

2.5 肠上皮屏障调节蛋白Zonulin的基因表达水平测定

采用实时荧光定量逆转录聚合酶链式反应(RT-qPCR)检测Zonulin的mRNA表达水平。方法如2.3，由擎科生物科技公司(擎科，北京，中国)合成引物，引物序列如表2所示。以GAPDH为内参，用2^-△△CT法计算基因的相对表达量。

2.6 肠上皮屏障调节蛋白Zonulin的蛋白表达水平测定

采用Western-blot技术检测Zonulin的蛋白表达水平。方法如2.2.4。用ImageJ软件对条带进行灰度值分析，进行标准化处理。

2.7 数据统计分析

所有试验重复3次，数据以均数±标准差表示。对所有数据使用GraphPadPrism 9.0进行单因素方差分析，然后用Bonferroni检验并比较各组均值。若P<0.05，认为差异具有统计学意义。

3 结果

3.1 肠上皮细胞MAPK通路关键基因P38、ERK、JNK的基因表达水平测定结果

对正常组、模型组、低剂量组和高剂量组进行RT-qPCR检测后，与Control组进行比较，Model组的P38、ERK、JNK的mRNA表达水平表现为极显著上升（P<0.01）；与Model组相比，LLAB组中的P38的mRNA表达水平极显著下降（P<0.01），LLAB组中的ERK、JNK的mRNA表达水平显著下降（P<0.05）；与Model组相比，HLAB组中的P38、ERK、JNK的mRNA表达水平显著下降（P<0.05）。如图1-A、1-B、1-C所示。

3.2 肠上皮细胞MAPK通路关键基因P38、ERK、JNK的蛋白表达水平测定结果

对正常组、模型组、低剂量组和高剂量组进行Western-blot检测后，与Control组进行比较，Model组的P38、ERK、JNK的蛋白表达水平表现为显著上升（P<0.05）；与Model组相比，LLAB组的P38、ERK的蛋白表达水平呈现极显著下降（P<0.01）的趋势，JNK的蛋白表达水平呈现显著下降的趋势（P<0.05）；与Model组相比，HLAB组的P38、ERK、JNK的蛋白表达水平极显著下降（P<0.01）。如图2-A、2-B、2-C、2-D所示。

3.3 上皮屏障调节蛋白Zonulin的基因表达水平测定结果

对正常组、模型组、低剂量组和高剂量组进行RT-qPCR检测后，与Control组相比，Model组的Zonulin的mRNA表达水平表现为极显著上升（P<0.01）；与Model组相比，LLAB组的mRNA表达水平显著下降（P<0.05），HLAB组的Zonulin的mRNA表达水平呈现极显著下降的趋势（P<0.01）。如图1-D所示。

3.4 肠上皮屏障调节蛋白Zonulin的蛋白表达水平测定结果

对正常组、模型组、低剂量组和高剂量组进行Western-blot检测后，与Contro l组进行比较，Model组的Zonulin的蛋白表达水平表现为显著上升（P<0.05）；与Model l组相比，LLAB组和HALB组的Zonulin的蛋白表达水平表现为极显著下降（P<0.01）的趋势。如图3-A、3-B所示。

4 讨论

牦牛肠道上皮屏障是由完整的上皮细胞、细胞间封闭的紧密连接和粘附连接组成，是肠粘膜主要的机械屏障^[22]。肠上皮细胞之间的主要连接方式是紧密连接，紧密连接也被认为是上皮屏障的结构基础，是维持肠粘膜屏障通透性的决定因素，一旦肠粘膜屏障受到破坏，可导致肠道通透性增加，进而导致“肠道渗漏”现象的发生^[23]。小肠内壁受损，导致未消化的食物颗粒、有毒废物和细菌通过肠道渗漏，使血管充血的现象被称为肠道渗漏^[24]。外来的物质进入血液会在机体内引起自身的免疫反应，如炎症和过敏反应等，而炎症和过敏反应则又包括肠易激、腹泻、脱水、食物过敏等。紧密连接封闭细胞缝隙，使相邻的细胞紧密贴合在一起，形成细胞间天然的物理屏障，起着选择性通透和维持细胞极性、维持细胞内环境稳态、参与细胞增殖的作用^[24]。在正常的情况下，肠道相邻上皮细胞间的紧密连接蛋白维持着正常的功能，只有离子在内的生物小分子可溶性物质等可以被允许通过，而病原微生物包括其产生的代谢毒素是不能够被允许通过的，从而使肠上皮屏障保持正常的功能。研究发现，大量的病原菌及其毒素对肠上皮进行攻击后，伴随机体修复功能发生异常的情况下，肠道的紧密连接结构的完整性和通透性将受到攻击，进而破坏肠粘膜屏障结构的功能^[25]。进一步研究发现，在肠道内存在一种调节紧密连接的结构和功能的蛋白质，即Zonulin，其也是目前所知唯一的调节紧密连接的因子，通过增加Zonulin表达，使得肠道屏障功能的丧失是启动炎症过程的一个必要步骤^[26]。因此Zonulin的表达呈现上升趋势表明肠道屏障受到破坏，同时也表明了有炎症的发生。炎症通路包括核因子κB（NF-κB）通路、Janus激酶/信号转导和转录激活因子（JAK-STAT）通路、toll样受体（TLR）通路、cGAS/STING和丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）通路等^[27]。而其中的丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）家族包括细胞外信号调节激酶 （ERK）、P38和c-Jun NH（2）-末端激酶（JNK）等，它们的关键基因分别为ERK、P38、JNK^[28]。通过测定P38、ERK、JNK这三种MAPK通路的关键基因的表达量可以得出其是否有产生炎症。

本次试验采用的实验样本为体外培养的犊牦牛肠上皮细胞，再通过TransWell构建单层牦牛肠道上皮细胞屏障模型，向构建的细胞屏障模型中添加E.coli O78来模拟肠道屏障功能受到破坏，并通过添加LAB来研究两者对于肠道屏障MAPK/Zonulin通路的影响。E.coli O78引起的牦牛肠道上皮屏障受损，导致其MAPK通路关键基因P38、ERK、JNK的基因和蛋白水平均呈现上升的趋势，进一步证实了E.coli O78对牦牛肠道上皮屏障是具有破坏作用的，随后测定的调节紧密连接的结构和功能的蛋白质——Zonulin也呈现上升的趋势，进一步证实了E.coli O78可上调MAPK通路，上调Zonulin使牦牛肠道上皮细胞受损，进而通透性增大，引起腹泻。而添加了LAB组别的MAPK通路的关键基因P38、ERK、JNK和Zonulin都呈现下降的趋势，表明LAB通过阻断MAPK通路，下调Zonulin，进而对于E.coli O78破坏的肠道上皮细胞屏障具有一定的保护作用。总的来说，E.coli O78对于牦牛肠道上皮细胞屏障具有破坏作用，然而LAB对于被E.coli O78破坏的牦牛肠道上皮细胞屏障具有一定的保护效果，这一研究结果为后续我们探究LAB对牦牛肠道上皮细胞MAPK/Zonulin信号轴的调控作用提供一定的实验依据。

5 结论

E.coli O78可通过上调MAPK通路关键基因P38、ERK、JNK的基因表达水平，同时上调zonulin蛋白使肠道屏障受损；LAB可以减轻E.coli O78引起的肠道屏障受损，这一作用是通过下调MAPK通路关键基因P38、ERK、JNK的基因表达水平，同时下调zonulin蛋白表达水平来实现的。

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基金资助

国家自然科学基金(32160857)

“十四五”重大科技专项(XZ202101ZD0002N-05)