印度梨形孢培养基的优化

Optimization for Culture Medium of Piriformospora indica

摘要

目前培养印度梨形孢多采用马铃薯葡萄糖琼脂（PDA）培养基。为获得更适合印度梨形孢生长的培养基，研究固、液两种培养方式下，马铃薯、桃子、西瓜、草莓、苹果、玉米、红色圣女果和黄色圣女果8种天然有机添加物对印度梨形孢形态和生长速度的影响。结果表明，在添加200 g/L玉米的固体培养基中，印度梨形孢菌丝体生长最快；在玉米液体培养基中，菌丝体多呈大小比较一致、圆而紧密的菌丝球，培养至5 d，菌丝体鲜重、干重最高，分别为24.09 g、1.98 g；玉米是促进印度梨形孢生长的最佳天然有机添加物，马铃薯其次，PDA中培养至第5 d，菌丝体生物量达到最大，鲜重、干重分别为16.37 g、1.24 g。研究结果旨在为高效培养生产印度梨形孢提供重要理论依据。

Abstract

At present, potato glucose agar medium is commonly used to culture Piriformospora indica. In order to explore a more suitable medium for the growth of P. indica, the effects of eight natural organic additives, including potato, peach, watermelon, strawberry, apple, corn, red cherry tomato, and yellow cherry tomato, on the morphology and growth rate of P. indica under two culture methods, solid and liquid, were studied respectively. The results were as follows: In the solid culture medium supplemented with 200 g/L corn, the mycelium of P. indica grew fastest. In corn liquid culture medium, the mycelium mostly appeared as relatively uniform, round and compact mycelium pellets. After cultured for 5 d, the fresh and dry weight of the mycelium were the highest, with 24.09 g and 1.98 g, respectively. Corn was the best natural organic additive to promote the growth of P. indica, followed by the potato, and after cultured for 5 d in PDA culture medium, the mycelium biomass reached its maximum, with the fresh and dry weight of 16.37 g and 1.24 g, respectively. The research results aim to provide an important theoretical basis for efficient culture and production of P. indica.

Graphical abstract

关键词

印度梨形孢 / 天然有机添加物 / 培养基优化

Key words

Piriformospora indica / natural organic additive / culture medium optimization

印度梨形孢（Piriformospora indica）是Verma等人在印度西北塔尔荒漠探索时，从灌木根部提取孢子而分离得到的一种真菌^[1]，属担子菌门（Basidiomycota）层菌纲（Hymenomycetes）蜡壳耳目（Sebacinales）梨形孢属（Piriformospora）^[2]。因其厚垣孢子是梨形，故被称为梨形孢^[3]。

前人研究表明，印度梨形孢是一类能够侵染多种植物根系的内生真菌并与植物形成共生关系，可以提升植物对外界养分的吸收摄取能力，增加对次生代谢产物的积累，增强植物抗胁迫能力，同时提高植物的生物量，对宿主植物有益^[2-7]。印度梨形孢作为生物肥料和生物防治剂在农业、园林等领域具有广阔的应用前景和发展潜力。印度梨形孢从功能和形态上，与丛枝菌根真菌（Arbuscular mycorrhizal fungi，AMF）十分类似，但是P. indica可以在植物根部建立共生关系，还可以在许多人工合成的培养基中培养，获得纯的培养物，而AMF仅能在活植物的根部共生^[5]。培养印度梨形孢多采用马铃薯葡萄糖琼脂（PDA）培养基，但印度梨形孢在马铃薯基质中生长速度较慢、产孢数量较少、所需的基质多、培养的时间较长，不能满足大规模生产的要求^[8]。筛选出更适合印度梨形孢生长的培养基，可以更好、更快地获取印度梨形孢，加快其科研和工业化生产^[9-11]。本研究采用固、液两种培养方式，通过观察8种加入了不同天然有机添加物的培养基中印度梨形孢的形态和生长速度，从而筛选出适合印度梨形孢生长的培养基。

1 材料与方法

1.1 供试材料

印度梨形孢菌株为本实验室保存。马铃薯、桃子、西瓜、草莓、苹果、玉米、红色圣女果、黄色圣女果等天然有机添加物均购自西藏林芝市菜市场。

1.2 方法

1.2.1 培养基制备

固体培养基配方为天然有机添加物200 g/L+葡萄糖20 g/L+琼脂18 g/L。马铃薯、桃子、苹果和两种圣女果去皮，西瓜、草莓取果肉，玉米掰粒。将8种材料分别用搅拌机破碎成均匀的浆液，根据配方加入葡萄糖和琼脂，制成8种不同的培养基，调节pH至5.8。于121 ℃高压灭菌20 min。

液体培养基不加琼脂，其他方法同固体培养基。

1.2.2 固体培养基上印度梨形孢生长速率的测定

取-80 ℃冰箱中保存的印度梨形孢菌种，接种于PDA培养基上，28 ℃避光培养1周后，再转接至新的PDA培养基上培养1周。在活化培养后的印度梨形孢菌落边缘，用打孔器取直径为1 cm的菌饼，将其接种在不同固体培养基的中央位置，每一个平板接种1个菌饼，28 ℃避光培养。分别于培养的第3、5、7、10、15 d时测量并记录菌斑直径。每个处理设3次重复，每个重复1个培养皿。

1.2.3 液体培养基中印度梨形孢生长速率的测定

将直径为1 cm的印度梨形孢菌饼，接种在装有50 mL液体培养基的150 mL三角瓶中，每瓶放入1个菌饼。28 ℃、180 r/min避光培养。分别于培养的第3、5、7、10 d时，将50 mL培养液经两层纱布过滤得菌丝体，再用ddH₂O冲洗3次后，5 000 r/min离心5 min去上清液，留沉淀物（菌丝体）称量鲜重后，置于40 ℃烘箱内烘干至恒重，称量其干重。每个处理设3次重复，每个重复1个三角瓶。

1.3 数据分析

采用Excel 2021记录并处理数据，用SPSS 26.0进行方差分析，用Duncan新复极差法分析不同组之间的差异显著性（P＜0.05）。

2 结果与分析

2.1 不同固体培养基对印度梨形孢生长速度的影响

通过对比不同固体培养基中印度梨形孢的菌斑形态和生长速度，发现印度梨形孢在不同培养基上均能生长，但菌斑形态和生长速度有明显差异。由图1和表1可知，培养至3、5 d时，玉米培养基上印度梨形孢的生长有显著优势。培养至10 d时，8种培养基上的菌斑大小差距最大，其中玉米培养基上的菌斑直径最大，草莓培养基上的最小；苹果培养基上菌斑稀疏透明，其他培养基上菌斑较厚且粘附性较强；桃子、西瓜、玉米培养基均比PDA培养基的培养效果好。在15 d时，桃子、西瓜、苹果和玉米培养基上菌丝体长满整个平板，其中玉米培养基上菌斑最明显；草莓培养基上菌丝体生长最慢，菌斑直径为7.63 cm。综上可知，在试验设定的8种固体培养基中，印度梨形孢在玉米培养基上生长的最好。

2.2 不同液体培养基对印度梨形孢生长的影响

印度梨形孢在不同液体培养基中的形态和生长量各不相同。由图2可知，在桃子和黄圣女果培养基中，菌丝体多呈条状；在其他培养基中菌丝体多呈圆而紧密的菌丝球，菌丝球的大小不一，其中，玉米培养基中菌丝球的大小相对均一且数量最多。

由图3可知，8种不同的培养基中其菌丝体生物量鲜重与干重的变化趋势基本相符。在试验设定的10 d培养周期中，除了草莓、红圣女果培养基，其他培养基中的菌丝体生物量均呈先上升后下降的趋势。

培养基不同，最适宜印度梨形孢生长的时间也不同。桃子、红圣女果培养基培养至第3 d时，菌丝体生物量最高；马铃薯、西瓜、苹果、玉米和黄圣女果培养基培养至第5 d时，菌丝体生物量最高；草莓培养基则为第7 d。在8种不同的培养基中，印度梨形孢产菌丝体的能力依次为玉米>马铃薯>桃子>西瓜>苹果>黄圣女果>红圣女果>草莓。在玉米培养基中培养3 ~ 7 d时，菌丝体生物量显著高于其他处理，第5 d时，菌丝体生物量达到峰值，鲜重为24.09 g，干重为1.98 g；马铃薯培养基的培养效果次之。

综上可知，最适宜印度梨形孢液体培养的培养基是玉米培养基。

3 讨论与结论

天然有机添加物富含氨基酸、蛋白质、酶、生长调节剂等一些复杂化合物，它们对细胞和组织的增殖与分化有明显的促进作用。目前，印度梨形孢在PDA培养基上的生长速度还不够快，进一步筛选出适合印度梨形孢生长的培养基，可以加快其科研和工业化生产^[8-11]。舒珊等^[9]发现V8果汁培养基为印度梨形孢最适培养基，加入一定量的蔗糖能促进印度梨形孢生长。陈明花^[10]等研究了芹菜、白菜、椰子水和香蕉对印度梨形孢生长的影响，发现椰子水是有效促进印度梨形孢生长的最佳天然有机添加物，香蕉和白菜其次。

本研究对比了8种天然有机添加物培养基中印度梨形孢的生长情况，发现菌丝体增长速度有明显差异；玉米培养基最适合印度梨形孢的固体和液体培养，马铃薯的培养效果次之。玉米有丰富的纤维素、维生素、矿物质和不饱和脂肪酸等^[12-13]，够提供真菌繁殖所需营养。杨勇^[14]等研究发现，添加玉米汁的PDA培养基对米根霉有明显的促生作用。姜喜铃^[15]等发现，玉米粉琼脂培养基适于分离和培养特定种属的真菌。这些说明营养成分是影响印度梨形孢生长的关键因素。

印度梨形孢可以增强共生植物的抗逆能力，促进植物对外界营养的吸收。优化的培养基能够加快印度梨形孢菌肥的生产效率。使用印度梨形孢生物菌肥，可以促进作物生长，提高作物的品质和产量，还能减少农药化肥用量，减少环境污染，确保农业生态平衡。

参考文献

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基金资助

林芝市科技计划项目—校地合作项目(XDHZ-2020-01)

西藏农牧学院研究生教育创新计划项目(YJS2024-01)