藏猪耳组织成纤维细胞的分离、培养与冻存

Isolation, Culture and Cryopreservation of Fibroblasts from Xizang Pig ear

摘要

藏猪是青藏高原特有的生态猪种，是我国珍贵的地方种质资源。为了保护藏猪种质资源，本试验通过组织块贴壁法和胰酶消化法对藏猪耳部成纤维细胞进行分离培养、传代与冻存，绘制其生长曲线，使用台盼蓝染色法进行细胞活力检测，并进行真菌细菌、病毒和支原体污染检测。结果显示，两种方法均长出梭形、纺锤形或星形的成纤维细胞，发现使用组织块贴壁法培养成纤维细胞比胰酶消化法更易生长、形态学特征和活力更好，冻存复苏的细胞可以正常贴壁生长和传代；其生长曲线为典型的“S”型，潜伏期存在3 d，对数生长期从第4 d开始持续到第8 d，从第9 d开始进入生长抑制期；台盼蓝染色检测活力发现冻存前后成纤维细胞的生长活率在90%以上，且发现不存在真菌细菌、病毒和支原体污染。本试验成功对藏猪耳组织成纤维细胞进行分离纯化培养与冻存，可为体外藏猪克隆提供材料，并为完善藏猪成纤维细胞种质资源库奠定基础。

Abstract

Xizang pig is a unique ecological pig breed in Qinghai-Xizang Plateau and a precious local germplasm resource in China. In order to protect the germplasm resources of Xizang pigs, the ear fibroblasts of Xizang pigs were isolated, cultured, subcultured and cryopreserved by tissue block adhesion method and trypsin digestion method, their growth curve was drawn. Trypan blue staining was used to detect cell viability and fungal bacteria, virus and mycoplasma contamination. The results showed that spindle-shaped, spindle-shaped or star-shaped fibroblasts were grown by both methods. It was found that fibroblasts cultured by tissue attachment method were easier to grow, morphological characteristics and vitality were better than trypsin digestion method. Cryopreserved resuscitated cells can grow and passage normally. The growth curve was typical "S" type, the incubation period existed for 3 days, the logarithmic growth period lasted from the 4th day to the 8th day, and entered the growth inhibition period from the 9th day. Trypan blue staining showed that the growth rate of fibroblasts was more than 90% before and after cryopreservation, and there was no fungal bacteria, virus and mycoplasma contamination. The successful isolation, purification, culture and cryopreservation of Xizang pig ear fibroblasts in this experiment can provide materials for Xizang pig cloning in vitro and lay a foundation for perfecting the germplasm bank of Xizang pig fibroblasts.

Graphical abstract

关键词

藏猪 / 耳部组织成纤维细胞 / 分离培养 / 活力测定 / 生长曲线

Key words

Xizang pig / ear tissue fibroblasts / isolation and culture / activity determination / growth curve

藏猪是一种独特且地理上孤立的猪品种，栖息在青藏高原等高海拔地区，是我国珍贵的地方种质资源，也是仅存的几个具有高原习性的国家保护猪种之一^[1]。藏猪可以在高海拔、缺氧、严寒、强紫外线辐射、食物匮乏等极端恶劣环境下生存，具有较强的适应、抗病和耐糙能力，同时造成藏猪繁殖性能较差，对其物种资源的保护具有重要意义^[2]。

自1996年第一只克隆羊“多莉”诞生以来，已经通过体细胞核移植（Somatic cell nuclear transplantation，SCNT）技术实现了23种哺乳动物的胚胎克隆，并成功获得克隆个体^[3]。尽管SCNT技术在遗传领域取得了较大的成功，但因其克隆效率极低、胚胎外组织异常以及克隆胚胎遗传表型异常等限制了SCNT技术的实际应用^[4]。研究发现供体细胞类型和转移到单个替代物的克隆胚胎数量是影响供体细胞核移植成功率的两个主要因素^[5]。目前在体细胞克隆中应用最广泛的供体细胞是成纤维细胞，研究人员已经利用成纤维细胞成功克隆出猪、牛、羊、犬、马等多种动物^[4]。

成纤维细胞于1858年由Rudolf Virchow首次描述为位于结缔组织中的纺锤形细胞^[6]。在细胞体外培养早期，发现成纤维细胞比其他种类的细胞更易在玻璃和塑料上繁殖，且具有取材方便、增殖能力强、分化稳定性高、易于观察且可以保存生物体遗传信息的特点，成为良好的细胞核供体材料和研究细胞生物学的重要工具细胞之一^[7]。目前国内外关于体外培养藏猪耳组织成纤维细胞的报道较少^[8]，本试验通过对藏猪耳部成纤维细胞分离培养、传代与冻存，绘制其生长曲线，并进行活力测定和真菌细菌、病毒与支原体检测，并为完善藏猪体细胞库，丰富藏猪物种资源保护体系奠定基础。

1 材料与方法

1.1 主要试剂和仪器

DMEM培养基、0.25%胰酶消化液，购自甘肃亚克隆生物科技有限公司；胎牛血清，购自安宁众庆生物科技经营部；青霉素/链霉素、DMSO，购自美国赛默飞世尔科技公司；细胞冻存管，购自美国康宁公司。CO₂培养箱（CCL-170B-8，新加坡艺思高科技有限公司）；台式低速离心机（HDL-4，常州华奥仪器制造有限公司）；倒置显微镜（DMIL，德国徕卡仪器有限公司）。

1.2 藏猪耳组织采集

3月龄以上藏猪耳组织采集于西藏自治区工布江达县藏猪产业园区。使用手术刀片刮净耳组织取样处被毛，碘酒擦拭，75%酒精脱碘，灭菌耳缺钳剪取4块耳组织。在无菌环境下使用无菌镊子夹取耳组织快速用75%酒精浸洗60 s，再置于含5%双抗的DPBS中漂洗两次，置于无菌真空袋中，使用真空机抽真空、封口，置于4 ℃车载冰箱带回实验室。

1.3 藏猪耳组织成纤维细胞的分离与培养

1.3.1 组织块贴壁法

在超净工作台将组织块置于75%的酒精中浸洗10 s后置于含2%双抗的DPBS中浸泡10 s两次，置于35 mm培养皿中，使用无菌手术刀片刮除耳组织残余被毛和软骨组织，用含2%双抗的DPBS涮洗干净。用无菌眼科剪将耳组织剪成大小约1 mm³的组织块，将剪碎的组织块使用无菌眼科镊移至T25细胞瓶瓶口，用移液枪将组织块均匀铺满瓶底。加入2 mL胎牛血清，倒置培养。6 h后轻轻翻转细胞瓶，使胎牛血清浸润组织培养。24 h后更换为2 mL含10%胎牛血清的DMEM，每隔2 d更换1次培养液。

1.3.2 胰酶消化法

与组织块贴壁法之前步骤一样，将组织块转移到培养瓶之前，在组织块中加入3 mL 0.25%胰酶消化液，转移至无菌离心管中，再添加4 mL 0.25%胰酶消化液混匀，37 ℃水浴消化20 min，吹打20次，加入7 mL含10%胎牛血清的DMEM终止消化；用70 μm细胞筛过滤至新的离心管，1 200 r/min离心5 min，弃上清，加入4 mL含10%胎牛血清的DMEM重悬细胞，分装到T25细胞瓶中培养，每隔2 d更换1次培养液。

1.4 藏猪耳组织成纤维细胞的纯化培养与传代

原代培养的成纤维细胞生长至80 ~ 90%，弃原培养基，用DPBS清洗2 ~ 3次，再加入1 mL 0.25%胰酶消化液，消化5 ~ 10 min。显微镜下观察，待80%细胞脱壁呈圆球形时，轻轻震荡培养瓶底，并用移液枪吹打和收集对胰酶敏感性强且最先收缩浮起的成纤维细胞，加入2 mL含10%胎牛血清的DMEM终止消化。1 500 r/min离心5 min，弃上清，加入5 mL含10%胎牛血清的DMEM重悬细胞，吸取细胞悬液置于T75细胞培养瓶，使用“十”字交叉法将原代细胞均匀分布在细胞培养瓶内，平稳放入CO₂培养箱，前3 d每12 h更换一次培养基，之后每24 h更换一次培养基。经过2 ~ 3代纯化培养，既可获得纯化的耳组织成纤维细胞。待细胞生长至90%时按照一传三使用0.25%胰酶消化液进行消化传代或冻存。

1.5 绘制藏猪耳组织成纤维细胞生长曲线

绘制纯化培养的成纤维细胞的生长曲线。向12孔培养板孔内接种333 μL密度为1 × 10⁴个/mL的细胞，从接种日算起，每24 h使用血细胞计数板计数3孔内的细胞密度，计算平均细胞密度，测定9 d；以培养时间作为横坐标、细胞密度作为纵坐标，绘制细胞生长曲线。

1.6 藏猪耳组织成纤维细胞冷冻保存与复苏

细胞冷冻保存：纯化培养的成纤维细胞生长至80% ~ 90%，使用胰酶消化液进行消化，步骤同1.4。经过2次离心收集细胞，加入1 mL细胞冻存液（DMEM：胎牛血清：DMSO = 7：2：1）混匀，调整细胞密度达1 × 10⁵个/mL以上，加入到1.8 mL冻存管中。冻存程序：4 ℃平衡40 min，-20 ℃冻存2 h，-80 ℃冻存过夜，次日放入液氮中长期保存。

细胞复苏：从液氮中取出冻存细胞，快速置于38 ℃水浴锅中解冻2 ~ 4 min，1 500 r/min离心5 min，弃上清液，加入4 mL含10%胎牛血清的DMEM重悬细胞，接种到12孔细胞培养板上，每瓶接种333 μL细胞悬液，于CO₂培养箱中培养。

1.7 藏猪耳组织成纤维细胞的活力检测

用台盼蓝染色法检测冻存前和复苏后藏猪耳组织成纤维细胞的活力，使用移液枪吸取9 μL的细胞悬液，滴加1 μL 0.4%台盼蓝染色混匀，用细胞计数板在显微镜下计数死亡细胞和总细胞数，统计细胞存活率。

1.8 藏猪耳组织成纤维细胞真菌细菌、病毒和支原体检测

将待检细胞接种到盖玻片上，加入2 mL无抗生素培养液培养3 d，阴性对照加入DMEM细胞培养液2 mL培养3 d。观察培养基是否长出杂质或变为黄色，检测真菌细菌污染；使用空相显微镜观察有无空斑、蚀斑，检测病毒污染；使用DNA染色法检测支原体，取出盖玻片吹干，固定液固定10 min，滴加5 ug/mL的Hoechst 33258荧光染液染色30 min，DPBS浸洗3次，滴加含有1%甘油的DPBS后盖在载玻片上，使用荧光显微镜观察细胞核外是否有蓝色荧光小点或丝状点的荧光物产生，检测支原体污染。

2 结果

2.1 藏猪耳组织成纤维细胞分离培养与纯化结果

耳部组织贴壁生长36 h后周围先长出大量的扁平样细胞，贴壁7 d左右可以看到组织块周围长出大量的梭形、纺锤形或星形的细胞（图1 A）；胰酶消化法培养生长至72 h开始出现融合，长出零零散散的梭形且扁平的细胞（图1 B）；发现胰酶消化法比组织块贴壁法细胞培养细胞生长速度缓慢，且细胞数量较少。随着培养天数增加，成纤维细胞的数量逐渐增多，在第9 d细胞贴壁生长至90%左右，弃培养基，使用DPBS洗2遍，再传代到第3代，即可获得纯化的成纤维细胞（图2），在第2 ~ 3代进行冻存。

2.2 藏猪耳组织成纤维细胞生长曲线

藏猪耳部组织成纤维细胞生长曲线呈“S”型（图3）。组织贴壁后，前1 ~ 4 d为潜伏期，细胞生长缓慢；第4 d开始进入对数生长期，细胞迅速生长；第9 d进入生长抑制期，细胞生长缓慢。

2.3 藏猪耳组织成纤维细胞活力检测结果

对冻存一定时间的成纤维细胞进行复苏和检测，细胞解冻复苏后培养接种在12孔板生长状态良好，形态和生长特性与冻存前培养一致。冷冻保存之前，藏猪耳组织成纤维细胞的平均活率为93.12%（图4 A），复苏后平均活率为91.24%（图4 B），二者没有显著性差异。

2.4 藏猪耳组织成纤维细胞真菌细菌、病毒和支原体检测结果

培养藏猪耳组织成纤维细胞的培养基颜色未变黄，未见云雾状和丝状物，表明细胞无真菌细菌污染（图5 A）；在相差显微镜下观察细胞，细胞生长状态良好，无空斑，表明细胞无病毒感染（图5 B）；使用DNA染色法检测支原体，结果显示在荧光显微镜下观察细胞仅细胞核发出蓝色荧光，细胞周围无蓝色荧光小点或串珠状荧光小点，表明细胞无支原体污染（图5 C）。

3 讨论

体外培养皮肤成纤维细胞常用的方法是用胰酶消化法和组织块贴壁法^[9]。胰酶消化法利用胰蛋白酶消化组织，去除细胞间质，使细胞分离形成细胞悬液，有利于细胞的生长，更易摄取营养和排泄代谢产物，但是该方法操作较为繁琐，容易导致污染，而且极易对细胞造成伤害。组织块贴壁法是将大组织块剪很小的组织片贴壁培养，使细胞游离到培养基表面生长，该方法培养细胞时间较长，但具有操作简单、无污染和生长均匀的优点，更有利于后期的细胞培养^[10]。本试验使用胰酶消化法和组织块贴壁法对藏猪耳部组织成纤维细胞进行原代培养，两种方法均长出梭形、纺锤形或星形的成纤维细胞，且发现使用组织块贴壁法培养成纤维细胞比胰酶消化法更易生长、形态学特征和活力更好

细胞生长曲线是描述细胞群随时间生长密度变化的方法之一，可用来判定细胞活力和生物学特性的重要指标^[11]。正常的细胞生长曲线多呈“S”型，细胞生长的过程分为潜伏期、对数生长期、稳定期和衰老期4个时期^[12]。本试验绘制藏猪耳组织成纤维细胞生长曲线呈典型的“S”型曲线，发现其潜伏期存在3 d，对数生长期从第4 d开始持续到第8 d。从第9 d开始进入生长抑制期。本试验结果与赵彦玲等^[8]所培养的藏猪耳部成纤维细胞的生长时间略有差异，与李忠秋^[13]、成文敏^[14]等绘制猪成纤维细胞的生长曲线基本一致。

染色排除是一种简单而快速的检测细胞活力的技术，该技术由活细胞的细胞膜完整性间接决定，可用于确定细胞悬液中存在的活细胞数量^[15]。目前最常用的检测细胞活率的染色排除方法是台盼蓝染色法，其基本原理是活细胞具有完整的细胞膜，而台盼蓝染料无法透过完整的细胞膜，不能使活细胞着色；但死亡细胞的细胞膜被破坏，通透性增加，台盼蓝可透过细胞膜使死细胞呈蓝色^[16]。本试验通过台盼蓝染色法检测细胞活率，发现成纤维细胞冻存前后的活力分别为93.12%和91.24%，比赵彦玲等^[8]培养的藏猪成纤维细胞的活力低，但总体活力均在90%；且发现培养的细胞不存在真菌细菌、病毒和支原体污染，可以实现成纤维细胞的长期保存。

4 结论

本试验应用组织块贴壁法和胰酶消化法成功在体外分离纯化藏猪耳组织成纤维细胞，发现前者培养的成纤维细胞生长状态和活力比后者好；绘制生长曲线呈“S”型；对耳组织成纤维细胞进行冻存和复苏，发现冻存前后活力均在90%以上，且未发现存在污染，可为体外藏猪克隆提供材料，并为完善藏猪细胞种质资源库奠定基础。

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基金资助

第三次全国畜禽遗传资源普查项目

西藏自治区科技厅区域协同创新专项(QYXTZX-NQ2022-04)

西藏自治区科技厅重点项目(XZ202001ZY0044N)