牦牛KSR2基因的双荧光素酶质粒构建及其与bta-miR-22-3p的靶向验证

Construction of Dual Luciferase Reporter Plasmid for The KSR2 Gene of Yak and Its Targeted Validation with Bta-miR-22-3p

摘要

为了鉴定牦牛体内bta-miR-22-3p与KSR2之间的靶向关系，本研究采用miRNA Base数据库对牦牛体内bta-miR-22-3p的序列进行分析，并用Target scan软件预测牦牛bta-miR-22-3p于KSR2基因的3’UTR可能存在的结合位点，然后采用PCR扩增出包含bta-miR-22-3p结合位点的牦牛KSR2基因3'非编码区（3’UTR）片段，并构建出KSR2基因的3’UTR的野生型双荧光素酶报告基因质粒和突变型双荧光素酶报告基因质粒，并将其与bta-miR-22-3p mimics、mimics NC 共转染至人胚肾细胞（HEK 293T细胞）中，检测其双荧光素酶活性。miRNA Base数据库中bta-miR-22-3p的序列为AAGCUGCCAGUUGAAGAACUG；Target scan 预测出bta-miR-22-3p共有包括KSR2基因在内的568个潜在靶基因，其中包括612个保守位点和190个低保守位点，并且在KSR2基因3’UTR的829-836 bp处存在潜在的bta-miR-22-3p的结合位点；构建的野生型质粒和突变型质粒经双酶切后释放出大小315 bp的条带，测序结果与预期一致，说明质粒构建成功；bta-miR-22-3p mimics能够显著降低（P<0.01）KSR2野生型质粒双荧光素酶的活性。最终说明，牦牛KSR2基因3’UTR双荧光素酶报告基因载体构建成功，并且该基因与bta-miR-22-3p存在靶向关系。

Abstract

In order to identify the targeted relationship between bta-miR-22-3p and KSR2 in yak, this study used the miRNA Base database to reference the sequence of bta-miR-22-3p in yak, and used TargetScan software to predict the potential binding sites of bta-miR-22-3p in the 3'UTR of the KSR2 gene. Then, PCR was used to amplify the yak KSR2 gene 3' untranslated region (3'UTR) fragment containing the binding site of bta-miR-22-3p, and wild-type and mutant dual-luciferase reporter gene plasmids of KSR2 gene 3'UTR were constructed. These plasmids were co-transfected into HEK 293T cells with bta-miR-22-3p mimics and mimics NC, and the dual-luciferase activity was detected. The sequence of bta-miR-22-3p in the miRNA Base database is AAGCUGCCAGUUGAAGAACUG. Target Scan predicted that bta-miR-22-3p has a total of 568 potential target genes, including the KSR2 gene, with 612 conserved sites and 190 low-conserved sites. There is a potential binding site of bta-miR-22-3p in the 829-836bp region of the KSR2 gene 3'UTR. The constructed wild-type and mutant plasmids released bands of 315bp after double enzyme digestion, and the sequencing results were consistent with expectations, indicating the successful construction of the plasmids. The bta-miR-22-3p mimics effectively reduced the activity of dual-luciferase reporter gene of wild-type plasmids. In conclusion, the dual-luciferase reporter gene vector of yak KSR2 gene 3'UTR has been successfully constructed, and there is a targeted relationship between this gene and bta-miR-22-3p.

Graphical abstract

关键词

bta-miR-22-3p / KSR2 / 双荧光素酶 / 牦牛

Key words

bta-miR-22-3p / KSR2 / dual-luciferase / yak

miRNA是真核生物中广泛存在的一种非编码可调节其他基因的表达长约21至23个核苷酸的RNA分子^[1]。研究发现miRNA参与了调节多种疾病的形成和发展的过程，如肿瘤、炎症等^[2]。miRNA利用一部分碱基对去识别mRNA，并能够抑制其表达^[3]。蛋白质基因家族中很大一部分都在miRNA的控制之下，所以特定的miRNA的产生是基因调控过程中重要的一部分^[4]。作为microRNA家族的miR-22-3P被Xia证实，miR-22-3p可以通过通过海马中的NF-κB信号通路靶向Sox9来改善阿尔兹海默症^[5]。Wang的研究结果证实，miR-22-3p通过靶向IGFBP3参与骨骼肌细胞的增殖和分化^[6]。Liu的研究结果证实M2巨噬细胞释放的细胞外囊泡中的 miR-22-3p下调PER2，从而通过Wnt/β-catenin信号通路促进间充质干细胞的成骨分化^[7]。研究证明，miRNA对牛子宫内膜炎也有着一定的调控作用^[8]。

Ras2（KSR2）的激酶抑制因子是一种参与多种信号通路的细胞内支架蛋白^[9]。Zhang的研究结果发现，miR-31靶向肿瘤抑制基因KSR2，从而证明miR-31具有肿瘤遗传功能^[10]。Michele K Dougherty等发现蛋白磷酸酶钙调神经磷酸酶选择性地与KSR2相互作用，并且KSR2对Ca2+介导的ERK信号传导有独特的贡献^[11]。

丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）信号通路是一种保守良好的细胞内信号转导通路，在哺乳动物繁殖中具有重要作用^[12]。Li的研究显示，miR-22-3p参与MAPK信号通路，并可被sh-SPRY4-IT1上调来使MAPK信号失活来抑制细胞增殖和运动^[13]。Cui的研究证明 miR-22 表达抑制ERK信号通路，并且这种作用是由于其 SPRY2 的上调^[14]。Liu的研究发现，KSR-2可能作为类似于KSR-1的支架蛋白来介导MAPK核心（RAF-MEK-ERK）信号传导，还可能参与许多MAPK下游信号分子的激活，例如p38 MAPK，细胞凋亡，细胞周期控制以及DNA合成和修复途径的蛋白质，以及介导MAPK与其他几种信号通路之间的串扰^[15]。但是，在牦牛子宫内膜炎中，参与MAPK信号通路的bta-miR-22-3p是否靶向KSR2基因还未被证实。

本试验准备利用生物信息学软件预测bta-miR-22-3p靶基因是否包含KSR2基因，并通过双荧光素酶试验验证预测结合位点的可靠性，为今后进一步研究牦牛子宫内膜炎的治疗的分子机制奠定理论基础。

1 材料与方法

1.1 实验材料

293T细胞系、感受态细胞购于武汉伯韬生物科技有限公司，DMEM培养基购于Servicebio，胎牛血清购于ExCell Bio，青霉素-链霉素溶液（双抗，100X）购于Procell，含有0.25%的胰酶、PBS缓冲液（1X）购于Biosharp，OPTI-MEM购于GIBCO，lipofectamine™2 000购于Invitrogen，双荧光素酶报告基因检测试剂盒购于Beyotime，Taq DNA Polymerase、dNTP、DL2 000 DNA Maker、DL15 000 DNA Maker均购于TIANGEN公司，T4 DNA Ligase购于TRANS，XhoI、Not I购于TAKARA，薄型琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒、质粒小量制备试剂盒购于GENERAY Biotechnology，质粒大提试剂盒（金牌超量无内毒素型）购于康为世纪，引物由北京擎科生物科技有限公司合成，miRNA mimics、PUC57-bta-KSR2-3’UTR由金斯瑞生物科技股份有限公司合成。

1.2 试验方法

1.2.1 生物信息学分析

利用miRNA Base数据库（https://www.mirbase.org/）获得bta-miR-22-3p的参考序列。利用Target Scan (https://www.targetscan.org/vert_80/) 预测出bta-miR-22-3p的靶基因，选定KSR2作为候选靶基因并预测bta-miR-22-3p与KSR2基因之间的潜在的结合位点。从NCBI数据库(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)获得牦牛的KSR2基因的3’UTR序列^[16]。

1.2.2 双荧光素酶报告基因野生型载体的构建

利用primer 5.0软件设计包含bta-miR-22-3p结合位点的KSR2 3’UTR区扩增引物，分别在上、下游引物加入Xho Ⅰ、Not Ⅰ酶切位点及保护碱基。引物序列为：bta-KSR2 -F:5’-CCCTCGAGTTT TTGTAACTGAGACCA-3’;bta-KSR2:R:5’-TTG CGGCCGCTATAATTACATAAG T-3’，预期扩增片段大小为315 bp。以PUC57-bta-KSR2-3’UTR为模板，PCR扩增合成KSR2-3’UTR序列片段，PCR扩增体系为50 μL：KSR2上下游引物各 1 μL、dNTP(2.5 mM) 4 μL、Taq Plus DNA Polymerase 1 μL、10×Taq Plus DNA Polymerase buffer 5 μL、cDNA 1 μL，然后加ddH₂O至50 μL。反应条件为：95 ℃预变性10 min，95 ℃变性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，30个循环；72 ℃延伸10 min，4 ℃保存4 min。反应结束后，将PCR引物进行琼脂糖凝胶电泳，对目的片段进行切割，利用薄型琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒进行回收纯化。

1.2.3 限制性内切酶酶切与产物回收

使用限制性内切酶Xho Ⅰ和Not Ⅰ对pYr-MirTarget空载体和回收的目的DNA片段进行酶切，酶切体系40 μL，10 × buffer H 4 μL，pYr-MirTarget载体2 μg，限制性内切酶Xho Ⅰ和Not Ⅰ各1 μL，ddH₂O加至40 μL。将其置入37 ℃，5 h；bta-KSR2 30 μL、限制性内切酶Xho Ⅰ和Not Ⅰ各1 μL，Buffer H 4 μL，ddH₂O加至40 μL。采用1%琼脂糖凝胶进行电泳，使用薄型琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒回收纯化，得到pYr-MirTarget空载体和目的片段。

1.2.4 连接、转化和鉴定

取回收纯化的目的DNA片段bta-KSR2 3’UTR与回收纯化的载体pYr-MirTarget进行连接，连接体系10 μL:T4 DNA Ligase 1 μL，5 × T4 Buffer 2 μL，载体pYr-MirTarget 1μL，回收产物6 μL，4 ℃过夜连接。随后将其转化至感受态细胞DH5α中，16 h后，从培养皿上各挑取数个单克隆菌落，接种于含氨苄抗性的Luria-Bertani中37 ℃恒温摇床培养过夜。取菌液去测序。

1.2.5 KSR2突变型质粒构建

以KSR2野生型的载体质粒为模板，采用完全突变方式进行碱基突变预测的bta-miR-22-3p的结合位点进行突变所用的引物序列：bta-KSR2-3’UTR-F: 5’-CCCTCGAGTTTTTGTAACTGAGAC CA-3’,bta-KSR2-3’UTR:R:5’-TTGCGGCCGC TATAATTACATAAGT-3’;bta-KSR2-3’UTR-mut-F:TTAACTCACCCAGAAAccgtcgatACATATATAT ATATAATTTC,bta-KSR2-3’UTR-mut-R:TTATA TATATATATGTatcgacggTTTCTGGGTGAGTTAAGT。小写标注的是突变位点。过程：以野生型序列为模板，加以突变所用的引物进行PCR扩增。再通过双酶切、回收纯化、连接转化，得到目的片段，随后取1 μL进行1%琼脂糖凝胶电泳检测，反应体系：bta-KSR2-3’UTR-mut F（10 uM）、bta-KSR2-3’UTR -mut R（10 uM）、PrimeSTAR GXL DNA Polymerase、pYr-MirTarget-bta-KSR2-3’U TR 小提质粒均是1 μL，dNTP Mixture(2.5mM)取4 μL，5 × PrimeSTAR GXL Buffer取10 μL，最终ddH₂O加至50 μL。反应条件：98 ℃预变性5 min；98 ℃变性10 s，55 ℃退火15 s，68 ℃延伸6 min 30 s，30个循环；68 ℃延伸10 min，4 ℃保存10 min。

1.2.6 细胞转染及双荧光素酶活性检测

取培养瓶中生长状态良好的HEK 293T细胞接种于12孔板中，37 ℃、5% CO₂培养箱中培养12 h。待细胞长至80%时进行转染。用50 μL的opti-MEM稀释1μg质粒和2.5 μL的siRNA，并用枪头轻轻混匀，室温下静置5 min。将混匀好的Lipofectamine™2 000取出3 μL，用50 μL的opti-MEM稀释，室温静置5 min。随后混合Lipofectamine™2 000与质粒和siRNA的稀释液（总体积是100 μL），轻轻混匀，室温静置20 min。每个细胞培养孔分别滴加100 μL的培养液，前后轻轻摇动细胞培养板使混合液与培养板中培养液混匀。细胞处理分组分别为A组KSR2野生型报告质粒+ mimics NC（野生型对照组）;B组KSR2野生型报告质粒+ bta-miR-22-3p mimics;C组KSR2突变型报告质粒+ mimics NC（突变型对照组）;D组KSR2突变型报告质粒+ bta-miR-22-3p mimics。细胞置于细胞于37 ℃ CO₂培养箱中培养，6 h后吸出混合液换入正常培养基。然后置于37 ℃、5% CO₂培养箱中继续培养。质粒转染进细胞48 h后，按照双荧光素酶报告基因检测试剂盒说明书操作，利用报告基因细胞裂解液充分裂解细胞，随后收集上清液使用酶标仪进行荧光素酶活性的测定。根据海肾荧光素酶RLU值与萤火虫荧光素酶RLU值的比值来比较目的报告基因的激活程度。

1.2.7 统计学分析

使用one-way ANOVA检验方法确定每组之间的差异，并使用GraphPad Prism^®9.5软件进行统计分析。数据以平均值±SEM 表示，P< 0.05被认为具有统计显著性。

2 结果

2.1 生物信息学分析

从miRNA Base数据库中获取bta-miR-22-3p序列为AAGCUGCCAGUUGAAGAACUG。通过在线生物信息学软件Target Scan分析出牦牛bta-miR-22-3p的靶基因共有568个，包括612个保守位点和190个低保守位点。其中，KSR2基因3’UTR的829-836 bp处存在一个潜在的bta-miR-22-3p的结合位点（图1），据此推测KSR2基因可能是bta-miR-22-3p的一个靶基因。

2.2 KSR2基因3’UTR双荧光素酶报告基因质粒构建

利用常规PCR、双酶切、回收纯化等过程分别构建了野生型（wt）以及突变型（mut）双荧光素酶报告载体，结构示意图如图2所示。构建的2种报告基因质粒经XhoⅠ和NotⅠ双酶切，琼脂糖凝胶电泳结果显示释放出与预期大小相符的片段（图3），结合测序结果表明质粒构建成功。

2.3 酶切测序分析

阳性克隆菌落测序结果见，野生型质粒的序列与参考序列一致，在构建质粒过程中未产生新的突变;突变型质粒的序列从GGCAGCTA突变为CCGTCGAT，与设计的突变序列一致。证明两种质粒均构建成功，可用于下一步荧光素酶活性检测^[17]。

2.4 双荧光素酶活性检测

将野生型和突变型双荧光素酶报告基因质粒分别与bta-miR-22-3p mimics、mimics NC共转染至HEK 293T细胞，两天（48 h）后裂解细胞，取细胞裂解液测定双荧光素酶活性。结果显示，突变与bta-miR-22-3p结合的潜在结合位点后，质粒的双荧光素酶活性上升（图5）；与mimics NC+ KSR2 野生型报告质粒组相比，bta-miR-22-3p mimics+KSR2 野生型报告质粒组显著（P<0.01）抑制了野生型质粒的双荧光素酶活性，位点突变后抑制作用减弱，而位点突变后抑制作用减弱。

3 讨论

MicroRNA是大约22个核苷酸长的小非编码RNA，能够通过抑制翻译来控制基因表达^[18]。Tang等研究了miR-22-3p在类风湿性关节炎中的作用，结果表明miR-22-3p可以作为该疾病的诊断标志物^[19]。Ji的研究结果表明了miR-22-3p在阿尔兹海默病上也有着一定的调控作用，其结果显示，在小鼠模型中miR-22-3p的过表达可以减少淀粉样蛋白β沉积，缓解阿尔兹海默病的症状^[20]。Wang等研究了miR-22-3p在乳腺癌细胞中所发挥的作用，研究表明了miR-22-3p的过表达抑制了乳腺癌细胞在体外和体内的增殖和迁移^[21]。同时也有研究表明miR-22-3p在生物体内发生的炎症损伤上也发挥着重要作用。Wang等人的研究表明miR-22-3p的过表达可以抑制尿酸单钠诱导的痛风炎症^[22]。Trevon Swain等研究了猪体内miR-22-3p对于LPS诱导的3D4/21细胞炎症模型中的所发挥的作用，结果表明miR-22-3p的表达可以调节炎症因子，为未来炎症的治疗提供了方法^[23]。

KSR2是AMP激酶、能量消耗和胰岛素敏感性的重要调节因子，其充当分子支架，有效调节MAP激酶ERK1/2并影响了多种细胞命运^[24]。Xue的研究表明，miR-31可以通过减少其上游激酶抑制因子KSR2上调IL-2表达，使得T细胞活化^[25]。另外，miR-3138可以通过KSR2/AMPK/GLUT4信号通路显著恶化了人脐静脉内皮细胞的胰岛素抵抗^[26]。KSR2还参与了细胞增殖的调节，并在人浸润性乳腺导管癌中表达上调^[27]。这些研究结果表明，KSR2在不同物种细胞的不同发展阶段能够起到一定的调节作用。但是，在牦牛子宫内膜炎中报道不多。

本研究首先利用生物学信息分析数据库对多个物种进行比对，发现bta-miR-22-3p在多个物种之间具有较高的保守性。进一步预测发现KSR2基因的3’UTR区域存在与bta-miR-22-3p结合的位点，这提示KSR2可能是bta-miR-22-3p的靶基因。为了验证这一假设，构建了KSR2的野生型和突变型双荧光素酶报告基因质粒。然后，将构建好的质粒与bta-miR-22-3p mimics和mimics NC共转染至 HEK 293T细胞中，并检测双荧光素酶活性。结果显示，bta-miR-22-3p mimics与KSR2-3’UTR-野生型组共转染后，相对双荧光素酶活性显著降低，而bta-miR-22-3p mimics与KSR2-3’UTR-突变型组共转染后，相对双荧光素酶活性没有显著差异。这些实验结果进一步确认了bta-miR-22-3p能够通过与KSR2基因的预测结合位点靶向结合，从而调节KSR2的表达水平。这些发现为进一步研究bta-miR-22-3p在牦牛子宫内膜炎中的调节作用提供了理论基础。

4 结论

本试验通过miRbase数据库分析了bta-miR-22-3p的序列，发现其具有较高的保守性，并利用Target Scan软件预测到bta-miR-22-3p与KSR2可能具有潜在的结合位点，并成功构建了KSR2的3’UTR的野生型和突变型的双荧光素酶报告基因的质粒，通过试验验证了两者具有靶向关系，为牦牛子宫内膜炎进一步的治疗提供了理论支持。

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基金资助

西藏自治区自然科学基金项目(XZ202101ZR0024G)

西藏农牧学院2024年重点学科建设项目(XK2024-02)