一株野生金毛鳞伞的分离、鉴定及其生物学特性分析

Isolation, Identification and Analysis of Biological Characteristics of a Wild Pholiota aurivella

摘要

金毛鳞伞（Pholiota aurivella）是野生食药用菌品种之一，在我国广泛分布，但目前对其发掘利用有限。为进一步充分开发和利用该菌种质资源，试验以采自西藏林芝市西藏农牧学院校园内柳树上的一株野生食用菌，编号为HC-1为材料。对该菌子实体形态、菌丝、孢子等进行形态学观察和ITS序列测定，通过系统发育分析比较，将该菌株鉴定为金毛鳞伞（P.aurivella）。通过单因素试验和正交试验对该菌株菌丝的最适生长条件进行生物学特性研究。结果表明：菌株HC-1菌丝生长的最佳碳源为蔗糖，最佳氮源为酵母膏，最适pH为7.0，最适温度为25 ℃，最佳无机盐为磷酸二氢钾，最适生长因子为维生素C。正交试验表明，菌株HC-1菌丝生长的最佳配方为蔗糖25.0 g·L^-1，酵母膏3.0 g·L^-1，pH为7.0，硫酸镁2.0 g·L^-1。

Abstract

Pholiota aurivella is one of the wild edible and medicinal fungi, which is widely distributed in China, but its exploitation and utilization is limited at present. In order to further develop and utilize the strain resources, a wild edible fungus, No. HC-1, was taken from the willow tree on the campus of Xizang Agricultural and Animal Husbandry College in Linzhi, City, Xizang. The strain was identified as Pholiota aurivella by morphological observation, ITS sequence determination and phylogenetic analysis. The biological characteristics of the optimum growth conditions of the mycelia were studied by single factor test and orthogonal test.The results revealed that for the HC-1 strain of Pholiota aurivella, the optimal carbon source for mycelial growth was sucrose, the best nitrogen source was yeast extract, the optimal pH was 7.0, the preferred temperature was 25°C, the optimal inorganic salt was potassium dihydrogen phosphate, and the most suitable growth factor was vitamin C. Orthogonal experiments indicated that the optimal formula for mycelial growth of strain HC-1 was 25.0 g·L^-1 sucrose, 3.0 g·L^-1 yeast extract, pH 7.0, and 2.0 g·L^-1 magnesium sulfate.

Graphical abstract

关键词

金毛鳞伞 / 分离 / ITS鉴定 / 生物学特性

Key words

Pholiota aurivella / Isolation / ITS identification / Biological properties

金毛鳞伞(Pholiota aurivella)隶属于担子菌门(Basidiomycota)、蘑菇纲(Agaricomycetes)、蘑菇目(Agaricales)、球盖菇科(Strophariaceae)、鳞伞属(Pholiota)，别名金毛环锈伞^[1-4]。该菌在我国西藏、内蒙古、陕西、吉林、四川和云南等地均有分布^[4,5]。属木腐性菌类，秋季群生于林中腐木上^[6,7]，能够降解木质素^[21]。其营养丰富、味道鲜美，是一种高蛋白低脂肪，具有良好食用价值的野生食用菌^[8]。除食用价值外，该菌还具较高的药用价值，有益气养血，滋阴补阳，活血化瘀和减少心脑血管疾病发生的功能^[9-18]。其子实体中含有聚合蛋白PAA，对不同血型的人红细胞的凝集作用良好^[19-21]。研究表明金毛鳞伞粗多糖对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、枯草芽孢杆菌均具有抑菌作用^[22]；对小白鼠肉瘤S-180和艾氏腹水癌的抑制率达80% ~ 90%^[5,23]；对小鼠酒精性肝损伤具有良好的保护效果。可以作为一种具有保肝活性、低毒的天然药物开发利用^[24,25]。

目前关于金毛鳞伞研究的文献较少，我国也仅见金毛鳞伞资源分布报道，对其进行系统的鉴定及生物学特性等方面鲜见报道。本试验以采自西藏林芝市西藏农牧学院校园内柳树上的一株野生金毛鳞伞为本研究试验材料，结合其形态特征和ITS分子生物学分析，进行分类鉴定。通过进行单因素试验和正交试验，研究不同因素对金毛鳞伞菌丝生长的平均速率、显著性差异、菌丝浓密程度等，以期为野生金毛鳞伞的后续应用、资源开发提供理论依据，以便后续科学利用该种质资源。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 供试菌株

野生金毛鳞伞子实体采自于西藏农牧学院校园内（纬度94°34′，经度29°67′，海拔3 100 m）柳树上，采用组织分离获得菌株，编号为HC-1，经PDA培养基纯化后，保存于西藏农牧学院生物技术楼真菌试验室。

1.1.2 供试培养基

野生菌种HC-1分离、活化使用PDA培养基：马铃薯去皮切片（煮汁）200 g·L^-1、琼脂粉20 g·L^-1、葡萄糖20 g·L^-1，蒸馏水1 000 mL，pH自然，121 ℃下灭菌30 min备用。

单因素试验和正交试验使用基础培养基：马铃薯去皮切片（煮汁）200 g·L^-1、磷酸二氢钾3 g·L^-1、葡萄糖20 g·L^-1、硫酸镁1.5 g·L^-1、维生素B 10 mg·L^-1、琼脂粉20 g·L^-1，蒸馏水1 000 mL，pH自然，121 ℃下灭菌30 min备用。

1.2 方法

1.2.1 形态学鉴定

对采集到的野生金毛鳞伞子实体的形状、颜色等形态特征进行观察、测量并拍照记录^[4,5,7]。将菌种（HC-1）于PDA培养基平板上进行转接，后置于25 ℃恒温培养箱中培养15 d，待形成菌落后观察其菌丝生长的颜色及浓密程度，对菌株HC-1进行初步分类。

1.2.2 分子生物学鉴定

利用CTAB法提取菌株HC-1的DNA，选用通用引物ITS1和ITS4对菌株HC-1进行PCR扩增。扩增后产物经凝胶电泳检测后送至天一辉远生物科技有限公司(武汉)进行测序，所得测序结果上传至Genbank数据库中，选择同源性较高的的ITS基因组序列进行BLAST序列比对。利用MEGA 11.0软件构建系统发育树。

1.2.3 生物学特性研究

用PDA培养基活化菌种，于25 ℃的恒温培养箱中培养15 d，以备用于单因素试验。菌丝生长速度(V，cm·d^-1)的计算公式为：

V=(d¹- d⁰)/D

式中：d¹为最后一次测量时菌落的直径(cm)；d⁰为菌柄直径0.8(cm)；D为培养时间(d)。

选用基础培养基进行单因素试验。分别探究5种不同碳源（麦芽糖、蔗糖、乳糖、果糖、木糖）、5种不同氮源（蛋白胨、酵母膏、牛肉膏、硝酸钾、硝酸铵）、6种不同pH（4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0）、5种不同温度（15 ℃、18 ℃、20 ℃、25 ℃、30 ℃）、5种不同无机盐（氯化钠、磷酸氢二钾、磷酸二氢钾、氯化钙、硫酸镁）以及6种不同生长因子（腺嘌呤、吲哚乙酸、赖氨酸、烟酸、维生素B₁、维生素C）对菌株HC-1菌丝生长的影响。

1.2.4 正交试验

依据单因素试验结果，将碳源、氮源、pH以及无机盐为因素按照L₉(3⁴)设计4因素3水平的正交试验，四因素分别为A(蔗糖)、B(酵母膏)、C(pH)、D(硫酸镁)，试验设计见表1。

1.2.5 数据处理

用Excel软件整理数据，用SPSS 26.0软件对试验数据进行显著性分析和多重比较。

2 结果与分析

2.1 形态学鉴定

金毛鳞伞形态学特征见图1。由图1A可知，金毛鳞伞子实体中等大小；菌盖直径5 cm ~ 15 cm，初期扁半球形，后期展开，中部稍凸，金黄色至橘黄或锈黄色。湿时粘，干燥时有光泽，具有明显的近角状鳞片且成圈分布，中部密，后期易脱落。菌肉初期淡黄色，后期柠檬黄色。菌褶直生或弯生，稍密，初近乳黄色，渐变锈黄色，后期褐色。菌柄长6 cm ~ 15 cm，直径0.6 cm ~ 1.4 cm，圆柱形，上部黄色，下部弯曲呈锈褐色。孢子印锈色（图1B）。在PDA培养基中，蔓延生长，菌落边缘不整齐，菌丝呈淡黄色，粗壮且浓密（图1C）。担孢子(4.0 μm ~ 4.5 μm) × (5.0 μm ~ 7.5 μm)，椭圆形，锈色，表面光滑（图1D）；褶侧囊体(4.8 μm ~ 8 μm) × (20 μm ~ 45 μm)无色，纺锤形；褶缘囊体无色，棒状。菌丝具锁状联合（图1E）。结合其宏观特征和微观特征，初步确定为金毛鳞伞。

2.2 分子生物学鉴定

将测序所得结果上传至NCBI中，之后进行BLAST比对，获得登录号OR123425.1。利用MEGA 11.0软件构建系统发育树见图2。由图2可知，作者自测序列与P. aurivella为同一支，且支持率高达98%。由此，结合形态学特征，确定所得野生食用菌为金毛鳞伞(P. aurivella)，编号为HC-1。

2.3 单因素试验结果

2.3.1 不同碳源对菌株HC-1菌丝生长的影响

菌株HC-1菌丝在添加不同碳源培养基中生长存在明显差异(图3和表2)。综合菌丝长速和长势来看，在5种碳源培养基中，菌株HC-1菌丝的长势最好的是蔗糖，菌丝生长速率为0.49 cm·d^-1；其次是木糖，菌丝生长速率为0.48 cm·d^-1；乳糖中生长最为缓慢，菌丝生长速率为0.21 cm·d^-1。因此，菌株HC-1的菌丝培养最适碳源为蔗糖。菌株HC-1菌丝对5种碳源的偏好表现为：蔗糖 ＞木糖 ＞麦芽糖 ＞果糖 ＞乳糖。

2.3.2 不同氮源对菌株HC-1菌丝生长的影响

菌株HC-1菌丝在添加不同氮源培养基中生长存在明显差异(图4和表3)。其中，菌株HC-1的菌丝在以酵母膏为氮源的培养基中生长最佳，菌丝生长速率为0.52 cm·d^-1；硝酸铵次之，菌丝生长速率为0.51 cm·d^-1；之后为硝酸钾，菌丝生长速率为0.45 cm·d^-1；在蛋白胨和牛肉膏中菌丝生长速率相同，都为0.34 cm·d^-1，但在蛋白胨中菌丝生长较牛肉膏浓密；在以尿素为氮源的培养基中不生长。因此，菌株HC-1的菌丝培养最适氮源为酵母膏。菌株HC-1菌丝对6种氮源的偏好表现为：酵母膏 ＞ 硝酸铵 ＞ 硝酸钾 ＞ 牛肉膏 = 蛋白胨 ＞ 尿素。

2.3.3 不同pH对菌株HC-1菌丝生长的影响

菌株HC-1菌丝在不同pH培养基中生长存在明显差异(图5和表4)。结合菌丝的生长速度和长势进行分析，其中，菌株HC-1的菌丝在pH7.0的培养基中生长最佳，菌丝生长速率为0.60 cm·d^-1；之后是pH8.0，菌丝生长速率为0.50 cm·d^-1；在pH4.0中菌丝生长最差，菌丝生长速率为0.32 cm·d^-1。因此，菌株HC-1的菌丝培养最适pH为7.0。菌株HC-1菌丝对6种pH的偏好表现为：pH 7.0 > pH 8.0 > pH 9.0 > pH6.0> pH 5.0 > pH 4.0。

2.3.4 不同温度对菌株HC-1菌丝生长的影响

通过对菌株HC-1的温度试验，发现菌株HC-1菌丝生长的温度广泛，在不同温度下菌丝生长存在显著性差异(图6和表5)。菌丝在温度为25 ℃时生长最好，其次为20 ℃，在温度为15 ℃的培养条件下生长最为缓慢。菌丝生长速率分别为0.64 cm·d^-1、0.56 cm·d^-1和0.19 cm·d^-1。因此，菌株HC-1的菌丝培养最适温度为25 ℃。菌株HC-1菌丝对5种温度的偏好表现为：25 ℃ > 20 ℃ > 30 ℃ > 18 ℃ > 15 ℃。

2.3.5 不同无机盐对菌株HC-1菌丝生长的影响

不同无机盐培养基中菌株HC-1菌丝的生长存在明显差异(图7和表6)。结合菌丝的生长速度和长势进行分析，菌株HC-1的菌丝在以硫酸镁为无机盐的培养基中生长最佳，菌丝生长速率为0.58 cm·d^-1；其次是磷酸二氢钾，菌丝生长速率为0.53 cm·d^-1；在氯化钠中生长最差，菌丝生长速率为0.36 cm·d^-1。因此，菌株HC-1的菌丝生长最适无机盐为硫酸镁。菌株HC-1菌丝对5种无机盐的偏好表现为：硫酸镁 ＞ 磷酸二氢钾 ＞ 磷酸氢二钾 ＞ 氯化钙 ＞ 氯化钠。

2.3.6 不同生长因子对菌株HC-1菌丝生长的影响

不同生长因子培养基中菌株HC-1菌丝的生长情况见图8和表7。菌株HC-1菌丝在6种生长因子中都能生长，其中维生素C中长势最好，其次是赖氨酸，在吲哚乙酸中生长最为缓慢。菌丝生长速率分别为0.49 cm·d^-1、0.43 cm·d^-1和0.30 cm·d^-1。因此，菌株HC-1的菌丝最佳生长因子为维生素C。菌株HC-1对6种生长因子的偏好表现为：维生素C ＞ 赖氨酸 ＞ 烟酸 = 维生素B₁ ＞ 尿嘌呤 ＞ 吲哚乙酸。

2.4 正交试验结果

因试验未考虑各因素间相互作用的结果，因此以最佳碳源、氮源、pH、无机盐进行4因素3水平的正交试验，结果详见图9和表8。各因素的极差R分别是0.23，0.17，0.18和0.01。因此，对正交试验结果进行方差分析，4因素的显著性差异大小排序为：碳源 > pH > 氮源 > 无机盐。碳源为蔗糖时，均值大小依次为X₂，X₃，X₁；氮源为酵母膏时，均值大小依次为X₁，X₂，X₃；pH的均值大小依次为X₃，X₁，X₂；无机盐为硫酸镁时，均值大小依次为X₁，X₂，X₃。综合上述结果以及菌丝长势和生长速度，可得出最优组合为A2B1C3D1，即菌株HC-1菌丝生长的最适配方组合为蔗糖25.0 g·L^-1，酵母膏3.0 g·L^-1，pH为7.0，硫酸镁2.0 g·L^-1。

3 结论和讨论

对采自西藏农牧学院校园内的1株野生食用菌，编号为HC-1，通过形态学及系统发育分析，确定该菌株为金毛鳞伞(P. aurivella)。通过单因素试验研究了不同碳源、氮源、温度、pH、无机盐和生长因子对菌株HC-1菌丝生长的影响。结果表明菌株HC-1菌丝生长的最适碳源为蔗糖，最适氮源为酵母膏，最适温度为25℃，最适pH为7.0，最适无机盐为硫酸镁，最适生长因子为维生素C。正交试验表明菌株HC-1菌丝生长的最佳组合为：蔗糖25.0 g·L^-1，酵母膏3.0 g·L^-1，pH为7.0，硫酸镁2.0 g·L^-1。

本研究中最适单因素试验表明各个供试碳源均可被菌株HC-1利用，最适碳源为蔗糖，与杨雪等研究的金毛鳞伞最适碳源一致^[17]。蔗糖是一种双糖，具有多种生理活性，其分子量小、结构简单、溶解性好，能够促进菌株生长和代谢活动，并促使菌体在短时间内快速发展^[26,27]。最适氮源为酵母膏，且本研究供试的有机氮源还含有维生素等一些有益菌丝生长。酵母膏是一种有机氮，含有微量元素、核苷酸、维生素等多种非氮成分，能够被菌丝吸收，从而促进菌丝的生长^[26,28]。在pH 7.0 ~ 9.0条件下菌丝长势较好，但pH为7.0时菌丝长速略高于pH 8.0和pH 9.0，pH 4.0酸性条件下菌丝几乎不生长，最适pH为7.0，研究表明多数鳞伞属真菌更适宜在偏碱性环境中生长。金毛鳞伞菌丝在15 ℃ ~ 30 ℃下都能生长，最适温度为25 ℃，20 ℃和25 ℃有较快的生长速率，15 ℃生长最为缓慢，研究表明与该属中近亲种柠檬鳞伞温度试验研究结果一致^[28]。由于该菌主要分布在北温带地区，应属于典型的温带种类，结合采集野生子实体标本林芝地区年平均气温，该菌应为中温型真菌^[29-31]。最适无机盐为硫酸镁，与刘琳研究的结果不同，原因可能是因为本试验未添加以氯化钾为无机盐的试验组。硫酸镁中的镁被菌体吸收利用后，其残留物硫酸根的生理酸性可中和碱性，调节pH，给食用菌创造良好的生长环境。最适生长因子为维生素C，与刘琳研究的多脂鳞伞一致。维生素C能提供微量营养物质，增强食用菌子实体的抗氧化能力。金毛鳞伞的高价值决定了其培养价值，本试验单因素试验及正交试验证明其在试验室环境生长的可能性，但20 ℃ ~ 25 ℃之间应有一个更准确的温度适宜生长；同理菌丝最适生长温度和产孢最适温度有待探究。试验室条件未对光照条件过多设置，是否不同光照调节更适合金毛鳞伞培育有待研究。其他影响因子亦需要更多探索。

药用真菌的医疗和保健作用在近年来得到世界各国的重视^[32]。金毛鳞伞为木腐菌，是鳞伞属中一种较为珍贵的食药用真菌，比较容易人工栽培^[33]。目前还没有对该菌种进行进一步推广，因此，对金毛鳞伞生物学特性进行研究，试验结果可为金毛鳞伞后续人工训话栽培奠定基础，为保护该野生菌资源和开发利用提供理论依据，能更好地挖掘金毛鳞伞的潜在价值。

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基金资助

“新农科”高原植物生产类专业提升实践创新能力平台建设(藏财政预指2023-1号)