西藏岗巴青稞叶际拮抗微生物的分离、筛选及其对青稞幼苗生长的影响

Isolation and Screening of Antagonism Microbial in the Phyllospheric of Highland Barley from Gangba, Xizang and Their Effects on the Growth of Highland Barley Seeding

摘要

为了获得具有生防潜力的菌株，减少化学农药的使用，从西藏自治区日喀则市岗巴县采集健康的青稞叶片，分离纯化得到叶际可培养附生菌和内生菌，对获得的菌株采用平板对峙法进行对小麦赤霉病（Fusarium graminearum）、青稞穗腐病（Fusarium avenaceum）、小麦立枯病（Gaeumannomyces graminis）3种病原菌的拮抗活性测定，同时筛选具有固氮、溶无机磷、溶钾特性的促生菌，构建复合菌群，验证复合菌群对青稞幼苗生长的影响。结果显示，岗巴县青稞叶际可培养附生菌和内生菌丰富，共分离得到158株附生菌，42株内生菌，优势菌群为厚壁菌门的芽孢杆菌属，对3种病原菌抑菌率均在40%以上的附生细菌10株，内生细菌6株，促生特性试验结果显示得到，附生菌中的固氮菌、溶磷菌、溶钾菌分别为3株、3株、4株，内生菌中的固氮菌、溶磷菌、溶钾菌分别为6株、4株、2株，由菌株GN-C-7、GF-T-8 、GN-T-7 3株拮抗促生菌构建的复合菌群对青稞幼苗有显著的促生作用，经16S rRNA基因序列鉴定：GN-T-7为Agrobacterium rhizogenes，GN-C-7、GF-T-8均为Bacillus altitudinis。

Abstract

In order to obtain strains with biocontrol potential and reduce the use of chemical pesticides, healthy highland barley leaves were collected from Gangba County, Rikaze City, Xizang Autonomous Region, and the phyllosphere could be cultured epiphytic bacteria and endophytes were isolated and purified. The antagonistic activity of the obtained strains against wheat scab (G. zeae), wheat blight (F. aven) and barley ear rot (F. aven) was determined by the plate confrontation method. At the same time, the growth promoting bacteria with the characteristics of nitrogen fixed, inorganic phosphorus soluble and potassium soluble were screened, and the composite flora was constructed to verify the effects of the composite flora on the growth of highland barley seedlings. The results showed that there were plenty of epiphytes and endophytes cultured in the highland barley of Gangba County. A total of 158 epiphytes and 42 endophytes were isolated, and the dominant bacteria group was Bacillus firmicutes. 10 epiphytes and 6 endophytes had inhibition rates of more than 40% against the three pathogens. Among the epiphytes, there were 3 strains of nitrogen fixation bacteria, 3 strains of phosphorus solubilizing bacteria and 4 strains of potassium solubilizing bacteria; among the endophytes, there were 6 strains of nitrogen fixation bacteria, 4 strains of phosphorus solubilizing bacteria and 2 strains of potassium solubilizing bacteria, respectively. The compound bacteria group constructed by the strains GN-C-7, GF-T-8 and GN-T-7 had significant growth promotion effect on the barley seedlings. GN-T-7 was identified as Agrobacteriumrhizogenes and GN-C-7 and GF-T-8 were identified as Bacillus altitudinis by 16S rRNA sequence.

Graphical abstract

关键词

青稞 / 叶际微生物 / 拮抗菌 / 促生特性 / 复合菌群

Key words

Highland barley / Phyllosphere / Antagonistic Bacteria / Growth-promoting properties / Complex flora

青稞是青藏高原最为重要的粮食作物，对西藏经济发展和人民生活至关重要。但因西藏地处高寒地区，生态环境脆弱，土壤肥力低下，长期连作使青稞产量严重减产。当前，为提高青稞产量而大量使用化肥农药，造成严重的环境污染与土壤板结等一系列问题^[1-3]。生物防治因其对环境污染小、效果持久而受到广泛关注^[4]。目前关于青稞叶际微生物生物防治方面的研究报道较少。

与根际一样，叶际（陆地植物的地上部分）是植物的一个重要生态位。叶际居住着各种各样的微生物，一些微生物以附生的形式生活在植物表面，称为附生菌，另一些则在组织内定居，作为内生菌^[5]。这些微生物形成了与叶际生境相关的微生物群落。叶际微生物可以通过拮抗作用直接抑制病原菌，为植物提供营养，调节植物生长，维护植物健康^[6]。Diogo Mina等^[7]的研究表明，从橄榄树叶际分离的解淀粉芽孢杆菌P41抑制橄榄结（OK）病原菌的生长。Pudong Li等^[8]从柑橘叶片得到的微生物抑制柑橘间座壳菌（Diporthere citri）的生长。

植物种类不同，其叶际拮抗菌也不同。郑智胜^[9]在对古茶树的研究中得到，门水平的变形菌(Proteobacteria)、酸杆菌(Acidobacteriota)、放线菌(Actinobacteriota)、子囊菌(Ascomycota)和担子菌(Basidiomycota)为优势菌；优势属为甲基杆菌(Methylobacterium-Methylorubrum)、鞘氨醇单胞菌(Sphingomonas)、假单胞菌(Pseudomonas)、氨杆菌(Amnibacterium)、芽胞杆菌(Bacillus)、枝胞菌(Cladosporium) 。吴小军^[10]采用高通量测序技术研究烟叶微生物多样性结果表明，健康烟叶叶际细菌主要分布于厚壁菌门（Firmicutes）、放线菌门（Actinobacteria）和变形菌门（Proteobacteria）。在属水平上，细菌属为假单胞菌属（Pseudomonas）、甲基杆菌属（Methylobacterium）、寡养单胞菌属（Stenotrophomonas）、鞘氨醇单胞菌属（Sphingomonas）、泛菌属（Pantoea）等。不同叶际微生物的促生特性也不同，如幸翀^[11]从茄子叶际分离的1株克雷伯氏菌(Klebsiella sp.)为固氮菌，为叶际固氮菌肥提供微生物资源。潘明凯^[12]从柑橘叶际中分离出的肠杆菌Klebsiella和Pantoea菌株菌具有溶无机磷、溶钾的功能。微生物之间的相互作用对群落的稳健性和功能有相当大的影响，复合菌群就是利用微生物之间的相互作用建立群落。目前，在叶际微生物的拮抗复合菌群方面已有一定的研究成果。例如，Liu等^[13]人利用筛选到的拮抗菌群来防治烟草黑胫病，田间防效达到50%以上。Qin等^[14]人在烟草叶片上喷洒生防菌剂可以极大地改变叶面微生物群落，能够有效抑制烟草野火病的发生。

为挖掘更多青稞叶际拮抗促生菌，本研究从西藏日喀则岗巴县采集健康青稞叶片，分离得到可培养附生菌和内生菌，筛选拮抗菌株，测定促生特性，构建复合菌群，并进行盆栽实验验证及16S rDNA 基因分子生物学鉴定，以期为叶际有益菌提供新的菌种资源。

1 材料与方法

1.1 材料

青稞叶片样本于2023年夏季在西藏自治区日喀则市岗巴县（E.88º 25´57ʺ，N.28 º14´52ʺ）采集。选择健康的青稞叶片，采用五点取样法，用消毒的剪刀剪下叶片，然后用无菌镊子装入无菌采样袋中，编号，保存于4 ℃冰箱中，送至实验室进行分离。

小麦赤霉病（F. gram）、小麦立枯病（G. gram）、青稞穗腐病（F. aven）病原菌由西藏农牧学院植物科学学院病理试验室提供。

分离所用培养基^[15]：MYX培养基成分为谷氨酸二钠5 g，酵母提取物1 g，七水合硫酸镁1 g，葡萄糖2 g，琼脂20 g，蒸馏水定容至1 000 mL，pH 7.0；R2A培养基成分为酵母0.5 g，酪蛋白酸水解物0.5 g，可溶性淀粉0.5 g，七水合硫酸镁0.05 g，琼脂15 g，蒸馏水定容至1 000 mL，pH 7.2；TSA培养基成分为胰蛋白胨0.25 g，蛋白胨0.25 g，葡萄糖0.5 g，丙酮酸钠0.3 g，磷酸氢二钾0.3 g，蒸馏水定容1 000 mL，pH 7.2；；CMA培养基成分为玉米淀粉2 g，琼脂20 g，pH 7.2，蒸馏水定容至1 000 mL；NA培养基成分为 牛肉膏3 g，蛋白胨10 g，氯化钠5 g，琼脂18 g，蒸馏水定容至1 000 mL，pH 7.2；LB固体培养基成分为酵母提取物5 g、胰蛋白胨10 g、氯化钠10 g，琼脂18 g，蒸馏水定容至1 000 mL，pH 7.0。

平板对峙所用培养基^[16]：PDA培养基成分为马铃薯200 g、葡萄糖20 g、琼脂18 g，蒸馏水定容至为1 000 mL。

促生特性测定所用培养基：阿须贝氏培养基^[17]成分为磷酸二氢钾0.2 g、硫酸镁0.2 g、氯化钠0.2 g、碳酸钙5 g、甘露醇10 g、硫酸钙0.1 g、蒸馏水定容至1 000 mL，pH 6.8~7.0；PKO^[18]培养基成分为葡萄糖10 g、磷酸三钙5 g、硫酸铵0.5 g、氯化钠0.2 g、氯化钾0.2 g、硫酸亚铁0.03 g、七水硫酸镁0.03 g、硫酸锰0.03 g、酵母浸膏20 g、琼脂20 g，pH 6.8~7.0；亚力山德罗夫培养基^[19]成分为蔗糖5 g、七水硫酸镁0.5 g、磷酸氢二钠2 g、碳酸钙0.1 g、氯化铁0.05 g、钾长石粉1 g、琼脂18 g，蒸馏水定容至1 000 mL。

1.2 方法

1.2.1 收集附生微生物

首先将叶片（每个样本重复）转移到250 mL锥形烧瓶中，该烧瓶含有200 mL 0.01 M无菌磷酸盐缓冲盐水（PBS，4 °C），然后进行超声处理（15 min）和振荡（1 h，200 r/m，）将附生微生物从叶片表面转移到洗涤溶液中^[8]。

1.2.2 收集内生微生物

用消毒镊子取出经过使用上述程序洗涤的叶片样品，通过在75%乙醇中连续浸泡1 min、分别用1%次氯酸钠中浸泡3 min和75%乙醇浸泡30 s进行表面消毒，然后用无菌水冲洗3次。随后，在无菌操作台中用无菌镊子取出叶片，再将叶片用灭菌研磨机研磨^[8]。

1.2.3 拮抗细菌的分离及纯化

1.2.3.1 附生细菌的分离及纯化

将洗涤得到的富集附生微生物的PBS缓冲液稀释至10^-2、10^-3、10^-4、10^-5倍后，分别取不同稀释倍数的缓冲液100 μL 均匀涂布于培养基平板（MYX、R2A、TSA、CMA、NA、LB），每个梯度设3个重复，每种培养基3个重复，28 ℃培养，2 d - 3 d后，统计形态不同的细菌菌落数，采用三区划线法纯化细菌，纯化的菌株挑入LB固体斜面中培养24 h，然后置于4 ℃的冰箱保存备用^[8]。

1.2.3.2 内生细菌的分离及纯化

将去除附生微生物的青稞叶片研磨稀释至10^-1、10^-2、10^-3、10^-4分别吸取100 μL 汁液均匀涂布于培养基平板（培养基同附生细菌的分离），每个梯度设3个重复，每种培养基3个重复，于28 ℃培养箱内培养2 d - 3 d后，统计形态不同的细菌菌落数，采用三区划线法纯化细菌，纯化菌株挑入LB斜面中培养24 h，然后置于4 ℃冰箱保存备用^[8]。

1.2.4 拮抗菌株的筛选及其系统发育树分析

纯化菌株初筛采用平板对峙法^[20]测定其对青稞穗腐病（F. aven）、小麦赤霉病（G. zeae）、小麦立枯病（R. solani）3种病原菌的拮抗特性。将这3种病原菌置于PDA平板上于25 ℃的恒温培养箱活化培养，在菌落边缘取直径5 mm的菌饼置于PDA平板中心，在距离中心点3 cm处的四边挑取少量细菌菌液划线，以不接种细菌，只分别接种3种不同病原菌的平板为对照，置于28 ℃恒温培养箱中3 d - 7 d观察每种病原菌的生长情况，选取具有抑制效果的细菌进行复筛，方法同上，然后测定其抑菌带大小，计算抑制率。抑制率=（对照组菌落直径-处理组菌落直径）/对照组菌落直径 × 100%。

拮抗菌株进行16S rRNA 基因测序，经Nucletide BLAST比对分析挑选与复筛拮抗菌株有较近亲缘关系的菌株，用Mega11软件采用邻接法构建系统发育进化树，Bootstrap 重复 1 000次检验置信度^[21]。

1.2.5 青稞叶际微生物促生特性的测定

固氮特性测定^[22]：将分离纯化菌株在阿须贝氏培养基上划线，28 ℃恒温培养培养3 d，连续5次传代后的菌株如能继续生长则表示有固氮能力。

溶无机磷特性测定^[23]：将分离纯化菌株分别点接到PKO 培养基上28 ℃恒温培养5 d后，观察有无溶磷圈产生，如有溶磷圈产生则表示有溶磷特性。

溶钾特性测定^[24]：将分离纯化菌株分别点接到亚力山德罗夫培养基上，于28 ℃恒温培养5 d后观察是否产生黄色晕圈，如有黄色晕圈则表示有溶钾特性。

1.2.6 拮抗促生菌复合菌群的构建

根据菌株拮抗反应测定结果，选择互不拮抗的菌株，用新鲜LB培养液调整菌液OD₆₀₀ = 1.0 ± 0.05。按相同体积比混匀后，再按照4%的总接种量接种混合菌液至LB培养液中，28 ℃，150 r/min下恒温培养48 h，即为复合菌群^[25]。

1.2.7 拮抗促生复合菌群盆栽促生试验

将筛选的拮抗菌株用无菌接种环接到装有液体LB培养基的250 mL的三角瓶中，于28 ℃、220 r/min摇床培养24 h，再将培养菌液于8 000 r/min离心10 min，用pH 7.0的PBS缓冲液洗涤沉淀3次，再加入PBS缓冲液悬浮菌体获得菌悬液，将其浓度调至1 CFU/mL × 10⁸ CFU/mL。

挑选健康饱满的青稞种子，用75%的酒精表面消毒3 min，再用无菌水冲洗3 次。然后将种子置于装有无菌吸水纸的无菌培养皿内催芽。待发芽后，每个栽土壤采自西藏农牧学院农场，有机质、全磷和全氮含量分别为20.77、0.85 和 0.34 g/kg。种植后每5天进行一次菌悬液浇灌。待出苗后10 d每个处理选择10株幼苗测量根长、株高、鲜重、干重。先将幼苗根部土壤轻轻抖落，再用清水将根部残留土壤轻轻洗净，然后用吸水纸吸干幼苗根部水分，称其鲜重，测量根长、茎长，最后将幼苗置于65 ℃烘箱中30 min，称其干重^[26]。

2 结果与分析

2.1 青稞叶际微生物分离纯化

从西藏自治区日喀则市岗巴县（E.88º25´57ʺ，N.28º14´52ʺ）采集健康的青稞叶片，分离纯化出叶际细菌388株，其中附生细菌334株，内生细菌78株。

2.2 拮抗菌株筛选

采用平板对峙法，以3种病原菌：小麦赤霉病（F. gram）、小麦立枯病（G. gram）、青稞穗腐病（F. aven）进行拮抗试验，得到对这3种病原菌均具有较好抑制作用的附生细菌10株，内生细菌6株。

附生细菌中对小麦赤霉病抑制率高于60%的有1株，占总数的10.00%，菌株GF-R-10的抑菌率最高，达60.35%；抑菌率在50% ~ 60%的有7株，株数最多，占总数的70.00%；抑菌率低于50%的有2株，占总数的20.00%，对小麦赤霉病抑菌率最低的菌株是GF-R-8（表1）。对小麦立枯病抑制率最高的是GF-T-8，抑菌率达66.13%，其次是GF-R-6，抑制率为60.70%；抑菌率在在50% ~ 60%的有5株，占总株数的50%；抑菌率低于50%的菌株抑制效果强弱顺序是GF-R-8 > GF-L-10 > GF-C-6（表1）。对青稞穗腐病抑菌率在50% ~ 60%的有7株；抑菌率低于50%的是菌株GF-T-8、GF-R-8、GF-L-10（表1）。对3种病原菌抑制率均高于50%的菌株是GF-I-2、GF-T-7、GF-R-10、GF-L-11、GF-T-10（表1）。

内生细菌对小麦赤霉病的抑制效果强弱顺序是GN-T-9 > GN-T-7 > GN-T-5 > GN-R-4 > GN-P-1 > GN-C-7，抑制率最高达56.64%。对小麦立枯病的抑菌率最高的菌株是GN-T-5，抑制率为51.98%（表1）。对青稞穗腐病抑菌率最高的是GN-T-7，达65.34%（表1）。

2.3 拮抗菌分子鉴定及多样性分析

附生细菌分别属于厚壁菌门和变形菌门的芽孢杆菌属Bacillus sp.、土壤杆菌属Agrobacterium sp.、普罗威登斯菌属ProvidenciaEwing sp.、假单胞菌属Pseudomonas sp.。其中以芽孢杆菌属为主，共7株，占拮抗菌株的70%，土壤杆菌属、普罗威登斯菌属、假单菌属各1株。内生细菌分别属于厚壁菌门和变形菌门的芽孢杆菌属Bacillus sp.、沙雷氏菌属Serratia sp.、土壤杆菌属Agrobacterium sp.。其中芽孢杆菌属Bacillus sp.最多，共4株，占拮抗内生细菌的66.67%，土壤杆菌属和沙雷氏菌属各1株。虽然筛选出的可培养内生细菌和附生细菌有所差异，但芽孢杆菌属、土壤杆菌属为共有属（图1）。

2.4 拮抗菌促生特性测定

2.4.1 菌株固氮能力测定

将10株附生菌和6株内生菌分别在阿须贝培养基上划线培养，结果表明3株附生拮抗菌具有固氮效果，6株内生拮抗菌全部有固氮效果（表2）。

2.4.2 菌株溶磷能力测定

将10株附生细菌和8株内生细菌逐一点接于无机磷培养基中心培养，逐一检测其溶无机磷的能力。结果表明3株附生拮抗菌有溶无机磷效果，4株内生拮抗菌有溶无机磷效果（表2）。

2.4.3 溶钾能力测定

将10株附生细菌和6株内生细菌分别点接在溶钾培养基中心培养，结果表明附生拮抗菌仅有4株具有溶钾能力，内生拮抗菌有2株具有溶钾能力（表2）。

同时有固氮、溶无机磷2种促生能力的菌株有GF-T-8、GF-R-6、GN-R-4、GN-T-5、GN-T-7、GN-T-9；有固氮、溶钾2种促生能力的菌株有GF-T-8、GF-R-6、GN-T-7、GN-T-9；有溶无机磷、溶钾2种促生能力的菌株有GF-T-8、GF-R-6、GN-T-7、GN-T-9；有固氮、溶无机磷、溶钾3种促生能力的菌株有GF-T-8、GF-R-6、GN-T-7、GN-T-9。

2.5 拮抗促生菌系统发育分析

通过拮抗试验和促生特性综合得到3株效果较好的菌株进行系统发育分析。经系统发育树分析，GN-T-7菌株与Agrobacterium rhizogenes聚为一支，故将菌株GN-T-7初步鉴定为发根农杆菌Agrobacterium rhizogenes。GF-T-8和GN-C-7菌株与Bacillus altitudinis聚为一支，故将这两株菌初步鉴定为高地芽孢杆菌Bacillus altitudinis（图2）。

2.6 拮抗促生复合菌群的盆栽促生实验

将3株拮抗促生效果较好的菌株构建的复合菌群进行盆栽促生试验，经复合菌群的菌悬液处理后，所有处理组的青稞幼苗根长、茎长、干重和鲜重均较2组对照组显著增加（P < 0.05）（表3）。处理组Z23的根长、茎长最长，分别为186.20 mm、114.20 mm，鲜重和干重也最重，分别为0.50 g、0.158 g，均显著高于对照（P < 0.05）；处理组Z35D的根长、茎长最短，鲜重和干重也最小，分别为144.17 g、100.58 g、0.47 g、0.100 g，均显著高于对照组（P < 0.05）；处理组Z24和Z30相比，Z30的根长、茎长、鲜重均高于Z30，但鲜重小于Z30（表3）。

3 结论与讨论

不同植物的叶际微生物种类不同，优势菌也不同，同一植物的叶际附生微生物和内生内生微生物也存在着差异。孙美丽等^[27]从健康的烟草叶片中分离出的细菌主要为变形菌门（Proteobacteria）、放线菌门（Actinobacteria）、厚壁菌门（Firmicutes）等。本研究从西藏日喀则岗巴县健康的青稞叶片中分离得到的可培养优势菌门为厚壁菌门，其次是变形菌门，且同一样品中分离得到的可培养附生菌和内生菌也存在差异，可能和两者生活的环境不同，附生菌附着在叶片表面，面临的生存环境更为恶劣。

叶际细菌可以通过抗菌、竞争空间和养分、诱导植物防御机制等来阻止植物病原体的生长^[28]。本研究显示发根农杆菌菌株GN-T-7和高地芽孢杆菌菌株GN-C-7、GF-T-8对小麦赤霉病、小麦立枯病、青稞穗腐病3种病原菌均具有较好抑制效果。发根农杆菌主要通过产生次生代谢物质而对病原菌产生抑制作用，廖小兰^[29]的研究利用发根农杆菌抑制柑橘黄龙病，筛选黄龙病病原抑制剂。对芽孢杆菌属的拮抗效果的研究一直是研究热点，卫甜等^[30]从前期研究中分离出的高地芽孢杆菌及对水稻稻瘟病有良好的抑制效果。

本研究结果显示西藏青稞叶际附生菌和内生中有多种促生功能的菌株，高地芽孢杆菌菌株GN-C-7具有固氮的特性，GF-T-8兼具固氮、溶磷、溶钾多种促生功能。发根农杆菌GN-T-7也具固氮、溶磷、溶钾特性。张文韬等^[31]从野生大豆根瘤内分离出高地芽孢杆菌菌株Y1具有解有机磷和产IAA等促生能力，将菌剂接种到大豆幼苗后观察其促生能力，结果显示，接种该菌株可显著增加大豆的株高和根长，这与本研究结果一致。Schmülling T等^[32]的研究发根农杆菌可以固氮等促生能力，还可从而对花椰菜有促生能力。

微生物之间的相互作用对群落的稳健性和功能有相当大的影响，复合菌群就是利用微生物之间的相互作用建立群落^[33]。本研究构建的4组复合菌群与2组对照组相比，青稞幼苗的根长、茎长、鲜重、干重等均有显著差异。目前，在叶际微生物的拮抗复合菌群方面已有一定的研究成果。例如，陈晓琳^[34]的研究表明合成菌群对油茶炭疽病的防效明显高于单一菌株。

本研究所筛选的3株拮抗菌对小麦赤霉病、小麦立枯病、青稞穗腐病3种病原菌有较好的抑制效果，同时兼具多种促生特性，由这3株菌构建的4组复合菌群均对青稞幼苗有显著促生效果，表明这3株菌具有潜在的开发利用价值。

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基金资助

西藏农牧学院研究生创新项目(YJS2023-43)

国家自然科学基金(31960002)