基于非靶向代谢组学分析两种混合青稞麸皮差异代谢物

Analysis of Differential Metabolites in Two Types of Mixed Barley Bran Based on Non-Targeted Metabolomics

摘要

本研究旨在通过非靶向代谢组学分析两种混合青稞麸皮的差异代谢物。采用非靶向代谢组学研究方法，通过主成分分析（principal component analysis，PCA）和聚类分析等统计学方法对两种混合青稞麸皮进行差异分析。结果表明：两种混合青稞麸皮共检测出21类共6 435种代谢物，共筛选出549种差异显著代谢物，占总代谢物的8.53%，其中上调280个，下调269个；通过对差异代谢物富集的代谢途径分析，发现两种混合青稞麸皮中的差异代谢物主要存在于亚油酸途径，甘氨酸、丝氨酸和苏氨酸代谢途径，抗坏血酸和阿糖二酸代谢途径，甘油磷脂代谢途径及类黄酮生物合成途径。该研究确定了两种混合青稞麸皮的差异代谢物，为进一步研究其营养成分和功能活性成分提供重要参考。

Abstract

The aim of this study is to analyze the differential metabolites of two mixed barley bran using non-targeted metabolomics. Using non-targeted metabolomics research methods, statistical methods such as principal component analysis (PCA) and cluster analysis were used to analyze the differences between two types of mixed barley bran. The results showed that 21 categories of 6435 metabolites were detected in the two mixed barley bran samples, and a total of 549 significantly different metabolites were screened out, accounting for 8.53% of the total metabolites. Among them, 280 were upregulated and 269 were downregulated; Through the analysis of metabolic pathways enriched with differential metabolites, it was found that the differential metabolites in the two mixed barley bran mainly existed in the linoleic acid pathway, glycine, serine, and threonine metabolism pathways, ascorbic acid and arabinose metabolism pathways, glycerophospholipid metabolism pathway, and flavonoid biosynthesis pathway. This study identified the differential metabolites of two mixed barley bran, providing important references for further research on their nutritional and functional active ingredients.

Graphical abstract

关键词

青稞麸皮 / 非靶向代谢组学 / 差异代谢物

Key words

Highland barley bran / Non-targeted metabolomics / Differential metabolites

青稞（Hordeum vulgare L.）是属于禾本科、大麦属的植物^[1]。它是青藏高原地区的一种特色农作物，占据了该地区粮食作物面积的60%以上，同时也是藏民的主要粮食来源之一^[2,3]。

传统上，青稞采用全谷加工，而在现代加工工艺中，青稞麸皮成了副产物，多用作牲畜饲料，由于利用率低，通常被人们忽视其潜在的价值。而青稞麸皮中的营养物质，特别是含量丰富的膳食纤维和β-葡聚糖都没有得到有效的开发利用^[4]。青稞麸皮还含有大量抗氧化活性的酚类化合物，能有效预防高血脂、高血糖、心脑血管等疾病^[5,6]。

代谢组学是一门研究生物体在特定生理或病理状态下的代谢物质组成和变化的科学领域。它通过鉴定和定量分析生物体内的小分子代谢产物，如氨基酸、有机酸、糖类和脂类等，来揭示生物体代谢网络的状态和调控机制^[7-10]。非靶向代谢组学是一种全面的代谢组学方法，它不仅仅关注特定代谢物或代谢通路，还通过全面分析生物体内的代谢产物，探索全部的代谢变化^[10]，已被广泛应用到食品研究中^[11-13]。

目前关于青稞麸皮的研究主要集中在营养成分分析^[14]、结构与功能特性探究^[15]、功能因子挖掘^[16]和活性成分提取^[17]等方面，而采用非靶向代谢组学方法分析不同品种青稞麸皮差异代谢的研究尚未见报道。因此，本研究以青稞麸皮为原料，采用液相色谱-质谱联用技术，结合多变量统计分析方法，筛选两种混合青稞麸皮样品之间的主要差异代谢物，为其营养成分和功能活性成分的进一步研究提供理论数据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

供试样品青稞采自于西藏雪域资源股份有限公司的两种青稞加工脱皮的混合青稞麸皮，FA为藏青320和藏青25的混合麸皮，FB为藏青2000和喜马拉雅19的混合麸皮。

甲醇、甲酸、乙腈：美国赛默飞世尔科技公司；琥珀酸-d4（混合内标）：美国西格玛公司；L-2-氯苯丙氨酸（混合内标）：上海恒创生物；L-缬氨酸-d8（混合内标）：上海皓元生物；胆酸-D4（混合内标）：上海湲叶生物；以上试剂均为色谱纯。

1.2 仪器与设备

FA2104B电子天平：上海越平科学仪器有限公司；Wonbio-E全自动样品快速研磨仪：上海万柏生物科技有限公司；TGL-16MS台式高速冷冻离心机：上海卢湘仪离心机仪器有限公司；Waters ACQUITY UPLC I-Class plus/Thermo QE HF液相色谱-质谱联用仪：美国赛默飞世尔科技有限公司；ACQUITY UPLC HSS T3（100 mm × 2.1 mm,1.8 um）液相色谱柱：美国沃特世公司。

1.3 实验方法

称取30 mg样本到1.5 mL离心管中，加入600 μL甲醇-水（V:V=7:3，含混合内标，4 μg/mL）和两颗小钢珠；在-40 ℃条件下预冷2 min，然后放入研磨机（60 Hz）中研磨2 min；冰水浴中超声提取30 min，静置过夜（-40 ℃）；12 000 rpm，4 ℃低温离心10 min，吸取150 μL的上清液，用0.22 μm的针孔过滤器过滤，随后转至LC进样小瓶，进行LC-MS分析。同时质控（QC）样本为从每个样本取适量等体积样本混匀后样本。

液相色谱条件：ACQUITY UPLC HSS T3色谱柱（100 mm × 2.1 mm，1.8 um）；柱温：45 ℃；流动相：A-水（含0.1%甲酸），B-乙腈；洗脱梯度如表1；流速：0.35 mL/min；进样体积：2 μL。

质谱条件：电子喷雾离子源（ESI）；采用正负离子分开扫描采集样品质谱信号，具体采集模式为DDA（Data dependent acquisition ）数据依赖型扫描模式，质谱参数见表2。

1.4 数据分析

代谢组学处理软件Progenesis QI v3.0软件(Nonlinear Dynamics，Newcastle，UK)处理原始数据，在此基础上根据自建数据库与公共数据库对代谢物进行定性。化合物的鉴定使用LuMet-Plant本地数据库、The Human Metabolome Database（HMDB）、Lipidmaps（v2.3）和METLIN数据库进行鉴定分析。对鉴定的代谢产物进行主成分分析（PCA），根据变量重要性投影（Variable importanceinproject，VIP）筛选差异代谢物。

2 结果分析

2.1 不同青稞麸皮指纹图谱

为了获得青稞麸皮样本中更全面的信息，本研究采用LC-MS进行样品测定。通过图1和图2的总离子流图可以观察到两种不同混合青稞麸皮之间的代谢成分存在差异。然而，由于青稞麸皮的质谱图具有一定相似性且获取的信息有限，因此难以对所获取的代谢物进行全面的系统分析。为了进一步揭示不同品种麸皮间的差异，本研究运用了多变量数据分析方法对所采集的样本数据进行了详细全面的分析。这种方法能够综合考虑多个变量之间的关系，从而识别出代谢物之间的差异和相关性^[18]。通过对多个样品间的代谢物质谱数据进行统计分析和模式识别，可以揭示出不同品种青稞麸皮的潜在差异代谢物，以获得更准确、全面的青稞麸皮代谢物信息，为进一步的应用研究提供更可靠的基础数据。

2.2 不同品种青稞麸皮代谢组学差异分析

通过对样品（包括质控样品）进行PCA分析。如图3A所示，第一主成分（PC1）的贡献率为52.1%，第二主成分（PC2）的贡献率为6.75%，两组样本表现出显著的分离趋势。进一步对该模型进行了200次排列试验验证，根据200次打乱并建模后的Q²值和R²值可以得到它们的回归线， R² =0.957大于Q² =-0.315，并且Q²回归线与Y轴截距小于0，表明该模型没有“过拟合”，能准确地描述样本的信息（图3B）。

2.3 差异代谢物分类

对两种青稞麸皮进行分析，共鉴定出21类共6 435种代谢物。通过VIP ≥ 1，p < 0.05对两种青稞麸皮进行差异代谢物筛选，FB VS FA共筛选出549种差异显著代谢物（表3），占总代谢物的8.53%，其中上调280个，下调269个。其中包括脂类和类脂分子的种类最丰富有206种（约38%）；未分类物质有119种，占总数的22%；其次苯丙素类和聚酮类有72种，有机酸及其衍生物有50种，有机氧化合物有33种，有机杂环化合物有33种，苯环型化合物有23种，分别占总数的13%，9%，6%，6%，4%。

如表4所示，FB与FA相比上调幅度前10的差异代谢物中有7种脂类和类脂分子、2种苯丙素类和聚酮类、1种有机酸及其衍生物，其中FC值最大的代谢物是侧柏苷H，其在FB中的含量为FA的33.51倍；下调幅度前10的差异代谢物有7种脂类和类脂分子、1种有机氧化合物、1种有机杂环化合物、1种苯丙素类和聚酮类，其中下调FC最大的代谢物是半乳糖苷3-[半乳糖基-（1- > 4）-鼠李糖苷]。

2.4 差异代谢物KEGG富集分析

差异代谢物通路富集分析表明，两种青稞麸皮中鉴定出来的549种显著差异代谢物主要分布在20条代谢途径中（见图4）。差异代谢物富集程度最高的前5条通路分别是:亚油酸代谢；甘氨酸、丝氨酸和苏氨酸代谢；抗坏血酸和阿糖二酸代谢；甘油磷脂代谢；类黄酮生物合成。

3 结论

本研究采用LC-MS技术对两种青稞麸皮进行非靶向代谢组学检测，共检测出21类共6 435种代谢物。经过筛选，发现了549种差异显著的代谢物，占总代谢物的8.53%，说明两种混合青稞麸皮的代谢物存在差异。这些差异代谢物主要涉及脂质和类脂分子、有机酸及其衍生物、苯丙烷类和聚酮、有机氧化合物、有机杂环化合物以及苯环型化合物。其中，280个代谢物上调，269个代谢物下调。

通过对差异代谢物富集的代谢途径分析，研究发现两种混合青稞麸皮中的差异代谢物主要集中在亚油酸代谢途径，甘氨酸、丝氨酸和苏氨酸代谢途径，抗坏血酸和阿糖二酸代谢途径，甘油磷脂代谢途径以及类黄酮生物合成途径。

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基金资助

南京农业大学—西藏农牧学院联合项目(202106)

西藏农牧学院研究生教育创新计划项目(YJS2023-06)

西藏农牧学院学科建设项目(533323001)