根际促生菌对不同苗龄拟藿香叶绿绒蒿幼苗生长的影响

The Effect of Growth-promoting Rhizobacteria on the Different Seedling Ages of Meconopsis baileyi

摘要

人工培育条件下，拟藿香叶绿绒蒿实生苗生长缓慢。为提高拟藿香叶绿绒蒿生长速度，本研究从野生拟藿香叶绿绒蒿根际土壤中筛选出促生功能菌株，制备了混合菌液菌肥；并选取5个苗龄的拟藿香叶绿绒蒿盆栽幼苗，进行了菌肥追施试验，通过测量株高、根长、叶面积、叶绿素含量等4项指标，研究了混合菌液对不同苗龄拟藿香叶绿绒蒿的生长影响。结果表明：（1）株高指标上，根际促生菌对5个苗龄的拟藿香叶绿绒蒿幼苗都有促进作用，但效果不明显；（2）根长指标上，根际促生菌对9个月苗龄的拟藿香叶绿绒蒿幼苗促进作用极显著（P < 0.01，增加值38.94 mm），对4个月苗龄幼苗的促进作用显著（P < 0.05，增加值21.67 mm）；（3）叶面积指标上，根际促生菌对3个月苗龄幼苗叶面积的促进效果极显著（P < 0.01，增加值19.59 cm²），对8个月苗龄幼苗的促生作用显著（P < 0.05，增加值65.41 cm²）；（4）在叶绿素含量指标上，根际促生菌对8个月苗龄幼苗的促生作用显著（P < 0.05，增加值8.10 SPAD）。综合认为：试验范围内，根际促生菌有利于提高拟藿香叶绿绒蒿实生苗生长速度，能够促进其实生苗的生长，且8个月苗龄是最佳施用期。

Abstract

Under cultivation conditions, the growth of seedlings of Meconopsis baileyi is slow. In order to improve it’s growth rate, this study screened functional strains from the rhizosphere soil of M. baileyi in wild, and prepared a mixed liquid bacterial-fertilizer; 5 type seedlings of M. baileyi,which at different ages, were selected for bacterial-fertilizer experiment. By measuring four indicators, i.e. plant height, root length, leaf area, and chlorophyll content, the effect of growth-promoting rhizobacteria (PGPR) on the growth of M. baileyi seedlings at different ages was studied. The results showed that: (1) In plant height, PGPR had a promoting effect on 5 type seedlings of M. baileyi, but the effect was not significant; (2) In root length, PGPR had a highly significant promoting effect (P < 0.01, increase 38.94 mm) on 9-month-old seedlings of M. baileyi, and a significant promoting effect (P < 0.05, increase 21.67 mm) on 4-month-old seedlings; (3) In leaf area, PGPR had a highly significant promoting effect on 3-month-old seedlings (P < 0.01, increase 19.59 cm²), and a significant promoting effect on 8-month-old seedlings (P < 0.05, increase 65.41 cm²); (4) In chlorophyll content, PGPR had a significant promoting effect on 8-month-old seedlings (P < 0.05, increase 8.10 SPAD). Overall, it is believed that: in the scope of the experiment, PGPR can promote the growth of seedlings of M. baileyi, and the 8-month-old seedling is the best application period.

Graphical abstract

关键词

拟藿香叶绿绒蒿 / 苗龄 / 根际促生菌

Key words

Meconopsis baileyi / Seedling age / Plant growth-promoting rhizobacteria

植物根际促生菌（plant growth -promoting rhizobacteria, PGPR）是一类能在植物根部定殖并促进植物生长的细菌。它们可以促进植物的根系发育，增加其从土壤中吸收水分和养分的能力，通过提高植物的适应性、胁迫耐受性来帮助植物在非生物胁迫下茁壮成长^[1,2]，且土壤类型、植物种类及不同生长阶段对根际微生物的影响都存在很大差异^[3]。很多研究学者在不同植物中筛选出PGPR菌株，并发现施加PGPR能促进植物的生长，但大多数都集中在种子萌发时期，对于其他时期施菌的研究较少。

拟藿香叶绿绒蒿（Meconopsis baileyi）是著名的高山花卉，为罂粟科Papaveraceae绿绒蒿属的多年生一次开花植物，生长在3 400m ~ 4 100 m的高寒高海拔地区。由于其生境特殊，喜湿润、半遮荫环境，较耐寒，不喜炎热、干燥的环境，人工培育条件下，实生苗生长缓慢。因此，国内外相关研究多集中于分类学、群落生态学、生理生态适应性、分子生物学、药理活性等研究^[4]，对如何促进幼苗生长，保障其正常开花研究较少，且拟藿香叶绿绒蒿根际促生菌对幼苗的促生效果研究未见报道。

本研究先期从野生拟藿香叶绿绒蒿根际土壤中筛选出了促生功能菌株，并用混合菌液制备了菌肥；然后以6个不同苗龄的拟藿香叶绿绒蒿实生苗为研究对象，以根部灌施混合菌液菌肥方式，研究了根际促生菌对拟藿香叶绿绒蒿实生苗的生长影响，以期找出促进其生长的PGPR最适施用时期，为拟藿香叶绿绒蒿的人工栽培提供技术支持。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 菌肥

2023年7月23日，以100 m海拔差为一个梯度，在西藏自治区林芝市色季拉山3 400 ~ 4 100 m的海拔段进行拟藿香叶绿绒蒿根际土壤土样采集，共设置8个采样点（表1）。每个采样点设置2 m × 2 m的样方，在样方内的3个不同位置取样，深度10cm ~ 15 cm，将3个取样点的根际土进行充分混合后作为该采样点混合土样；将混合土样风干后过2 mm的筛网，除去较大的石块、杂草、根系、松针落叶等杂物，备用。

对获得的8个土样分别采用四分法留取土样，一部分于-80 ℃冷冻保存，用于根际土壤微生物多样性分析^[5]；另一部分于4 ℃保存，用于菌株筛选。然后，将4 ℃保存的8个土样再次混合，采用稀释涂布法分离得到79 株细菌，再以此为对象进行植物根际促生细菌的筛选，并制作促生菌液菌肥。

1.1.2 种子与幼苗

2021年9月在西藏林芝市色季拉山采集拟藿香叶绿绒蒿种子，在通风处晾干，装入牛皮纸袋，置于4 ℃冰箱保存。2023年7月开始，在人工气候箱环境中在不同时间进行播种育苗，于2024年3月，选取3个月苗龄、4个月苗龄、6个月苗龄、8个月苗龄及9个月苗龄5种类型的拟藿香叶绿绒蒿幼苗为研究对象，施加促生菌液菌肥，分析其影响。

1.2 试验方法

1.2.1 植物根际土壤样品前处理

在超净工作台中，将处理好的根际土壤样品均匀混合，称取10 g土样，倒入提前灭菌过的三角瓶中，并加入90 mL的无菌水，放入摇床，在30 ℃、180 r/min的条件下，振荡培养0.5 h，取出静置5 min，取上清液，按5个浓度梯度进行稀释，分别为10^-1、10^-2、10^-3、10^-4、10^-5，从中选取10^-3、10^-4、10^-5 共3个稀释梯度分别取100 μL土壤稀释液涂布于R2A平板上，重复3次，于16 ℃培养箱培养4 d - 7 d。

1.2.2 植物根际促生细菌的筛选

选择合适的稀释度平板，按照形态、大小、颜色，挑取形态各异的典型单个菌落^[6]，R2A^[7]培养基用于菌株的分离纯化；CAS^[8]培养基用于产铁载体能力的测定；PKO（Pikovaskaias）^[9]无机磷培养基和孟金娜^[10]有机磷培养基分别用于溶无机磷和溶有机磷能力测定；阿须贝（Ashby）^[11]培养基用于固氮菌的测定；解钾^[12]培养基用于解钾能力的测定；将菌株接入NB+L-色氨酸的液体培养基中，通过Salkowski比色法测定菌株产IAA的能力^[13]。

通过以上试验，从拟藿香叶绿绒蒿根际土壤中共分离获得47株功能菌株。其中，R1菌株同时具有解钾、溶有机磷、溶无机磷、产铁载体、产IAA及固氮的能力；R12和R17疑似为新种且R12具有解钾、溶无机磷、溶有机磷的能力；R17具有溶有机磷的能力；P5同时具有溶有机磷、产IAA及固氮的能力；F30同时具有溶有机磷、溶无机磷及解钾的能力；HR3同时具有溶有机磷、产IAA及铁载体的能力。剩余41株功能菌株，由于低温影响，在培养中发现其长势缓慢、功能值偏低，因此未选取为实验材料。

1.2.3 菌肥制备

将获得的功能菌株按照各分类水平上的优势菌属、生长特性及能力值，选取6株菌，分别为R1、R12、R17、F30、HR3、P5，将6株单菌落分别接至R2A液体培养基中，置于20 ℃，180 r/min培养3 d后，在4 ℃条件下8 000 r/min离心5 min获取菌体。将获得的菌体加入无菌水以相同的方式离心3 ~ 4次，最终将获得的菌体稀释至OD₆₀₀ = 1。将6株菌进行拮抗实验，发现6株菌之间无菌圈产生，可进行组合；并采用等比例混合形式制成了混合菌液菌肥。

1.2.4 幼苗培育

2023年7月开始，使用GA3（200 mg/L）将种子浸泡12 h后^[14]，清水反复冲洗3 ~ 4次，将其均匀地摆放在放入脱脂棉、滤纸及清水的玻璃培养皿中。在温度为20 ℃、湿度为60%的条件下避光培养，种子萌发长出子叶后移入花盆中，置于西藏农牧学院珍稀濒危园林植物培育基地的日光温室中培育。通过前期准备，获得5种不同苗龄的拟藿香叶绿绒蒿幼苗。2024年3月，将5种不同苗龄的拟藿香叶绿绒蒿再次进行分盆，用于试验。分盆时，全部幼苗的栽培盆大小、栽培基质的填充量相同；为保证幼苗生长所需的营养空间和盆栽管理需要，每盆的幼苗种植数量为：3 - 4个月苗龄幼苗每盆3株；6个月苗龄幼苗每盆2株；8 - 9个月苗幼苗龄每盆1株。每个苗龄3个重复，并设置对照。

1.2.5 菌肥施用

将获得混合菌体稀释至OD₆₀₀ = 1，按照5%的施加量，采用根灌法，分别追施到盆栽的5种不同苗龄拟藿香叶绿绒蒿幼苗根部；对照组施加等量无菌水，每处理3个重复，每月施加一次混合菌液菌肥。

1.2.6 指标测定

使用游标卡尺测量株高及根长，SPAD-502叶绿素仪测定的叶绿素含量，叶面积通过Adobe Photoshop CC2018进行计算。移栽前将培育的5种不同苗龄幼苗在先测量其4项指标，加入混合菌液生长两个月后，再测量其4项指标，并再次移栽。把第一次的测量值作为初始值，计算第二次与第一次的差值，用于数据分析。J为处理（加入混合菌液），CK为对照（未加混合菌液）。

1.3 数据处理

使用Excel2019和IBM SPSS statistics27对数据进行统计和分析，用单因素方差分析和多重比较进行差异显著性检验，方差齐性检验用Turkey检验法，P < 0.05代表有显著性差异，采用origin 2018 64 Bit进行数据处理和图表绘制。

2 结果与分析

2.1 根际促生菌对不同苗龄拟藿香叶绿绒蒿幼苗株高的影响

对比株高发现，施加混合促生菌液植株（J）的株高均高于CK，可见，施加混合菌液对幼苗的株高有促生效果。与其他时期相比，8个月苗龄幼苗株高增加值最大，高于CK 20.6 mm，但不显著（P > 0.05），且对6个月苗龄幼苗的株高促生效果最小；施加混合促生菌液后株高仅高于对照0.5 mm（图1）。

2.2 根际促生菌对不同苗龄拟藿香叶绿绒蒿幼苗根长的影响

施加混合促生菌液植株的根长生长量均高于CK。与其他苗龄幼苗相比较，菌液对9个月苗龄幼苗的促生效果最为明显，根长比CK增长38.94 mm，可知，混合菌液的施加能极显著促进其根长的生长（P < 0.01），且4个月苗龄幼苗施加混合促生菌液后也达到了显著的促生效果（P < 0.05，增加值21.67 mm）；对6个月苗龄幼苗根长的增加值最小，但施加混合促生菌液后根长也比对照增加了6.97 mm（图2）。

2.3 根际促生菌对不同苗龄拟藿香叶绿绒蒿幼苗叶面积的影响

施加混合促生菌液植株的叶面积均大于CK，可见，施加混合菌液对幼苗的叶面积有促生效果。其中，与其他苗龄幼苗相比较，3个月龄幼苗的叶面积增加值最高，施加混合促生菌液后的叶面积比CK增加了19.59 cm²，差异极显著（P < 0.01）；而对于8个月龄幼苗，施加混合促生菌液植株的叶面积比CK增加了65.41 cm²，施加混合菌液对幼苗的叶面积也有显著的促生效果（P < 0.05）；而4个月苗龄幼苗叶面积增加值最小，施加混合促生菌液植株的叶面积仅比对照仅增加了1.45 cm²（图3）。

2.4 根际促生菌对不同苗龄拟藿香叶绿绒蒿幼苗叶绿素的影响

从图4可以看出，施加混合促生菌液植株的叶绿素含量均多于CK。与其他苗龄幼苗相比较，施用促生菌液对8个月苗龄幼苗的叶绿素含量促进效果最为明显，增加值达到了8.10 SPAD，可见，混合菌液的施加对8个月苗龄幼苗的叶绿素含量具有显著的促生效果（P < 0.05）；但对9个月龄幼苗的促生效果最弱，施加混合促生菌液植株的叶绿素含量仅比对照高出0.23 SPAD。尽管6个月龄幼苗的叶绿素含量最低，但施加混合促生菌液植株的叶绿素比CK高2.27 SPAD。

3 结论与讨论

3.1 结论

根际促生菌对不同苗龄拟藿香叶绿绒蒿幼苗的4项指标均有促进作用。其中，从株高的促生效果来看，1个月苗龄的拟藿香叶绿绒蒿幼苗，加入混合菌液后的全株高比对照增加9.86 mm；而对其他苗龄的幼苗同样表现出较好的促生效果，并对8个月苗龄幼苗的促生效果最好（其株高比CK增加20.6 mm），但对6个月苗龄幼苗促生作用最差（株高仅比CK增加0.5 mm）。对根长的促生效果显示，施加混合菌液的幼苗与CK差值最大时，其根长比CK增加38.94 mm，最小时，其根长比CK增加6.97 mm。叶面积的结果显示：施加混合菌液后与CK相比，最大时，其叶面积比CK增加65.41 cm²，最小时，其叶面积比CK增加19.59 cm²。叶绿素指标显示：促生效果最好时，其叶绿素含量比CK增加8.10 SPAD，最差时，其叶绿素含量比CK也增加了0.23 SPAD。

根际促生菌对不同苗龄拟藿香叶绿绒蒿的促生效果存在差异性，但整体来看，其促生作用主要通过促进植物根系、叶面积、叶绿素含量的增加而达到促生效果。其中，对4个月和9个月苗龄幼苗的根系促生效果最为明显，对3个月和8个月苗龄幼苗的叶面积促生效果最为明显，对8个月苗龄幼苗的叶绿素含量促生效果最为明显，因此，该混合菌液制备的菌肥适用于苗龄较大的幼苗，尤其适用于8个月苗龄的拟藿香叶绿绒蒿幼苗。

3.2 讨论

研究植物不同生长期根际微生物群落多样性，不仅能够揭示植物各生长阶段对哪些类群的微生物进行招募，还能够揭示各生长阶段微生物类群对促进植物生长的直接关系^[15]。王一晴^[16]将从玉米根际筛选到的促生菌与基质混合施加在玉米苗期、拔节期、大喇叭口期及抽雄期4个时期，结果表明，施加菌肥能显著提高玉米的株高和叶面积。本实验研究结果显示，施加菌液的幼苗其各项指标均优于未加菌幼苗，且对部分苗龄幼苗的叶面积、根长、叶绿素含量促进效果显著或极显著，佐证了施加促生菌能够促进植物的生长，并与生长期关联。

不同生长时期植物的根际微生物环境不同。如：程齐^[17]等研究发现：不同生长期的核桃根际土壤细菌和真菌群落结构均存在显著差异(P < 0.05)，而且根际土壤微生物的生态网络相较于非根际土壤关联性更强、复杂程度更高，并发现根际土壤细菌群落的网络复杂性在结果期最高，群落间的正相互作用在萌芽期最高；任悦^[18]等研究发现不同生长期和树龄的樟子松其外生菌根真菌多样性与群落物种均有差异；邱远金^[19]等基于高通量测序研究番红花不同生长期根际土壤中的菌群，发现其多样性随番红花的生长呈现不断上升的趋势。本实验中促生菌来源于野生植株，其植株已经处于开花前期，因此，该菌液对盆栽幼苗的株高促生效果不明显，对叶面积、根长、叶绿素含量达到显著促进效果时期均处在8个月苗龄、9个月苗龄，有可能与菌株采样母株的株龄有关。因此，为提高本试验的促生效果，下一步还需要从野生环境中寻找相同株龄的植株功能菌株，进行补充试验，以验证不同生长时期拟藿香叶绿绒蒿根际微生物的促生差异性，以达到更为精准地研究开发菌肥的目的^[20]。

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基金资助

10种野生林下资源培育与示范（林芝市林草局委托项目）

林芝雅尼河谷面山生态修复工程规划(DSF-Z-99)