黑青稞花青素调控H9C2心肌细胞miRNA表达谱的生物信息学分析

Bioinformatic Analysis of miRNA Expression Profile in H9C2 Cardiomyocytes Regulated by Black Highland Barley Anthocyanins

摘要

探讨黑青稞花青素对H9C2心肌细胞miRNA表达谱的影响，研究黑青稞花青素通过调控miRNA来实现对心肌细胞保护的潜在机制。设置6组不同处理的H9C26细胞，分别为正常组（CK）、过氧化氢组（H₂O₂）、黑青稞花青素组（ACN）、原花青素组（OPC）、黑青稞花青素+过氧化氢组（ACN + H₂O₂）、原花青素组+过氧化氢组（OPC + H₂O₂），处理后提取各组细胞总RNA进行miRNA测序，对测序数据进行生物信息学分析。发现H₂O₂组和CK组比较，H₂O₂处理H9C2后导致 469个miRNA上调，133个miRNA下调；H₂O₂组和ACN + H₂O₂组比较，H₂O₂ 致273个miRNA上调，214个miRNA下调；H₂O₂组和OPC + H₂O₂组比较，H₂O₂ 致330个miRNA上调，222个miRNA下调；ACN和CK组比较，88个miRNA上调，25个miRNA下调；OPC和CK组比较，88个miRNA上调，27个miRNA下调；这些结果表明花青素预处理可通过调节miRNA缓解H₂O₂带来的影响。KEGG富集分析及差异表达miRNA的靶基因预测和富集分析结果显示，黑青稞花青素通过调控mTOR、PI3K/Akt/mTOR、MAPK等信号通路及上调miR-21等miRNA的表达，发挥抗氧化和抗凋亡作用。本研究可为黑青稞花青素预防和治疗心血管疾病提供一定的依据。

Abstract

To investigate the effect of black barley anthocyanins on the miRNA expression profile of H9C2 cardiomyocytes, and to study the potential mechanism of their protection against cardiomyocytes by regulating miRNA. Six sets of H9C26 cells were treated, namely normal group (CK), hydrogen peroxide group (H₂O₂), black barley anthocyanin group (ACN), procididin group (OPC), black barley anthocyanin + hydrogen peroxide group (ACN + H₂O₂), procidin group + hydrogen peroxide group (OPC + H₂O₂). After treatment, total RNA of each group was extracted for miRNA sequencing, and bioinformatic analysis of the sequencing data. Compared with H₂O₂ and CK groups, H₂O₂ Treatment of H9C2 resulted in the upregulation of 469 miRNA and 133 miRNA were downregulated; Comparison of the H₂O₂ group and the ACN + H₂O₂ groups, H₂O₂ To 273 miRNA, 214 miRNA were downregulated; Comparison of the H₂O₂ group and the OPC + H₂O₂ groups showed H₂O₂ To 330 miRNA, 222 miRNA were downregulated; Comparison of the ACN and CK groups showed 88 miRNA, 25 miRNA were downregulated; Comparson of the OPC and CK groups showed 88 miRNA, 27 miRNA were downregulated; These results indicated that anthocyanin pretreatment could alleviate the effects of H₂O₂ by modulating miRNA. KEGG enrichment analysis and target gene prediction and enrichment analysis of differentially expressed miRNA showed that black barley anthocyanins had antioxidant and anti-apoptotic effects by regulating signaling pathways such as mTOR, PI3K / Akt / mTOR, MAPK and upregulating the expression of miRNA such as miR-21. This study provides a certain basis for the prevention and treatment of cardiovascular diseases in black highland barley anthocyanins.

Graphical abstract

关键词

黑青稞花青素 / 心血管疾病 / miR-21 / miRNA / 生物信息学分析

Key words

Black barley anthocyanins / Cardiovascular disease / miR-21 / miRNA / Bioinformatics analysis

黑青稞作为青藏高原特有的种质资源，因其籽皮中富含丰富的花青素呈黑色而得名，花青素作为一种重要的功能物质，一直以来都是黑青稞降血脂、降血糖、保护心血管、调节免疫等功效研究的关注重点，同时提升花青素含量也成为黑青稞栽培和品种选育的重要方向^[1]。近年来，以隆子黑青稞为代表的农家品种在增产关键技术研究方面取得了重要进展。王建林等^[2,3]人的研究发现，缓释尿素处理能有效提高隆子黑青稞籽粒的面积、周长、粒长和粒宽，进而提升籽粒重量，增加千粒重，这一成果为制定符合隆子县实际情况的黑青稞栽培规范提供了依据，解决了制约黑青稞高产栽培的难题。然而，如何解决黑青稞产业低效问题仍是当前重要的发展方向。开展黑青稞花青素功效的挖掘与机理研究，将成为支持黑青稞高值化加工和高效利用的关键环节。

心血管疾病（cardiovascular disease，CVD）是世界上死亡率和发病率较高的疾病，研究表明细胞内的氧化应激是其主要的诱因^[4]。花青素是一类广泛存在于植物中的天然水溶性色素，是一种优于传统抗氧化剂的强抗氧化剂。研究发现花青素对预防心血管疾病和降低CVD死亡率有着积极作用，机制上可能是通过影响细胞内基因表达与信号转导实现的^[5]。许多研究表明花青素具有广泛的生物学活性，包括抗氧化剂^[6]，抗炎^[7]，抗微生物剂和抗癌活性^[8]，视力的改善^[9], 诱导细胞凋亡和神经保护作用^[10]。此外，花青素对血管和血小板具有多种作用，可降低患冠心病的风险^[11]。然而，最近的研究表明可能涉及更复杂的分子机制，包括基因表达，细胞信号转导和miRNA表达的调节。例如，白藜芦醇通过上调miR-21和SIRT1在缺血大鼠中的表达发挥心脏保护作用^[12]。

近年来，miRNA在CVD中的作用受到了广泛关注。miRNA是一种在真核生物中发现的内源性非编码RNA，长度大约为18至25个核苷酸^[13]。研究发现，miRNA涉及多种调节途径，如发育、抗病毒防御、造血机制、器官发育、细胞增殖与凋亡以及脂肪代谢等^[14]。而阐明 miRNA 介导的功能机理，首先需要识别差异表达的miRNA。Reinhart等^[15]从拟南芥miRNA文库中确定16种miRNA，并通过降解转录因子调节基因表达、抑制目标mRNA，调控植物形态、激素分泌、信号转导及环境胁迫响应;周玉飞^[16]在木薯研究中，发现7个受低温诱导的miRNA，且miRNA与靶基因表达在不同品种及低温处理方式间存在显著差异。基于这一点，我们针对H₂O₂氧化损伤H9C2细胞和黑青稞花青素和原花青素处理后H9C2细胞开展了miRNA测序分析，从而验证黑青稞花青素可以调控miR-21等miRNA的表达来实现对H9C2心肌细胞的抗氧化保护作用，为花青素的心血管保护作用以及黑青稞的高值化利用提供理论支持。

1 材料与方法

1.1 试验材料

Trizol试剂盒(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)；RNase-free水(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)；DMSO(Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)；H9C2心肌细胞；黑青稞花青素；原花青素；H₂O₂；K5 500紫外分光光度计(Kaiao, Beijing, China)；Agilent 2 200生物分析仪(Agilent, USA)；Illumina Hiseq 2 000/2 500测序仪(Illumina, San Diego, USA)；Thermo NanoDrop One超微量紫外分光光度计(Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA)；1%琼脂糖凝胶电泳仪(Shanghai Yetuo Technology Co., Ltd, Shanghai, China)。

1.2 试验方法

1.2.1 试验分组

将研究模型心肌H9C2细胞分成6个不同的处理组分别为：空白对照组（CK）（不予以任何处理的H9C2细胞组）；H₂O₂处理组（氧化损伤模型组）；ACN组（H9C2细胞经过黑青稞花青素处理后孵育）；OPC组（H9C2细胞经过原花青素处理后孵育）；H₂O₂ + ACN组：（H9C2细胞经过黑青稞花青素处理后和H₂O₂共孵育）；H₂O₂ + OPC组（H9C2细胞经过原花青素处理后和H₂O₂共孵育）。

1.2.2 细胞处理和RNA提取

细胞最初的浓度为7 × 10⁵个细胞/ 6 cm²板。花青素和原花青素预处理的浓度为100 μg/ml，培养24 h，再加入100 μM过氧化氢处理10 h，总计培养24 h。正常组（CK）加了等量的DMSO培养24 h。

细胞处理24小时后，使用Trizol试剂提取总RNA。每组的样本由来自3个重复的等量总RNA组成，以使个体差异标准化。使用紫外分光光度计K5500、琼脂糖凝胶电泳和 Agilent 2200生物分析仪评估RNA纯度和质量。

1.2.3 RNA质量检测

用RNase-free水1:50比例稀释样品。使用采用Thermo NanoDrop™ One超微量紫外分光光度计检测其浓度和纯度。A260/A280在1.8 ~ 2.2范围表示RNA纯度良好。完整性：RNAse-free条件下，通过1%琼脂糖凝胶电泳检测RNA样品的完整性。完整性判断：可以清晰观察到两条RNA（28 S和18 S）电泳条带，两条带的灰度比值大约2:1 ~ 1:1，则RNA未降解。如果还有其他条带出现则预示有污染，需要重新提取。

1.2.4 miRNA测序流程

实验过程遵循Illumina公司标准操作，涵盖文库制备与测序两个环节。使用TruSeq Small RNA Sample Prep Kits（Illumina, San Diego，USA）试剂盒进行小RNA测序文库制备。文库制备完成后，借助Illumina Hiseq 2000/2500平台进行测序，单端读长为50 bp。

1.2.5 miRNA测序数据分析

miRNA数据分析软件使用ACGT101-miR（LC Sciences, Houston, Texas, USA）。

2 结果与分析

2.1 数据质控

我们分析了来自6组大鼠心肌细胞H9C2样本的miRNA测序（miRNA-seq）数据。表1显示了6组样本的miRNA测序数据详细信息，获得了11,000,000 个~ 16,000,000个Total_Reads（下机数据总的reads数量），其中CK组的总reads数最少，约1 337万；H₂O₂组总reads数最多，约1670万；同时获得了590,000,000 个~ 851,000,000个Total_Bases（下机数据总的Bases数量）数据，ACN+H₂O₂组得到的总bases数量最小， 约5.9亿bp；H₂O₂组得到总bases数量最大，约8.5亿bp。然后分别统计了每个样本中4种核苷酸A、T、C、G的比例，以及少量N含量，数据表明6组样本在核苷酸组成上的差异性不大。表1还给出了质量评估指标Q 20%和Q 30%，Q 20%表示测序结果中错误率小于1%的碱基比例，Q 30%表示错误率小于0.1%的比例，所有6组样本的Q 20%均超过98%，Q 30%均超过94%，说明6组样本的测序质量都十分稳定和可靠。最后表1给出了各组样本的GC含量，即C和G碱基在总碱基中的占比，6组样本中GC含量范围在50% ~ 55%之间，ACN + H₂O₂组和OPC + H₂O₂组的GC含量略高，其他组样本GC含量差异不大。综上，6组样品的测序质量都很好，能够满足后续分析的需求。

2.2 Rfam数据库比对分析

Rfam^[17]数据库比对分析是为了去除Clean Data中含有的非miRNA序列。结果分别对Total reads（总数）以及Unique reads（种数）进行统计和可视化。两种数据比对结果以饼状图的形式展示rRNA，snoRNA，snRNA，tRNA和一些其他的非miRNA序列占比对到Rfam Data的比例。根据Rfam数据库比对结果饼图（图1）可以看出，6组样本经过Rfam数据库比对后，rRNA序列占比最大，其次是tRNA序列，这与Rfam数据库涵盖的主要是此类ncRNA序列匹配。除去这些序列后，剩余序列中包含miRNA和其他未知序列，过滤的效果就是去掉这部分非miRNA序列，为后续的miRNA分析奠定基础。

2.3 样本相关性分析

主成分分析（PCA^[18]，Principal Component Analysis）一般主要展示PC1、PC2两个主成分或PC1、PC2、PC3 3个主成分。图2中的每个点表示1个样品，图2中点的距离越近表示样本组成成分越相似，同1组样品之间距离近与其他组样本距离远，说明样品生物学重复好或者同种样品组成相似。图2显示，正常组（CK）、花青素 + 过氧化氢组（ACN + H₂O₂）、原花青素组+过氧化氢组（OPC + H₂O₂）3组聚集较近，说明样本组成成分越相似，花青素和原花青素降低H₂O₂对H9C2细胞的氧化胁迫压力。

2.4 miRNA差异分析

差异显著性miRNA是指样品间或者同一样品经过不同处理后，表达上调miRNA和表达下调miRNA的汇总。火山图显示差异表达miRNA的整体分布情况，如果目标miRNA差异倍数很大（log2fc绝对值很大）和或P值很小，则可以很好的通过火山图体现或引出目标。可以通过火山图体现组间最显著差异的miRNA，并使用Top miRNA进行靶基因预测。样品之间的差异表达如图3的差异miRNA火山图。

用H₂O₂处理组与CK孵育揭示了单独暴露于H₂O₂的影响；H₂O₂处理组与花青素预孵育(ACN + H₂O₂)以及与原花青素预孵育(OPC + H₂O₂)的预孵育显示花青素在氧化应激条件下产生的不同效果。如图3所示，H₂O₂和CK比较，导致469个miRNA上调，133个miRNA下调；H₂O₂ 和ACN + H₂O₂组比较，H₂O₂致273个miRNA上调，214个miRNA下调；H₂O₂和OPC + H₂O₂组比较，H₂O₂致330个miRNA上调，222个miRNA下调。ACN和CK组比较，88个miRNA上调，25个miRNA下调；OPC和CK组比较，88个miRNA上调，27个miRNA下调。

说明：以log2(FC)为横坐标，-log10(pvalue)为纵坐标，对差异表达分析中所有的miRNA绘制火山图。其中横坐标代表miRNA在不同样本中差异表达倍数变化；纵坐标代表miRNA表达量变化差异的统计学显著性；红色代表上调的显著差异miRNA，蓝色代表下调的显著差异表达miRNA，灰色的点代表非显著性差异表达miRNA。

用H₂O₂处理与正常组（CK）以及ACN/OPC + H₂O₂与H₂O₂处理的细胞的miRNA表达结果分别聚集如图4。从图4中我们可以发现，OPC组上调的miRNA数量更多，且大部分都拥有较高的显著性，在下调的基因方面，数量上也比ACN组更高，不过大部分变化的倍数和显著性都不高，原花青素相较于花青素其抗氧化性更强，其作用于细胞的机理上在这个火山图中看来也存在较大的差异。

我们从图4可以看到，H₂O₂处理组与花青素预孵育 (ACN + H₂O₂)和原花青素预孵育(OPC + H₂O₂)的预孵育相比，显示rno-miR-21-3p，rno-miR-351-3p，rno-miR-362-3p，rno-miR-582-3p，rno-miR-193b-3p，rno-miR-292-3p在预孵育保护组均得到上调式表达；ppy-miR-199b-3p_R-1_2ss7TG20TC，ssc-miR-206，mdo-miR-34b-5p，hsa-miR-151b_R + 4等得以下调表达。H₂O₂处理组和原花青素预孵育(OPC + H₂O₂)的预孵育相比，rno-miR-21-3p，rno-miR-351-3p，rno-miR-362-3p，rno-miR-193b-3p呈现类似的上调表达结果。

说明：横坐标为样本，纵坐标为miRNA，不同的颜色表示不同的miRNA表达水平，颜色由蓝色经由白色至红色表示表达量从低到高。红色表示高表达miRNA，深蓝色表示低表达miRNA。需要注意的是Z值的标准化方式只能通过颜色直观比较同一miRNA在不同样本中的表达水平，不能比较不同miRNA的表达水平。

2.5 靶基因预测与富集分析

2.5.1 差异miRNA的靶基因预测与富集性分析

富集分析主要是对差异miRNA靶向的靶基因（mRNA）的基因水平进行富集分析，简单来说是对miRNA靶基因进行GO/KEGG功能注释建立起以基因为介质的miRNA与功能的联系。基因本体（Gene Ontology，GO）是一个国际通用的基因功能分类体系，它提供了一套不断更新的标准词汇表，用以全面描述生物体内基因及基因产物的特性^[19]。在所有选定的miRNA靶基因中，我们将这些靶基因对应的GO注释分为3类，包括分子功能（Molecular Function）、生物过程（Biological Process）和细胞组件（Cellar Component）。GO富集分柱状图反映了bp、cc、mf中富集的Term上靶基因的个数分布情况。如图5为H₂O₂处理组和花青素预孵育(ACN + H₂O₂)的差异miRNA靶基因富集性分析分布。采用ggplot2将GO富集分析结果以气泡图展示（图5B），横坐标为Rich factor，代表靶基因数占GO总基因数比例，Rich factor越大，富集程度越高；纵坐标为GO Term，即基因功能注释。气泡图中，气泡大小反映S gene number，气泡颜色表示富集分析的P值，P值越小，富集显著性越高。GO富集气泡图是取p值最小的Top 20的Term进行展示。

A. Bar Plot of GO enrichment analysis

由于在bp、cc、mf 三种function上富集的Term数目比较多，无法展示所有的富集分析结果，因此分别将bp、cc、mf的Term按照注释到的差异基因数目（S gene number）由大到小排序，针对H₂O₂处理组和花青素预孵育(ACN + H₂O₂)的测序和生物信息学分(ACN_H₂O₂ vs H₂O₂)，分别挑选Top 20的Term进行绘图展示。利用P值最小的前20个GO条目进行作图，纵坐标为GO条目，横坐标为该GO条目富集分析的P值的-log₁₀值，结果如下图6至9所示。

GO富集的Top 20的Term中，前几位富集的术语包括细胞质、胞浆、核质（浆）、内质网和高尔基体等。细胞质和胞浆本身就含有线粒体、叶绿体、内质网、内网器、高尔基体、溶酶体、微丝、微管、中心粒等组件。比如，其中的线粒体就和氧化应激息息相关。氧化保护因子可以通过维持线粒体的正常功能和状态来抑制氧化应激诱导的损伤。

从生物过程（BP）、分子功能（MF）和细胞成分（CC）三个方面对差异表达基因（padj < 0.05）进行GO分析。结果表明，GO-BP 涉及生化过程，磷酸化（phosphorylation），DNA转录的正调控（positive regulation of transcription DNA templated），离子转运（ion transport），基因表达的正调控（positive regulation of gene expression），蛋白磷酸化（protein phosphorylation），细胞增殖（negative regulation of cell population proliferation），细胞凋亡（apoptotic process ），细胞凋亡的正调控（positive regulation of apoptotic process），胞内信号传递（intracellular signal transduction）等。GO-CC富集包括细胞质、胞浆、核质（浆）、内质网和高尔基体等。GO-MF 富集的具有显著差异的术语有蛋白结合（protein binding），转移酶活性（transferase activity），激酶活性（kinase activity），水解酶活性（hydrolase activity），蛋白激酶结合（protein kinase binding），氧化还原酶活性（oxidoreductase activity）等。

2.5.2 KEGG富集性分析

KEGG（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes）^[20]全称是京都基因和基因组百科全书，是基因组破译方面的公共数据库。如图10和图11，KEGG富集分析图，RichFactor表示位于该KEGG的靶基因数/位于该KEGG的总基因数，RichFactor值越大，KEGG富集程度越大。

利用P值最小的前20个KEGG通路进行作图，纵坐标为通路名称，横坐标为该KEGG通路富集分析的P值的-log₁₀值，结果如下图12所示。通过对差异表达miRNA的 KEGG 通路分析获得前20条通路。富集分析结果显示PI3K/Akt/mTOR显著富集，富集较强的信号通路还包括细胞内吞、MAPK/ERK 通路、cGMP-PKG signaling pathway。PI3K/Akt/mTOR 中的磷脂酰肌醇3激酶 (PI3K) 是一个脂质激酶家族，可整合来自生长因子、细胞因子和其他环境信号的信号，将它们转化为调节多种信号通路的细胞内信号。这些途径控制着许多生理功能和细胞过程，包括细胞增殖、生长、存活、运动和代谢。该信号通路的显著富集，与我们前面研究的结论相符。

MAPK^[21]通路（也称为Ras-Raf-MEK-ERK 通路）是细胞中的蛋白质链，可将信号从细胞表面的受体传递到细胞核中的DNA。启动MAPK/ERK通路的信号是细胞外有丝分裂原与细胞表面受体的结合。这允许Ras蛋白（1种小GTP酶）将GDP分子换成GTP分子，从而触发通路的“开/关”，然后Ras蛋白可以激活MAP3K（例如Raf），从而激活MAP2K和MAPK。最后，MAPK可以激活转录因子，例如Myc。该过程涉及Ras激活，翻译和转录的调节，细胞周期进入和增殖的调节。

3 讨论与结论

首先，本研究通过样本相关性分析，发现正常组（CK）、花青素+过氧化氢组（ACN + H₂O₂）、原花青素组+过氧化氢组（OPC + H₂O₂）三组聚集较近，说明样本组成成分越相似，花青素和原花青素降低H₂O₂对H9C2细胞的氧化胁迫压力；过氧化氢组（H₂O₂）和花青素组（ACN + H₂O₂）偏离较远，说明二者的单独处理，都会对H9C2细胞产生比较大细胞调控或者影响；和H₂O₂处理组相比，花青素预孵育 (ACN + H₂O₂)组内rno-miR-21-3p，rno-miR-351-3p，rno-miR-362-3p，rno-miR-582-3p，rno-miR-193b-3p，rno-miR-292-3p上调式表达，ppy-miR-199b-3p_R-1_2ss7TG20TC，ssc-miR-206，mdo-miR-34b-5p，hsa-miR-151b_R + 4下调表达，原花青素预孵育(OPC + H₂O₂)内rno-miR-21-3p，rno-miR-351-3p，rno-miR-362-3p，rno-miR-193b-3p呈现类似的上调表达结果。其中rno-miR-21-3p其功能广泛， 包括调节肿瘤细胞增殖、迁移、凋亡和分化等过程；mir-351-3p通过靶向abca4干细胞的编码序列促进大鼠羊水来源的间充质基质细胞增殖^[22]；MiRNA-362-3p 通过靶向 E2F1、USF2 和 PTPN1 诱导细胞周期停滞，并与结直肠癌的复发有关^[23]。

其次，本研究通过对差异表达miRNA的 KEGG 通路分析获得一些花青素调控氧化胁迫H9C2的信号通路。其中mTOR信号通路显著富集，mTOR可对细胞外相关因子刺激产生应答，在哺乳动物中，是一种高保守的丝氨酸苏氨酸蛋白激酶^[24]。如图13所示，mTOR有两种复合物存在形式，mTORC1和mTORC2。mTORC1由 mTOR、Raptor、PRAS40、Deptor、mLST8、Tel2和Tti1组成，一般对生长因子、氨基酸、氧化应激和机能状态转变刺激产生应答，涉及脂代谢、自噬、蛋白合成和核小体生物合成等多个生物过程；mTORC2由mTOR、mSin1、Rictor、Protor、Deptor、mLST8、Tel2和Tti1组成，主要应答生长因子刺激，调控细胞骨架组织及代谢。mTOR主要是通过PI3K/Akt/mTOR途径来实现对细胞生长、细胞周期等多种生理功能的调控作用，PI3K/Akt/mTOR相关靶点为Akt、AMPK、ATM/ATR、mTOR、PI3K、PI4K、PTEN等^[25]。

PI3K/Akt 信号通路的富集验证了本研究中花青素调控miRNA应对氧化胁迫的主要的信号通路。磷脂酰肌醇3激酶（PI3K）/AKT（蛋白激酶B）信号通路可由各种不同类型的细胞刺激物和毒素激活，可参与许多细胞基本进程的调控，其中包括细胞生长、转录、翻译、细胞增殖、细胞运动及糖原代谢。许多生长因子激活PI3K家族成员，进而促使一种脂质信号分子PIP2转变为另一种脂质信号分子PI（3,4,5）P3。这一磷酸化产物激活蛋白激酶，激发PI3K-AKT信号通路。如下图14所示：生长因子与其酪氨酸激酶受体或G蛋白偶联受体结合后，可分别激活Ia和Ib家族PI3K异构体。同时，PI3K在细胞膜上催化PIP3的生成，然后PIP3进入细胞作为第二信使协助激活Akt。Akt一旦激活，可通过磷酸化底物在凋亡、蛋白合成、代谢和细胞周期中调控关键细胞反应。

KEGG 通路分析也显示，MAPK信号通路和细胞凋亡信号通路显著富集。MAPK信号通路是真核细胞介导细胞外信号到细胞内反应的重要信号转导系统。MAPK通路相关信号是一类高度保守的蛋白激酶家族，共发现有19种MAPKKK（也称MAP3K或MEKK），7种MAPKK（MAP2K)和14种MAPK。它们之间为上、中、下三层级联信号分子，MAPKKK活化MAPKK，后者再活化MAPK，即细胞外信号→MAPK激酶的激酶(MKKK)→MAPK激酶(MKK)→MAPK，调节细胞的生长、分化、凋亡和死亡等多种生理过程。MAPK信号通路主要包含经典MAPK信号通路、JNK/p38 MAPK信号通路和ERK5三条信号通路，其中，最早发现的经典的 Ras-Raf-MAPK 信号转导途径，参与各种生长因子、细胞因子、丝裂原以及激素受体活化后的信号转导，在细胞的增殖、生长和分化等方面有重要的调节作用^[26]。

细胞凋亡信号通路中的Caspase家族半胱氨酸蛋白酶，包括caspase-2,-8,-9,-10,-11和-12，这些促凋亡信号紧密相连，一旦激活，这些酶会切割并激活下游的效应组Caspase，包括Caspase-3,-6,-7。效应Caspase通过对细胞内蛋白特定的天冬氨酸残基位置处进行切割实现细胞的凋亡；FasL和 TNF对Fas和 TNFR的结合能够激活caspase-8和-10；DNA损伤诱导PIDD的表达，PIDD与RAIDD和caspase-2结合并激活caspase-2；受损线粒体中释放的细胞色素C与caspase-9的活化相关^[27]。抗氧化剂在控制细胞凋亡中起重要作用。

最后，通过前人的研究我们发现，ACN可以改变细胞内microRNA含量，多酚类物质通过Myc与P53两个转录因子参与细胞内microRNA的调控，因此我们在本研究中也对其进行了验证，发现经过ACN处理之后细胞内的Myc和P53两个蛋白的表达丰度都上升了，这和前人的研究结果相印证，至于为何ACN能起到这个作用还有待后续研究。

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基金资助

西藏自治区自然科学基金项目(XZ202101ZR0027G)