基于高通量测序技术分析藏药浴发酵酒曲微生物群落结构及多样性

Analysis of Microbial Community Structure and Diversity in Xizang Medicine Bath Fermented Jiuqu Based on High-throughput Sequencing Technology

摘要

本研究利用高通量测序技术对藏药浴发酵酒曲微生物群落结构组成及优势菌群的相对丰度进行研究和分析。结果表明，在属分类水平上，9组藏药浴发酵酒曲样品的细菌属富含丰富的微生物类群，而真菌属微生物群落丰富度较小。所有样品组共有的优势细菌门为变形菌门和厚壁菌门，优势菌属为醋杆菌属、明串珠菌属等；优势真菌门为子囊菌门，优势菌属为覆膜孢酵母属。 结论 西藏同一地区藏药浴发酵酒曲中的微生物群落构成存在差异，且相同菌门的相对丰度也有显著差异。本研究全面分析了藏药浴发酵酒曲中各类优势菌群和微生物群落结构比例，对推动西藏地区民族特色藏药浴酒曲品质和产业化发展提供了理论参考。

Abstract

In this study, the structural composition of the microbial community and the relative abundance of the dominant flora of Xizang medicine bath fermented Jiuqu were investigated and analyzed using high-throughput sequencing technology. The results demonstrated that at the genus classification level, the bacterial genera in all nine sample groups of Xizang medicinal bath fermented Jiuqu contained abundant microbial taxa, whereas the microbial communities of the fungal genera were less abundant.The dominant bacterial phylum shared by all sample groups were Proteobacteria and Firmicutes, and the dominant genera were Acetobacter, Leuconostoc and Enterobacteriaceae; The dominant fungal phylum was Ascomycota, and the dominant genus was Saccharomycopsis. Conclusion There were differences in the composition of microbial communities and significant differences in the relative abundance of the same phylum in Xizang bath fermented Jiuqu from the same region of Xizang. This study comprehensively analyzed the proportion of various types of dominant flora and microbial community structure in Xizang medicinal bath fermented Jiuqu and provided theoretical references for promoting the quality and industrialization of Xizang medicinal bath Jiuqu of national specialties in the Xizang region.

Graphical abstract

关键词

藏药浴发酵酒曲 / 高通量测序 / 群落结构 / 微生物多样性

Key words

Xizang medicine bath fermented Jiuqu / High-throughput sequencing / Community structure / Microbial diversity

引言

藏药浴是由藏麻黄、大籽蒿、刺柏叶、水柏枝和烈香杜鹃5种药材组成，故又被称为“五味甘露药浴”，是藏族人民在温泉疗法实践基础上，依据藏医理论结合本地区地道药材，经发酵、煎煮后制备成汤液而创造的一种藏医独特的药物外治疗法^[1,2]。藏药浴疗法在我国民族医药学中具有十分重要的地位，因其配方独特、毒副作用小、临床疗效显著，普遍受到人们的青睐，并于2006年列入中国国家级非物质文化遗产名录^[3]。

酒曲起源于古代中国，是我国特有的民族遗产之一，早在北魏时期的《齐民要术》古籍中就有关于酒曲的记载^[4]。藏药浴酒曲是藏族人民按照西藏传统的自然接种方式制作而成的发酵剂^[5]。它是以粮谷为主要原料制做而成，外观似饼状，表面覆盖着一层白色粉末状物质，使曲面颜色呈白色或灰白色^[6]。研究表明^[7-9]，酒曲中微生物种类繁多、来源广泛、性能各异，并在发酵过程中有着至关重要的作用。目前，关于酒曲微生物的研究主要在传统分离培养和高通量测序两大方面^[10]。高通量测序技术是当今基因组学研究中最为重要的方法之一，由于该技术成本低且准确性高，可全面地分析微生物群落结构组成及多样性，是目前评估微生物多样性的有力工具^[11,12]。张二豪等^[13]采用高通量测序技术分析了西藏7个地区青稞酒曲中的微生物群落结构组成及多样性，结果表明，青稞酒曲中富含丰富的微生物类群，且细菌多于真菌。陈申习等^[14]采用高通量测序技术对不同酒曲样品中微生物群落结构进行分析，发现拟杆菌门、变形菌门和放线菌门是酒曲中的优势菌群。孟凡冰等^[15]利用高通量测序方法对6种青稞酒曲中微生物群落结构进行研究，发现乳酸菌的耐盐与耐低温性较好，这2种菌在低温发酵食品中具有较好的应用前景。

目前还未见有关于西藏同一地区藏药浴发酵酒曲中微生物群落构成的研究报道。因此，本研究利用高通量测序方法，对西藏藏药浴发酵酒曲微生物群落结构组成及优势菌群的相对丰度进行研究和分析，旨在为后续藏药浴发酵液产品质量的提高以及优势菌种的筛选提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 实验材料

本研究酒曲原料均采集自西藏自治区日喀则市桑珠孜区西藏德棠药材开发有限公司生产用成品酒曲，制曲原料主要是由各种中草药及西藏自治区特色青稞构成，取样时间为2024年3月。取样方法如下：分别从3个不同制曲车间各取酒曲1 kg，采集完成后装入无菌袋中做好标记，冷链运输至实验室，置于-80 ℃超低温冰箱备用。

1.1.2 实验试剂

DNA提取试剂盒（E.Z.N.A.® Soil DNA Kit）；Illumina建库试剂盒（TruSeqTM DNA Sample Prep Kit）；Illumina测序试剂盒（MiSeq Reagent Kit）。

2.1 仪器与设备

本研究主要仪器与设备见表1。

2.2 试验方法

2.2.1 总DNA提取

将整块酒曲饼粉碎后，按照试剂盒说明书进行总DNA提取。

2.2.2 PCR扩增

将提取到的DNA经纯度检验后进行PCR扩增，以2.3.1所提取的DNA作为模板，采用25 µL的PCR体系，详情如表2所示。

参考张二豪^[16]等的方法进行PCR扩增，使用通用引物338 F和806 R扩增细菌16S r RNA基因V3 ~ V4区，使用通用引物ITS1F和ITS2R扩增真菌内源转录间隔区（internally transcribed spacer,ITS），PCR产物使用2 % 琼脂糖电泳检测^[13]。

2.2.3 高通量测序

参考薛蓓^[17]等的方法进行高通量测序，将符合条件的PCR产物送至上海美吉生物公司，后续的文库构建与上机测序由该公司的Illumina MiSeq PE300测序平台进行。

2.2.4 数据处理

参考母应春^[18]等的方法进行数据处理，首先使用Trimmomatic软件将原始测序序列进行质控，FLASH软件进行拼接，去除无法拼接的序列，再使用Uparse（version 7.0.1090http://drive5.com/uparse/）软件平台，根据97%的相似度对序列进行操作分类单元（operational taxonomic unit，OTU）聚类，在聚类过程中使用UCHIME软件剔除嵌合体。利用R语言（version 3.3.1）的boot（1.3.18）和stats（3.3.1）包，进行Alpha多样性分析可以得到群落中物种的丰富度、覆盖度和多样性等信息。所有数据分析均在美吉生物云平台进行。

2 结果与分析

2.1 高通量测序结果分析

9个样品经高通量测序后，共产生562 297条真菌有效序列，平均序列长度为304 bp；共产生496 719条细菌有效序列，平均序列长度为414 bp；所有样品的电泳条带清晰，测序结果良好。在97%相似度水平上，细菌共检出388个OTUs，分属于1个界、19个门、39个纲、84个目、137个科，239个属、317个种；真菌共检出67个OTUs，分属于1个界、4个门、11个纲、20个目、31个科，40个属、59个种，结果表明藏药浴酒曲的细菌和真菌多样性十分丰富。

2.2 样品微生物Alpha多样性分析

最具代表性的Alpha多样性指数有Shannon、Simpson、Ace、Chao 1，它们共同反映了样品中微生物的多样性与丰富度^[19]。西藏藏药浴发酵酒曲中微生物细菌群的Alpha多样性分析见表3，9组样品检出的序列数、Alpha多样性指数有较大差异，在97%相似度水平上，9组样品共产生细菌OTUs数1127个。其中ZYYJQ3组样品OTUs数目最多，ZYYJQ1-3组OTUs数目最少。ZYYJQ3组的三个样品均有较高的Shannon指数，表示该组样品的微生物多样性均较高，所含微生物种类多于其他样品。ZYYJQ2组的3个样品Shannon指数均较低，表明该组样品的微生物多样性较低，ZYYJQ1-3组样品的Shannon指数最低，表明在该样品中某种微生物占据优势很大，其他微生物占比较低。ZYYJQ1组内ZYYJQ1样品的Shannon指数明显低于其他两个样品，表明同组样品的细菌群落结构也存在较大差异。综上所述，各样品的Alpha多样性指数有所差异，藏药浴发酵酒曲细菌之间多样性有所不同。

西藏藏药浴发酵酒曲中微生物真菌群的Alpha多样性分析见表4，在97%相似度水平上，9组样品共产生真菌OTUs数266个。在所有样品中，ZYYJQ3组各样品的Shannon指数较为接近，表示组内各样品群落结构差异性较小，ZYYJQ2组和ZYYJQ3组组内样品间Shannon指数差异较大，表示这两组样品的真菌群落结构差异大。其中ZYYJQ1-2组的Shannon指数最大，说明真菌群落结构复杂，微生物多样性较高；ZYYJQ3的Shannon指数最小，只有0.11，表明该样品的真菌群落结构极为简单，某种真菌占有绝对性优势。其他样品的Alpha多样性指数也参差不齐，表明其真菌群落结构各不相同。以上结果表明，虽然藏药浴发酵酒曲的样品均来自同一厂家，但9组样品的细菌和真菌多样性及丰富度存在明显差异性，这可能与制曲批次不同和季节温度变化影响等因素有关。

2.3 样品所含OTUs数目分析

Venn图可以直观地展现不同样品间共有和独有的OTUs数目，也直观反映了不同样品中的OTUs数的差异性^[20]。如图1所示，为各样品所含细菌和真菌OTUs数目的Venn图，图中不同颜色代表不同样品组，重叠部分为每个样品共有的OTUs数目，未重叠部分则是该组样品特有的OTUs。

通过Venn图对藏药浴酒曲中微生物群落结构组成进行分析（图1），ZYYJQ1、ZYYJQ2、ZYYJQ3样品独有的细菌OTUs数目分别为32、26和178个，共有的细菌OTUs数为80个，占总OTUs数的20.6%（图1a）。结果表明ZYYJQ3组含有最多的特有OTUs数目，具有最丰富的细菌多样性；ZYYJQ2组含有的细菌OTUs最少，细菌多样性最低。ZYYJQ1、ZYYJQ2、ZYYJQ3样品独有的真菌OTUs数目分别为9、19和1个，其中3组样品共有的真菌OTUs数目为14个，占总OTUs数的20.9%（图1b）。结果表明ZYYJQ2组具有最丰富的真菌多样性；ZYYJQ3组含有的真菌OTUs最少，真菌多样性最低。综上所述，表明同一厂家不同批次西藏藏药浴发酵酒曲样品中的OTUs数目存在明显差异。

2.4 门分类水平样品微生物群落结构

在门分类水平，西藏藏药浴发酵酒曲中细菌和真菌群落结构组成见图2和图3。在门水平上，9个样品共检出19个细菌门，其中丰度 ≥ 1%的共有3个细菌门，按照丰度占比由高到低排序为变形菌门（Proteobacteria） > 厚壁菌门（Firmicutes） > Unclassified-d-bacteria。如图2所示，变形菌门（Proteobacteria）在ZYYJQ1、ZYYJQ2和ZYYJQ3组均占有较高丰度，为绝对的优势菌门，平均丰度分别为87.10%、60.86%和63.42%；厚壁菌门（Firmicutes）也具有相对优势，在ZYYJQ2组和ZYYJQ3组所有样品中相对丰度较高，相对丰度分别为30.91%、39.92%、43.25%和27.15%、35.98%、36.86%。Unclassified-d-bacteria菌门大部分分布于在ZYYJQ3组，其相对丰度为5.69%，在ZYYJQ1组中少量存在，丰度为1.03%，在ZYYJQ2组中存在最少，仅占0.86%，表明藏药浴酒曲样品中仍存在大量未知和稀有细菌。蓝细菌门（Cyanobacteria）少量存在于ZYYJQ2和ZYYJQ3组，平均丰度分别为0.31%、0.45%，在ZYYJQ1组几乎未检测出；放线菌门（Actinobacteriota）主要分布在ZYYJQ2组且丰度较低，仅占0.52%；另外，将在所有样品中丰度均小于1%的细菌门归为未分类菌门（others），未分类菌在ZYYJQ3组中微量存在，丰度为0.12%。

在真菌门水平上，9个样品共检出4个菌门，其中丰度大于1%的仅有子囊菌门（Ascomycota）。如图3所示，子囊菌门（Ascomycota）为真菌的优势菌门，在9个样品中的相对丰度均高达99%以上，占据绝对优势，这与母应春等^[18]的研究结果较为一致。毛霉菌门（Mucoromycota）在ZYYJQ1和ZYYJQ2组所有样品中也占有一定的优势，相对丰度分别为0.90%、0.40%0.59%和0.43%、0.46%、0.20%；然而在ZYYJQ3组样品中，毛霉菌门（Mucoromycota）相对丰度很低，仅占0.04%。担子菌门（Basidiomycota）少量存在于ZYYJQ2组所有样品中，丰度为0.44%、0.49%、0.41%，在ZYYJQ1和ZYYJQ2组几乎未检出，表明该组样品的真菌群落结构与其他组相比有较大差异，存在特有的真菌群落。以上研究表明，9组藏药浴发酵酒曲样品间的微生物细菌门和真菌门存在差异，且相同菌门的相对丰度也有显著差异。

2.5 属分类水平样品微生物群落结构

如图4所示，图4是属分类水平上的各样品细菌群落结构，每一个颜色的柱子代表一个物种，每一个柱子的长短代表该物种在样品中所占比例的大小。其中平均相对丰度 > 1%的优势细菌属共有13种（见图4），分别为醋杆菌属（Acetobacter）、明串珠菌属（Leuconostoc）、unclassified_f_Enterobacteriaceae、泛菌属（Pantoea）、魏斯氏菌属（Weissella）、乳杆菌属（Lactobacillus）、植物乳植杆菌属（Lactiplantibacillus）、伴生乳杆菌属（Companilactobacillus）、肠球菌属（Enterococcus）、葡萄球菌属（Staphylococcus）、unclassified_d__Bacteria、广泛乳杆菌属（Latilactobacillus）和乳球菌属（Lactococcus）等。其中醋杆菌属在3组酒曲样品中都有较大占比，为第一优势菌属，平均相对丰度分别为79.16%、47.67%、35.40%。醋杆菌属是醋酸菌中的一个重要菌属。有研究表明^[21]，醋酸菌在发酵过程中会使葡萄糖氧化从而产成醋酸和乙醇，而醋酸有抑制细菌和病毒感染的作用，并且醋酸菌在发酵时会产生一层白色菌膜，可防止氧气和有害菌侵入发酵液。3组样品中的醋酸杆菌属是绝对的优势菌属，这可能会有效抑制其他杂菌的生长，保证藏药浴酒曲的发酵品质。明串珠菌属是ZYYJQ2样品中的优势菌属，相对丰度分别为11.46%、23.82%和28.31%；泛菌属在ZYYJQ2、ZYYJQ3组所有样品中占比较高，其平均相对丰度分别为4.10%、16.97%；肠球菌属为ZYYJQ3组样品中独有菌属，在其他2组样品中几乎未检出，其相对丰度分别为3.72%、3.57%和3.25%；由此可见，藏药浴发酵酒曲虽然共有大量核心细菌类群，但同一地区不同批次酒曲之间群落结构亦存在一定差异。这与谢军等^[23]的研究结果差异较大，这可能与不同地区酒曲在制作时受到原料或发酵条件等多种因素的影响有关。崔亮和李中华等^[23,24]研究表明明串珠菌属、魏斯氏菌属和乳杆菌属属于一类产乳酸细菌，且都属于厚壁菌门，是众多传统发酵制品中的优势菌群，这与我们的研究一致。成林等^[21]研究表明，乳酸菌在发酵过程中利用糖类产生大量的乳酸，乳酸再通过酯化酶的作用生成乳酸乙酯，乳酸菌的含量是评估酒曲品质的重要指标之一，酒曲中乳酸菌的含量越高对酒曲品质的影响就越大。明串珠菌属在3组样品中均占比较大，推测对藏药浴发酵酒曲品质有较大影响。马楠等^[25]研究指出，酒曲中微生物群落多样性越高，则发酵酒的风味和口感越丰富品质也就越高。综上所述可以推测出，醋酸菌和乳酸菌有较高的微生物多样性，是影响藏药浴发酵酒曲品质的关键菌属。

如图5所示，9组样品共检出3个相对丰度 > 1%的真菌菌属，分别为覆膜孢酵母属（Saccharomycopsis）、威克汉姆酵母菌属（Wickerhamomyces）和瑟氏哈萨克斯坦酵母菌属（Kazachstania）。覆膜孢酵母属属于酵母菌，在所有样品中相对丰度均高达93.02%以上，占有绝对优势。研究指出^[26]酵母菌作为一种天然发酵剂，可在发酵时通过糖类产生二氧化碳和乙醇，增加发酵食品中香气物质的含量，改善发酵的品质与风味，因此，推测覆膜孢酵母属是影响发酵品质的关键真菌属。侯强川等^[27]研究表明酵母菌是酒曲中乙醇的主要生产者，酒曲中酵母菌的丰度越高其发酵力越强。ZYYJQ1组样品除了覆膜孢酵母属外，威克汉姆酵母菌属也有较高的丰度。威克汉姆酵母属作为一种非酵母菌，可以产生各种水解酶，是发酵代谢产酯的主要微生物，对发酵也有至关重要的影响^[28]。瑟氏哈萨克斯坦酵母菌属为ZYYJQ1组样品中特有菌属，其相对丰度分别为0.92%；瑟氏哈萨克斯坦酵母菌属和毕赤酵母属（Pichia）在ZYYJQ1组样品中也占有一定的比例。ZYYJQ3组样品的优势菌属为覆膜孢酵母属其相对丰度分别为98.28%、97.41%和98.25%，其余大部分由威克汉姆酵母菌属构成。综上所述，西藏同一地区藏药浴发酵酒曲中的优势真菌属主要有覆膜孢酵母属、威克汉姆酵母菌属、瑟氏哈萨克斯坦酵母菌属，这与王玉荣等^[29]研究的非高原地区的酒曲结果差异较大，这可能与酒曲制作环境、使用的原材料以及发酵的季节等因素关系。

2.6 样品微生物Beta多样性分析

图6为不同组样品的主成分分析图（PCA）及聚类分析图（UPGMA），由PCA（图6 a）可知，主成分1贡献率为43%，主成分2贡献率为16.84%，累计贡献率为59.84%，已足够反映样品的综合信息。PCA（图6 a）中不同的点代表不同的样品，每个样品之间的距离代表相似程度，样品之间距离越小，表示其相似程度越高^[17]。ZYYJQ3组中所有样品在PCA（图6 a）中分散度较大，特别是ZYYJQ3组，表示该组内样品间差异度较高。ZYYJQ1组、ZYYJQ2组在PCA图中位于同一象限且分布较为集中，表示该组各样品间相似度较高。其中ZYYJQ2组所有样品在PCA图中十分紧密，表示该组样品的相似度最高。聚类分析（图6 b）显示，所有样品共可分为两大类，ZYYJQ1组所有样品可分为一类，ZYYJQ2组及ZYYJQ3组所有样品可分为一类。ZYYJQ1组的样品聚类较为集中，且树枝的长度较短，说明该样品间的相似的较高；ZYYJQ2组与ZYYJQ3组的所有样品树枝间长度较长，表明该样品间相似度较低。

如图7所示，为不同组样品的主成分分析图（PCA）及聚类分析图（UPGMA），结果显示，ZYYJQ2组所有样品与其他组样品在PCA图中的距离较远，表示该样品与其他样品的相似度较低；ZYYJQ3组中所有样品位于同一象限，距离十分紧密，表明该样品间相似性极高；由图7 b可知，ZYYJQ2组样品树枝间的长度较长，表明样品间相似度较低，与ZYYJQ1组、ZYYJQ3组差异较大。ZYYJQ3组和ZYYJQ1组的聚类较为集中，尤其是ZYYJQ3组，树枝间的长度较ZYYJQ2组较短，表明样品间相似度极高。与主成分分析图（PCA）所得出的结论一致。Beta多样性显示各样品间存在差异，但同组样品间有一定的相似性。以上结果表明，西藏同一地区藏药浴酒曲中微生物群落结构存在较大差异，这可能与藏药浴酒曲制作环境、发酵温度和原材料等因素密切相关。

3 结论

本研究主要通过高通量测序技术对藏药浴酒曲中微生物群落结构及多样性进行分析，获得了藏药浴酒曲中主要细菌属、真菌属种类及相对丰度占比，表明了藏药浴酒曲样品中群落结构的多样性和丰富度存在一定的差异。其中ZYYJQ1组样品中细菌属相对丰度最高，而ZYYJQ3组样品中细菌丰富度和多样性较低；ZYYJQ1组样品中真菌丰富度最高，而ZYYJQ3组样品中真菌丰富度和多样性最低。所有样品共有细菌OTUs数目80个，ZYYJQ3组特有OTUs数目最多，ZYYJQ2组特有OTUs数目最少。在属分类水平上，9个样品组藏药浴酒曲样品的细菌属富含丰富的微生物类群，而真菌属微生物群落丰富度较小。这与张二豪^[13]等对西藏不同地区青稞酒曲的微生物群落结构分析进行比较的发现结论一致。藏药浴酒曲的优势真菌属有覆膜孢酵母属和威克汉姆酵母菌属；优势细菌属有醋杆菌属、明串珠菌属和unclassified_f_Enter obacteriaceae菌属等。由此可知，虽然西藏同一地区藏药浴酒曲中微生物群落结构十分丰富，但优势菌群差异度较高。主成分分析表明，ZYYJQ1组和ZYYJQ2组样品间的细菌群落结构组成结构相似；ZYYJQ1、ZYYJQ3组样品中的真菌群落结构组成相似，而与ZYYJQ2组样品差异较大。综上所述表明，西藏同一地区藏药浴酒曲中的微生物群落结构存在一定差异，这可能与藏药浴酒曲生产批次的不同以及酒曲样本在制作过程中受季节温度变化的影响，从而改变微生物群落结构多样性及其功能等因素有关。本研究通过对藏药浴发酵酒曲中微生物群落结构组成及多样性研究，全面分析了藏药浴发酵酒曲中各类优势菌群和微生物的群落结构比例，对推动西藏地区民族特色藏药浴酒曲品质和产业化发展提供了理论参考。

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基金资助

中国科协科技援藏助力西藏藏医药产业高质量发展项目

西藏民族大学研究生科研创新与实践项目(Y2024011)