兽用 B超技术在西藏色瓦绵羊卵泡发育和妊娠检测中的应用

Application of Veterinary B-ultrasound Technology in Follicular Development and Pregnancy Detection of Xizang Sewa Sheep

摘要

为了给西藏地区兽医临床上应用兽用B超技术对色瓦绵羊卵泡发育及妊娠进行诊断提供B超影像及各项基础数据，本文对6只健康成年色瓦母绵羊在体、离体卵巢进行了卵泡发育B超检测以及屠宰验证，结果表明，在体可检测出三级以上卵泡，较低级别卵泡无法探测，对三级卵泡、成熟卵泡以及排卵前卵泡直径进行验证发现在体、离体监测以及屠宰验证无显著差异（ P > 0.05）；人工授精后37 - 40 d即可利用兽用B超仪观测囊胚期胎儿，第56 d- 63 d胎儿面积为（39.55 ± 1.07）cm ²，胎儿骨骼回声逐渐增强，第84 d- 98 d胎儿面积为（42.75 ± 12.66）cm ²，此时能够区分胎儿头部、躯干，第111 d- 120 d胎儿面积（113.05 ± 7.16）cm ²能够清楚观察到胎儿胎位、四肢、心率变化。因此，兽用B超技术可应用于色瓦绵羊成熟及以上卵泡以及妊娠的准确判断。

Abstract

In order to provide B-ultrasound images and various basic data for veterinary clinical application of veterinary B-ultrasound technology to diagnose the follicular development and pregnancy of Sewa sheep in Xizang, this research carried out follicular development B-ultrasound detection and slaughter verification on six healthy adult Sewa ewes’ ovaries in vivo and in vitro. The results showed that follicles of more than three levels could be detected in vivo, while those of lower levels could not be detected. There was no significant difference between in vivo and in vitro monitoring and slaughter verification ( P > 0.05) when the diameters of third level follicles, mature follicles and pre ovulation follicles were verified; After 37 - 40 days of artificial insemination, the blastocyst stage fetus could be observed using a veterinary ultrasound instrument. The fetal area from 56-63 days was （39.55 ± 1.07）cm ², and the fetal bone echo gradually increased. On 84 - 98 days, the fetal area was （42.75 ± 12.66）cm ², and the fetal head and torso could be distinguished. On 111-120 days, the fetal surface area was（113.05 ± 7.16）cm ², and changes in fetal position, limbs, and heart rate could be clearly observed. Therefore, veterinary ultrasound technology can be applied to accurately determine mature and above follicles as well as pregnancy in Seva sheep.

Graphical abstract

关键词

色瓦绵羊 / 兽用B超仪 / 卵泡 / 妊娠检测

Key words

Sewa sheep / Animal ultrasound equipment / Follicles / Pregnancy testing

色瓦绵羊作为西藏特有高原型藏羊，主要生活在平均海拔为4 800 m的西藏那曲市班戈县，其具有生长迅速 ^{[ 1]}、肉质营养价值高 ^{[ 2]}等优点，受到广泛关注。但其繁殖方式大多为自然交配，导致极大程度上延缓了良种化进程 ^{[ 3]}。众所周知，同期发情、人工授精等一系列人工扩繁技术能够提高家畜良种化进程，但无法避免家畜出现空怀现象。近年来，随着兽用B超技术的快速发展，因其能够对家畜卵泡发育、早期胚胎发育情况以及胎儿数量进行准确诊断，并降低家畜空怀率，使得其广泛运用于猪 ^{[ 4, 5]}、牛 ^{[ 6]}、犬 ^{[ 7]}、马 ^{[ 8]}、熊 ^{[ 9]}等动物的卵泡发育和妊娠情况监测中。兽用B超诊断技术作为非侵入性成像技术，在羊上运用也较为广泛。Tarcisio等 ^{[ 10]}在发情季节对母羊进行同期发情并且配合直肠超声波进行诊断，验证了直肠超声可以在发情时诊断卵泡的发育。Asrat等 ^{[ 11]}利用直肠B超对Bonga羊卵泡进行监测发现，高产羊相较于低产羊具有较大卵泡。Rodolfo等 ^{[ 12]}在发情季节将母羊和公羊放置在一起，并通过直肠超声进行诊断后发现，公羊和母羊放置在一起时其卵泡发育会更快。除运用于羊的卵泡监测外，还运用于绵羊妊娠诊断中。Jessica ^{[ 13]}、Schmid ^{[ 14]}使用直肠超声诊断对不同羊群进行妊娠诊断发现其准确率均在90%以上。Karen等 ^{[ 15]}对150只怀孕山羊分别采用直肠超声和腹部超声诊断，发现采用直肠超声诊断对人工授精后24 d - 29 d准确率最高，腹部超声诊断39 d - 51 d准确率最高。Arashiro等 ^{[ 16]}对人工授精后妊娠母羊相关参数进行评估，发现授精后17 d以及45 d具有高效的预测准确度。兽用B超还可对胎儿发育规律进行检测，Pridcila等 ^{[ 17]}研究发现在妊娠期间，监测胎儿肱骨长度、心脏面积、颈部到鼻子距离，可作为异常发育参考值。Amanda等 ^{[ 18]}通过对两个月胎羊胎儿心脏图像进行超声诊断发现，超声诊断可对心脏发育进行监测并识别早期胎儿活力。Katsusuke等 ^{[ 19]}用B超对15只胎羊进行168次测量，发现可通过静脉流量与宫外环境相关性预测胎儿的发育。Farhana等 ^{[ 20]}研究发现使用兽用B超仪对胎儿躯干直径进行监测，可估算胎龄以及预产期。Victor等 ^{[ 21]}使用兽用B超仪对山羊妊娠期间胎儿各项参数进行监测，发现胎儿结构测量值和胎龄之间存在相关性。Mariana等 ^{[ 22]}研究发现利用超声诊断技术，有助于确定母羊胎儿发育情况和分娩时间。但兽用B超诊断技术在西藏色瓦绵羊上的运用未见报道。

因此，本研究以西藏那曲市班戈县色瓦绵羊为研究对象，应用B超技术对其卵泡发育、妊娠情况进行检测，以期在丰富西藏色瓦绵羊研究水平的同时，为西藏色瓦绵羊人工授精、胚胎移植研究等提供影像以及数据参考。

1 材料与方法

1.1 试验仪器

便携式3.5 MH兽用B超仪（型号：SonoStar V6）购自广州索诺星信息科技有限公司；羊毛剪购自邢台博泉机械科技有限公司；耦合剂购自佛山市平创医疗科技有限公司；游标卡尺购自东智创重工科技有限公司。

1.2 试验动物及保定

选择6只处于发情期的、健康的3岁至4岁藏系母羊进行卵泡发育检测实验；选择3只人工授精后处于妊娠期的、健康的3岁至4岁色瓦绵羊母羊（饲养于西藏农牧学院动物养殖基地）进行妊娠检测实验。

半仰卧保定：试验助手分别抓住色瓦绵羊母羊的前肢和后肢，向同侧抬起并翻转母羊，使母羊呈半仰卧姿态。

站立保定：试验助手抓住母羊的羊角或用绳子将母羊的角固定在结实的树桩等物体上，并在母羊一侧抵住母羊，使其在原地保持站立。

1.3 色瓦绵羊卵泡发育监测

1.3.1 兽用B超仪检测在体卵泡发育

选择母羊腹股沟无毛区位置进行兽用B超检测。以探头中心为圆心，紧贴皮肤缓慢滑动。保存相应图像并记录相关数据。

1.3.2 兽用B超仪检测离体卵泡发育

屠宰后采集双侧卵巢，用PBS反复冲洗，去除掉卵巢上的血污。将清洗后的卵巢放入水中，将B超探头悬浮在卵泡上方3 cm~ 4 cm的位置，反复调整卵巢和探头之间的距离、方向，使B超仪图像清晰保存相应图像并记录相关数据。

1.3.3 游标卡尺测量

将清洗后的卵巢置于白色纱布上，用游标卡尺分别对同一只母羊双侧卵巢上的三级卵泡、成熟卵泡和排卵前卵泡进行直径测量。

1.4 兽用B超技术检测色瓦绵羊妊娠情况

在色瓦绵羊母羊人工授精后每隔7 d - 10 d进行1次B超检测，对比不同时期色瓦绵羊胎儿B超图像，以达到监测胎儿生长发育的目的。每次检测选择色瓦绵羊母羊腹股沟无毛区位置进行B超检测。将耦合剂均匀涂抹在母羊腹股沟位置，B超探头紧贴母羊腹股沟皮肤以扇形扫描法进行探测。当在B超仪上观测到母羊子宫及胎儿的位置时，调整图像至清晰，测量并记录胎儿的体长及面积。

1.5 统计分析

使用SPSS 27.0系统中的单因素ANOVA检验对各级卵泡直径进行统计分析；平均值检验对胎儿体长、面积进行统计分析。结果以平均值±标准差（ \overline{\mathit{X}} ± SD）表示。 P < 0.05为差异显著。

2 结果

2.1 色瓦绵羊卵泡发育检测结果

利用兽用B超仪对色瓦成年母绵羊在体与离体卵巢上的卵泡发育情况进行检测，结果见 表1，典型影像见 图1，从中可以看出，在体可检测到三级、成熟、排卵前卵泡壁为强回声（图像为亮区），而较低级别的卵泡不易探测到；为了进一步验证在体检测的准确性，屠宰后采集卵巢置于水中，利用兽用B超仪再次探测，并利用游标卡尺在表面逐个测量，统计卵泡直径，结果表明在体兽用B超仪测得三级、成熟、排卵前卵泡直径与离体探测和解剖测量测得的卵泡直径差异均不显著（ P > 0.05）。

along with slaughter verification and judgment criteria.

2.2 色瓦绵羊妊娠检测结果

在色瓦母绵羊人工授精后每隔7 d - 10 d进行一次B超检测，发现于37 d - 40 d 可探测到孕囊回声，45 d开始可以清晰探测到胎儿回声，对45 d - 50 d、56 d - 63 d、84 d - 98 d、100 d - 110 d、111 d - 120 d和121 d - 140 d的胎儿体长、面积等数据记录，而121 d - 140 d时，由于胎儿面积过大故兽用B超仪无法观测到整个胎儿，故未进行体长、面积测定。具体结果见 图2和 表2，从中可以看出：色瓦绵羊空怀（ 图2A）时，子宫体较短，子宫颈壁厚而坚实。而出现妊娠时，母羊子宫空间比空怀母羊子宫空间大，且子宫颈闭合。妊娠37 d - 40 d（ 图2B）B超检测时，子宫颈闭合，出现黑色液体回声区和白色固体回声区，可见子宫内胎儿处于囊胚期，该时期胎儿轮廓较为清晰，但难以区分胎儿的头部和躯干。通过测量发现此时胎儿体长为2.37 cm ± 0.67 cm，胎儿面积为（2.33 ± 0.71）cm ²。色瓦绵羊妊娠45 d - 50 d（ 图2C），胎儿发育正常，胎儿体长为6.17 cm ± 0.33 cm，胎儿面积为（7.88 ± 2.91）cm ²；此时子宫内黑色液体回声区和白色固体回声区扩大，胎儿骨骼回声不强烈。妊娠56 d - 63 d（ 图2D），胎儿体长为7.96 cm ± 0.45 cm，胎儿面积为（39.55 ±1.07 ）cm ²；胎儿骨骼回声较为强烈，但对于区分胎儿各部分骨骼方面仍比较模糊。色瓦绵羊妊娠84 d - 98 d（ 图2E）时，黑色液体回声区和白色固体回声区范围扩大，子宫内胎儿清晰可见，胎儿体长为9.03 cm ± 1.44 cm，胎儿面积为（42.75 ± 12.66）cm ²，可区分胎儿头部与躯干，躯干回声强烈。妊娠100 d - 110 d（ 图2F），胎儿体长为15.44 cm ± 0.18 cm，胎儿面积为（73.10 ± 3.62）cm ²胎儿骨骼回声加强，可区分胎儿躯干和四肢。色瓦绵羊妊娠111 d - 120 d（ 图2G）时，黑色液体回声区和白色固体回声区范围明显扩大，子宫内胎儿清晰可见，胎儿体长为23.88 cm ± 1.51 cm，胎儿面积为（113.05 ± 7.16）cm ²，可区分胎儿头部与躯干，躯干回声强烈，可区分胎儿各部位骨骼情况，同时可判断胎儿体位等情况。妊娠120 d - 140 d（ 图2H），通过B超检测无法在画面中观测到整个胎儿的全貌，胎儿骨骼回声加强，胎儿四肢和躯干更易区分。此阶段可观察到胎儿的心跳等数据，通过测量发现此阶段胎儿的心脏大小为（4.29 ± 1.71）cm ²，心跳次数为（98 ± 9）次/min。

3 讨论

3.1 色瓦绵羊卵泡发育检测

随着兽用B超诊断技术日趋完善，对于绵羊发情兽用B超诊断技术也逐渐成熟。兽用B超诊断发情主要是利用超声监测羊卵泡内部无声区，测量卵泡直径诊断其是否发情。据报道，绵羊卵泡在3 mm以下时可认定为卵泡处于发育阶段，3 mm ~ 5 mm为成熟卵泡，5 mm以上为排卵前卵泡 ^{[ 23]}；在藏绵羊中，已对卵泡进行分级区分 ^{[ 24]}。在本研究中，应用B超技术可观察到相应阶段的卵泡。通过对不同卵泡进行区分后，发现活体B超、卵巢离体B超、屠宰验证所观察到的不同阶段卵泡直径较为接近，其中成熟卵泡直径为4.73 mm ± 0.18 mm，排卵前卵泡直径7.20 mm ± 1.71 mm。郭亚军等 ^{[ 24]}体外观察所测到的藏绵羊成熟卵泡直径4.4 mm ~ 5.6 mm接近。Tarcisio等 ^{[ 11]}对绵羊采用同期发情技术并利用B超对绵羊卵泡大小监测发现其发情期卵泡直径为6.3 mm ± 0.7 mm；Asrat等 ^{[ 12]}对邦加绵羊同期发情处理后进行B超监测发现，其排卵卵泡直径 > 6 mm；Rodolfo等 ^{[ 25]}对同期发情母羊采用兽用B超诊断其卵泡直径发现，排卵卵泡直径为 （5.1 ± 0.3）mm ~ （5.5 ± 0.4）mm。本试验对于排卵前卵泡直径测定结果与上述结果有一定差别，已有研究证明孕激素浓度增加会降低黄体生成素的合成，进而导致卵泡直径变小 ^{[ 26]}。

3.2 色瓦绵羊妊娠检测

兽用B超诊断技术在妊娠诊断以及胎儿监测运用早于发情B超诊断技术，且更加成熟。Karen等 ^{[ 15]}对150只怀孕山羊采用腹部超声诊断，发现腹部超声诊断39 d - 51 d准确率最高。有报道称，腹部B超在妊娠一个月左右时可观察到早期胚胎 ^{[ 27]}，在实际应用中，Jones ^{[ 28]}对配种后33 d - 45 d母羊进行妊娠诊断发现其准确率达90%，随着妊娠时间增加准确率也随之升高。多浪羊 ^{[ 29]}配种后28 d可通过B超观测到孕囊的出现；波尔山羊 ^{[ 30]}在胚胎移植后32 d - 45 d能够通过B超确诊为妊娠；蒙古羊 ^{[ 31]}在第21 d可通过B超诊断看到模糊胚胎，第25 d时可以看到孕囊，与本研究的人工授精37 d - 40 d检测到的孕囊时间基本接近。AK Jones1等 ^{[ 21]}通过对45 d以及90 d的绵羊胎儿进行监测发现在45 d时胎儿的面积为（7.36 ± 0.44）cm ²、90 d胎儿面积（10.88 ± 0.50）cm ²；本研究中45 d - 50 d以及84 d - 90 d中胎儿面积与上述结果基本一致。

4 结论

利用兽用B超技术对西藏色瓦绵羊卵巢卵泡进行在体、离体兽用B超监测以及屠宰验证，发现在体可检测出三级以上卵泡，较低级别卵泡无法探测，且其成熟卵泡大小为4.73 mm ± 0.18 mm、排卵前卵泡大小为7.20 mm ± 1.71 mm；同时对人工授精后的胎儿发育进行了监测，在授精后37 d - 40 d可监测出孕囊；第56 d - 63 d时胎儿的面积为39.55 cm ± 1.07 cm，胎儿的骨骼有逐渐显现；第84 d - 98 d胎儿面积为（42.75 ± 12.66）cm ²，此时能够区分胎儿头部、躯干；第111 d - 120 d胎儿面积（113.05 ± 7.16）cm ²此时能够清楚观察到胎儿胎位、四肢、心率变化。为兽医临床应用提供影像以及数据资料。

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基金资助

西藏自治区科技厅区域科技协同创新专项项目(QYXTZX-NQ2021-01)

西藏农牧学院大学生创新创业训练计划项目(2023-12)