饲料中添加不同浓度百合珠芽对西藏藏猪卵巢卵泡发育及LncRNA表达的影响

Effects of Adding Different Concentrations of The Bulbils of Lilium Lancifolium Supplementation to Feed on Follicle Development and LncRNA Expression in the Ovary of Xizang Pigs

摘要

本研究旨在揭示基础日粮中不同浓度的卷丹百合珠芽对藏猪卵巢卵泡发育及相关LncRNA表达的影响。将同一批次健康的体重为（17.40 ± 1.15） kg的9头雌性西藏藏猪，随机分为BW组（基础日粮）、BY组（基础日粮+ 1%百合珠芽）和BR组（基础日粮+ 2%百合珠芽），饲喂6周后，利用石蜡切片HE染色观察卵巢形态，测定卵巢器官指数和不同类型卵泡数量，并利用高通量测序技术对lncRNA进行转录组测序分析，最后对差异lncRNA进行荧光定量验证。结果显示：（1）卵巢表面与卵泡特征：BR组，藏猪卵巢表面出现大卵泡；卵巢指数，各组间无显著差异；卵泡比例，BW组原始卵泡比例最高，BY组二级卵泡比例最高，BR组成熟卵泡比例最高。（2）lncRNA筛选与表达：新预测lncRNA，筛选出5 772个新预测的lncRNA；表达量分析，BY组平均表达量最高，BW组最低，3组表达趋势相似；组间相关性，BY组、BW组和BR组3个组间相关性较强。（3）差异表达分析：BW_vs_BY，筛选到2 021个差异表达lncRNA基因（BY组相对BW组上调1 197个，下调824个）；BW_vs_BR，筛选到1 308个差异表达lncRNA基因（BR组相对BW组上调829个，下调479个）；BY_vs_BR，筛选到1 330个差异表达lncRNA基因（BR组相对BY组上调646个，下调684个）。（4）lncRNA靶基因预测与功能分析：靶基因预测，预测得到CCNL2、MAP3K14、STUB1、IQANK1和PKP3；靶基因GO和KEGG富集分析，发现cAMP、MAPK、PI3K-Akt、Wnt等与卵巢发育信号相关的通路都被显著富集到，其中相关信号通路的基因有LOC110261342、MSTRG.26467、FXN、CLP1、Gem、PODNL1、TGFBR3L等。结果表明，在饲料中添加百合珠芽（特别是2%浓度）有助于促进藏猪卵巢成熟卵泡的发育，并显著调控lncRNA表达，参与卵巢发育的多条生物学通路，为进一步理解百合珠芽对藏猪生殖能力的提升提供了基础数据和理论支持。

Abstract

This study aimed to reveal the effects of different concentrations of the bulbils of Lilium lancifolium in the basic diet on the development of ovarian follicles and the expression of related lncrnas in Xizang pigs. Xizang pigs were used as the research object, and the same batch of nine healthy Xizang pigs with a weight of (17.40 ± 1.15) kg was randomly divided into three groups, of which the BW group was the control group, fed on the basal diet, the BY group and the BR group were the experimental groups, with 1% concentration lily bead buds and 2% concentration lily bead buds added to the basal diet, respectively, and after 6 weeks of experimental feeding, morphological observation, ovarian organ index measurement, and statistics of the number of different types of follicles in the ovaries were carried out to judge the ovarian development. The high-throughput omics transcriptome technology was used to sequence the ovarian LncRNA, and the differential LncRNA was verified in time quantitatively to verify the reliability of the transcriptome sequencing results. The results showed that Ovarian surface and follicle characteristics: In the BR group, large follicles appeared on the ovarian surface of Xizang pigs; there was no significant difference in the ovarian index among the groups. Follicle ratio analysis revealed that the BW group had the highest proportion of primordial follicles, the BY group had the highest proportion of secondary follicles, and the BR group had the highest proportion of mature follicles. LncRNA screening and expression revealed 5,772 new lncRNAs. Expression analysis revealed that the BY group displayed the highest average expression level, whereas the BW group had the lowest expression level, and the three groups had similar expression trends, with strong correlations among the BY, BW, and BR groups. Differential expression analysis revealed that the BW vs. BY comparison identified 2,021 differentially expressed lncRNA genes (1,197 upregulated and 824 downregulated in the BY group compared with the BW group); the BW vs. BR comparison identified 1,308 differentially expressed lncRNA genes (829 upregulated and 479 downregulated in the BR group compared with the BW group); the BY vs. BR comparison screened 1,330 differentially expressed lncRNA genes (646 upregulated and 684 downregulated in the BR group compared with the BY group); and LncRNA target gene prediction and functional analysis: Target gene prediction identified CCNL2, MAP3K14, STUB1, IQANK1, and PKP3. GO and KEGG enrichment analyses of target genes revealed significant enrichment of cAMP, MAPK, PI3K-Akt, Wnt, and other ovarian development signaling pathways. The genes related to these pathways included LOC110261342, MSTRG.26467, FXN, CLP1, Gem, PODNL1, and TGFBR3L. The results showed that the addition of Lilium bulbiferous bulbs to the diet, especially at a 2% concentration, promoted the development of mature ovarian follicles in Xizang pigs and significantly regulated the expression of long noncoding RNAs (lncRNAs), which were involved in multiple biological pathways related to ovarian development. These results indicated that this study would provide fundamental data and theoretical support for further understanding the enhancement of Xizang pig reproductive capacity by Lilium bulbiferous bulbs.

Graphical abstract

关键词

lncRNA / 卷丹百合珠芽 / 西藏藏猪 / 靶基因

Key words

Long Noncoding RNA / Lilium bulbiferous bulbs / Xizang pigs / Target genes

中国是百合的重要产地，拥有丰富的百合资源，约占全世界百合种类的一半^[1]。鳞茎是百合常见的食用和药用部分，珠芽是百合的一种特殊繁殖器官，具有与种子类似的功能。百合鳞茎的研究较多，对百合珠芽的研究较少，主要集中在卷丹等品种^[2]。百合珠芽的粗脂肪含量低，粗纤维含量高。含有较高的总酚、总黄酮及皂苷，生物碱含量低^[3]。百合珠芽中的薯蓣皂苷元^[4]对胃癌细胞有较强的抑制作用，对肺癌细胞有微弱抑制作用^[2]。薯蓣皂苷元能通过增加初级卵泡数和血清AMH水平，改善自然衰老小鼠的卵巢储备功能^[5]。百合珠芽中的多糖具有多种健康效益，如抗肿瘤、降血糖、抗氧化、增强免疫力等。百合渣作为饲料添加剂，对三黄肉鸡的生产性能与屠宰性能有积极影响^[6]。

卵巢是确保卵子生成和雌激素分泌的重要器官。在不同发育和排卵阶段，卵巢内存在许多相关的转录本，转录组学研究这些转录本可以揭示基因表达和调控规律，转录组包括所有的mRNA和非编码RNA，非编码RNA（如miRNA、LncRNA和circRNA）对mRNA的转录水平具有调控作用^[7]。全转录组测序技术能够全面分析样本中各种类型RNA的表达情况，构建它们之间的调控网络，从而系统地分析特定细胞或组织的生物学特征^[8]。随着高通量测序成本的降低，越来越多的研究应用转录组学探讨畜禽卵巢发育的调控机制。例如，贵州香猪卵巢中发现34个miRNA差异表达^[9]；奶山羊卵巢中发情期和发情间期有772个circRNA差异表达^[10]；母鸭卵巢中鉴定了调控排卵的关键基因及其信号通路^[11]；伊犁鹅卵巢中通过转录组筛选出8个差异表达基因^[12]。李加宇^[13]在小鼠不同发情期发现3个卵巢中高表达的特异性lncRNA（lncRNA647、lncRNA147和lncRNA274）。薛倩^[14]通过转录组测序，筛选出狼山鸡高、低近交群体下丘脑和卵巢中215个差异表达lncRNA，预测到414个靶基因，涉及卵母细胞减数分裂、MAPK和叶酸合成等信号通路。徐高晓^[15]基于全转录组学技术筛选出猪卵巢中302个差异表达lncRNA，其中4个关键lncRNA（LOC110259814、LOC106504714、LOC106505099、LOC110257180）与卵巢发育和类固醇激素合成相关，并通过RT-qPCR验证。

然而对于百合珠芽研究较少，资源浪费严重。藏猪是西藏重要的经济畜种，随着国家对种质资源保护的重视及养殖需求的增加，对藏猪的研究亟需加强。由于藏猪生长慢、繁殖力弱，卵巢发育研究尤为关键。本试验利用石蜡切片HE染色和高通量组学技术，分析不同浓度百合珠芽饲喂对藏猪卵巢发育及差异LncRNA的影响，为提升藏猪繁殖力及产业发展提供了基础数据和参考方案。

1 材料与方法

1.1 样品的收集与处理

试验动物由林芝市西藏农牧学院教学实习牧场（29°35′N，94°25′E）提供的同一批次的3月龄母藏猪。卷丹百合珠芽( Lilium lancifolium Thunb)（卷丹百合,学名斑百合,为百合科合属多年生草本球根植物；卷丹百合叶子上的珠子是珠芽，简称卷丹百合珠芽）是取自西藏农牧学院植物科学学院实习基地（29°57′N，94°45′E）。体重相近（17.40 ± 1.15） kg的9头母藏猪分为3组（每组3个重复），BW组为对照组（基础饲粮），BY组（基础饲粮+ 1%浓度百合珠芽）和BR组（基础饲粮 + 2%浓度百合珠芽）为试验组。试验饲喂6周后进行宰杀，宰杀前活体称重，采取两侧卵巢，对卵巢外观进行肉眼观测和拍照来记录卵巢的发育情况，对右侧卵巢称重，将部分左侧卵巢放置到4%多聚甲醛内固定，移置4 ℃冰箱内进行储存，用于石蜡切片HE染色的形态学观察。同时将剩余左侧卵巢立即冷冻并储存在-80 ℃冰箱，用于转录组的测序。

1.2 卵巢发育指标测定

（1）肉眼观察和拍照记录卵巢形态发育情况；

（2）计算器官指数，对右侧卵巢称重计算每头母藏猪的卵巢器官指数，器官指数的计算见公式（1）；

卵巢器官指数( g/g )=卵巢器官重量( g )/猪活体重量( g )（1）

（3）通过石蜡切片HE染色统计不同类型卵泡的比例来分析卵巢发育状况。本文试验统计的卵泡类型分为3种，分别是原卵泡、二级卵泡（初级卵泡和次级卵泡）、和成熟卵泡。使用正置显微镜对每张卵巢切片中有卵母细胞核的卵泡进行观察计数。不同类型的卵泡的计算见公式（2）：

每种类型卵泡的比例＝每种卵泡的数量/所有卵泡的数量（2）

1.3 卵巢石蜡切片制备与HE染色

每头猪选取3到5张切片，在20 ×放大倍数下，每个切片选取8到12个视野进行卵泡计数，对于不同的卵泡进行统计和计数。

1.3.1 石蜡切片

（1）固定：用生理盐水清洗左侧卵巢后，立即投入4%多聚甲醛固定。

（2）修整：将固定的卵巢组织修整为1.0 × 1.0 × 0.5 cm大小，放入标记好的包埋盒。

（3）冲洗：将包埋盒中的卵巢组织在流水下冲洗12 h。

（4）脱水：依次用70%、80%、90%、95%（2次）、100%（2次）无水乙醇溶液各漂洗30 min。

（5）透明：用1:1混合的无水乙醇与二甲苯溶液浸泡2 h，再用二甲苯浸泡至组织透明。

（6）浸蜡：在68 ℃下，将卵巢组织放入融化的液体石蜡中浸泡3 h。

（7）包埋：将组织转入新蜡中包埋盒，放置在4 ℃冰箱中凝固并标记。

（8）切片：修整蜡块，露出卵巢组织，调整切片机，切片厚度为5 μm，进行连续切片。

（9）烘片：在42 ℃水浴锅中展开薄片，用载玻片捞取，并在38 ℃下烘干。

1.3.2 HE染色

（1）脱蜡：将切片依次浸泡于二甲苯Ⅰ、二甲苯Ⅱ（各20 min）、100%乙醇Ⅰ、100%乙醇Ⅱ、95%乙醇、90%乙醇、80%乙醇、70%乙醇（各2 min），最后用自来水冲洗10 min。

（2）染色：使用苏木精-伊红（HE）染色液按照说明书染色。

（3）脱水：依次用95%乙醇Ⅱ、100%乙醇Ⅰ、100%乙醇Ⅱ、100%乙醇Ⅲ（各2 min），二甲苯Ⅰ、二甲苯Ⅱ（各15 min）脱水。

（4）封片：在载玻片上滴加中性树脂封片，确保无气泡。

1.4 试验方法

1.4.1 RNA的提取与检测

使用RNA提取试剂盒（DP451，TIANGEN，中国）提取RNA，相关步骤见试剂盒提取操作说明。提取的RNA通过电泳检测完整性，并用Nano Drop（Nano Drop 8000，Thermo Fisher Scientific，中国）分光光度计检测OD值，以评估RNA提取的效果和质量是否符合后续实验要求。

1.4.2 文库构建和质控

通过探针去除rRNA后，用磁珠纯化mRNA和LncRNA，金属离子溶液处理法打断RNA。以片段化RNA为模板，随机引物在逆转录酶体系中合成cDNA第一链，再合成二链，修复末端并加A尾。用T4 DNA连接酶连接接头，磁珠纯化接头连接产物，筛选300 - 350 bp的cDNA片段。进行PCR扩增加样本标签，纯化RNA产物构建文库。文库检测合格后进行测序。

1.4.3 数据预处理及分析

使用fastp软件对原始测序数据进行质控，过滤掉3´端接头污染、含较多无法确定碱基信息的reads，以及低质量序列，以确保后续信息分析的准确性。

1.4.4 参考序列比对

使用hisat2将clean data与参考基因组进行比对，获得全面的转录本信息。

1.4.5 LncRNA筛选

选择长度 ≥ 200 bp，exon ≥ 2；通过Stringtie计算每条转录本的reads覆盖度，选择Reads最小覆盖度≥ 3的转录本；通过与已知非lncRNA基因比较过滤掉非lncRNA基因，并利用cuffcompare的结果进行位置筛选（对不同种类的lncRNA选择不同的class_code）。基于以上初步筛选，进一步进行LncRNA编码潜能的筛选，分别进行了如下4个方面的分析，主要包括：CPC分析、CNCI分析、pfam蛋白结构域分析、PLEK分析。

1.4.6 LncRNA表达量统计和差异分析

使用featurecounts对lncRNA基因进行表达量的计算，同时进行了样本间重复相关性检测，使试验结果更具有统计学意义。使用DESeq2软件进行差异表达分析，对差异检验的pvalue作多重假设检验校正，通过控制FDR（False Discovery Rate）来决定p-value的阈值。本试验中差异基因筛选阈值为p-value小于0.05 Foldchange绝对值大于2。

1.4.7 LncRNA靶基因预测

在预测lncRNA靶基因时，我们采用了两种方法：cis作用和共表达预测。cis作用假设lncRNA的功能与其邻近的蛋白编码基因相关，这些lncRNA可能与启动子或其他顺式作用元件重叠，调控基因的转录或转录后水平。因此，我们筛选了lncRNA上下游0 ~ 100 k范围内的蛋白编码基因，并进行功能富集分析来推测lncRNA的功能。共表达预测则认为lncRNA的功能与编码基因的相对位置无关，而与共表达的蛋白编码基因相关。我们使用WGCNA（加权相关网络分析）分析mRNA测序数据，构建lncRNA和蛋白编码基因的共表达网络，以捕捉它们在表达水平上的相互关系。最终，我们结合了cis作用和共表达预测的结果，取其交集，以确定lncRNA的潜在靶基因。

1.4.8 差异LncRNA靶基因富集分析

我们采用clusterProfiler软件进行GO和KEGG富集分析，以P-adjust（FDR） < 0.05作为筛选显著富集结果的阈值，找出差异lncRNA靶基因中显著富集的GO Term和KEGG Pathway。

2 结果与分析

2.1 卵巢形态、指数和不同类型卵泡比例统计分析

3组卵巢形态见图1a。由图可知，卵巢均呈椭圆形，表面布满大小不一的卵泡。BR组（添加2%百合珠芽）有凸出的卵泡。卵巢表面有毛细血管，均为淡红色，BW组（对照）卵巢颜色较浅。藏猪卵巢重量及卵巢指数的变化（表1），添加不同浓度的百合珠芽，卵巢重量无显著差异（P > 0.05），BW组（对照）卵巢重量最高，BR组（2%百合珠芽）卵巢重量最低。3组卵巢器官指数无显著差异（P > 0.05）。

20倍物镜下不同类型卵泡的切片（图1b）。Primitive follicle（原始卵泡），紧贴皮质外层，数量多而体积小，内含初级卵母细胞，外层为单层扁平卵泡细胞。Secondary follicle（二级卵泡）（包括初级和次级卵泡）体积较大，单层扁平细胞变为多层立方细胞，出现红色透明带和白色卵泡腔，卵母细胞偏向一侧形成丘状，周围有放射冠。成熟卵泡腔大，突出于卵巢，显示排卵趋势。根据卵巢切片测量，原始卵泡直径为（25.7 ± 2.6） μm，初级卵泡直径为（54.4 ± 5.6） μm。不同浓度百合珠芽对藏猪卵泡数量的影响（表2）。添加百合珠芽后，原始卵泡比例显著减少（P < 0.05）；二级卵泡在BY组（1%浓度）显著增加，在BR组（2%浓度）显著减少。成熟卵泡在BR组比例最高，与其他组差异显著（P < 0.05）。

2.2 RNA的质量检测

分光光度计检测显示RNA样品的A260/A280比值在1.9至2.0之间，表明纯度达标，无污染。琼脂糖凝胶电泳显示条带清晰（图2），验证RNA完整性高，符合后续试验要求。

由表3可知，所有样品的RNA浓度在200 ~ 298 ng/μL之间，RIN值为8.2 ~ 9.0，质检结果为A类，符合后续试验标准。实验室检测标准要求RIN值大于8可用于lncRNA检测。

2.3 碱基质量分布

不同样本（BR1、BR2、BR3、BW1、BW2、BW3、BY1、BY2、BY3）在read1和read2中的碱基含量分布情况（图3）。所有样本的read1和read2在前几个碱基位置上都有显著波动，这是测序开始时的常见现象。初始波动后，所有样本的碱基含量分布趋于稳定，表现出一致性和均衡性。A和T的含量普遍较低，G和C的含量较高，并在读数的中段和后段保持稳定。

总体而言，这些图表展示的测序数据质量较好，碱基含量在初始波动后趋于稳定，比例均衡且一致，表明数据可靠性高。

2.4 参考序列比对

LncRNA比对情况统计：使用hisat2比对clean data与参考基因组，由表4可知BY1-3、BW1-3及BR1-3样品的序列匹配比例介于86.28% ~ 91.82%。具有多个比对位置的序列占比不超过9.97%，唯一比对位置的序列占比不低于74.61%，表明样本质量较高，适合用于后续的基因组分析。

reads在参考基因组不同区域的分布情况：测序序列分布统计揭示了序列在参考基因组的CDS区、基因间区和内含子区的定位。内含子区的Reads可能因可变剪接而保留，基因间区的Reads可能表示未注释的基因或背景噪声，可能是新基因或新LncRNA的迹象。图4表明，CDS区的定位比例最高，这符合预期试验结果。

2.5 LncRNA编码潜能预测

由图5可知，基于CPC分析、CNCI分析、pfam蛋白结构域分析、PLEK分析，将4种预测工具得到的LncRNA求交集，作为预测到新的LncRNA，最终得到5 772个新预测的LncRNA；所有样本中，新发现lncRNA数量显著高于已知lncRNA，表明在这些样本中存在大量未被注释的lncRNA，或特定条件下新lncRNA的活跃表达。

各组样本的基因表达量分布总体一致，重复性良好（图6 a）。同一组内的样本相关性高，说明试验条件和技术重复性较好（图6b、6c）。PCA分析显示组间存在一定的差异（图6 d），这可能与组别特定的生物学特性相关。

2.6 LncRNA差异表达量分析

由表5可知，BW_vs_BY，筛选到2 021个差异表达lncRNA基因（BY组相对BW组上调1 197个，下调824个）；BW_vs_BR，筛选到1 308个差异表达lncRNA基因（BR组相对BW组上调829个，下调479个）；BY_vs_BR，筛选到1 330个差异表达lncRNA基因（BR组相对BY组上调646个，下调684个）。以上表明不同组之间存在显著的基因表达差异。

BW_vs_BY 组之间的差异表达基因数量最多，差异最显著（图7 c）。BY_vs_BR 和 BW_vs_BR 组之间的差异表达基因数量相对较少（图7a，7e），但仍然存在显著差异。聚类分析的结果与火山图一致（图7b，7d，7f），验证了不同组之间基因表达的显著性差异。

2.7 LncRNA靶基因预测

我们通过cis作用和共表达预测这种综合预测方法，确定了以下5种基因作为lncRNA的靶基因（表6）：CCNL2、MAP3K14、STUB1、IQANK1和PKP3。这些基因在调控网络中可能扮演着关键角色，为进一步研究lncRNA的功能及其在生物过程中的调控机制提供了重要线索。

2.8 差异lncRNA靶基因富集分析

我们使用clusterProfiler软件进行GO富集分析，结果表明，BW_vs_BY靶基因共富集到160条GO条目，BW_vs_BR共富集到127条GO富集条目，BY_vs_BR共富集到101条GO富集条目，选取每组的前20个富集条目统计分析，发现3组当中富集到分子功能的GO条目占比最多，细胞组分占比最少（图8 b，d，f），推测与分子功能过程关联比较大；其中3组共同富集到的GO条目为跨膜转运蛋白活性、染色体、多细胞生物发育、金属内肽酶活性（metalloendopeptidase activity）、蛋白水解（图8 a，8 c，8e）。

与GO富集分析类似，基于差异分析和KEGG注释结果，使用clusterProfiler软件并以P-value < 0.05为阈值，识别显著富集的KEGG通路。BW_vs_BY靶基因富集122条KEGG条目，BW_vs_BR靶基因117条，BY_vs_BR靶基因97条。选取各组前20条富集条目分析（图9），各组均有与卵巢发育相关的通路，如cAMP信号通路、MAPK信号通路、PI3K-Akt信号通路、Wnt信号通路等，发现相关基因包括LOC110261342、MSTRG.26467、FXN、CLP1、Gem、PODNL1、TGFBR3L等。3组共同富集条目有糖鞘脂生物合成-globo和isoglobo系列、Ras信号转导通路、胰高血糖素信号通路、酪氨酸代谢途径、C型凝集素受体信号通路。

3 讨论

3.1 饲料中添加不同浓度百合珠芽对藏猪的卵巢发育分析

猪的卵巢在发育过程中，其形态和重量会随体重增加而变化。本次屠宰的西藏藏猪体重在20 ~ 33 kg之间，卵巢重量为（2.04 ± 0.72） g至（3.03 ± 1.31） g，与吕学斌等人^[16]的研究结果相近。试验发现，添加百合珠芽后，藏猪卵巢重量和器官指数无显著变化，说明百合珠芽对藏猪卵巢重量无影响。卵泡由相互依赖的细胞类型组成，包括卵母细胞、卵丘细胞、颗粒细胞和膜细胞。从原始卵泡到排卵，卵泡细胞和卵母细胞交换信号分子^[17]。根据卵巢切片测得，原始卵泡直径为（25.7 ± 2.6） μm，初级卵泡直径为（54.4 ± 5.6） μm。藏猪卵巢自出生即有大量原始卵泡，随月龄增加，原始卵泡减少，发育卵泡增多。原始卵泡的单层扁平颗粒细胞变为柱状或粒状，颗粒细胞层数增加，形成卵泡腔直至排卵。

添加百合珠芽后，原始卵泡比例减少，与对照组（BW）差异显著（P < 0.05）。添加1%浓度时，原始卵泡比例最低，2%浓度次之，表明百合珠芽促进原始卵泡发育，这可能与其中的薯蓣皂苷有关。Shen等人^[5]在小鼠卵巢中的研究也表明，薯蓣皂苷可增加初级卵泡数量。二级卵泡统计显示，对照组的二级卵泡比例为原始卵泡的1/3，为3组中最低。添加百合珠芽可促进原始卵泡发育为二级卵泡，1%浓度时，二级卵泡比例显著增加（P < 0.05）。但添加2%浓度时，二级卵泡比例显著下降（P < 0.05），可能说明高浓度百合珠芽增加了原始卵泡闭锁。

统计成熟卵泡比例时发现，2%浓度的百合珠芽组比例最高，与对照组和1%浓度组差异显著（P < 0.05），表明百合珠芽促进卵泡发育，但不同浓度影响显著，需进一步研究不同浓度的具体影响。

3.2 影响卵巢发育的靶基因的分析

对差异LncRNA的靶基因进行预测并最终通过靶基因的生物信息筛选出5个可能影响卵巢发育的靶基因CCNL2、MAP3K14、STUB1、IQANK1、PKP3。CCNL2主要参与RNA聚合酶II的转录延长阶段，在细胞增殖和分化中起重要作用，对卵巢发育至关重要。CCNL2通过与细胞周期蛋白依赖性激酶（CDKs）相互作用，调控细胞周期的各个阶段。正常卵巢发育需要精确的细胞周期控制，任何紊乱都可能导致异常^[18]。此外，CCNL2影响多个基因的表达，包括关键的卵巢发育基因。在卵巢发育过程中，细胞经历一系列增殖和分化，CCNL2的功能失调可能导致异常或疾病^[19]。研究表明，lncRNA通过调控CCNL2的表达，影响卵巢细胞的增殖和分化，从而影响卵巢发育^[18]。

MAP3K14基因编码丝裂原活化蛋白激酶激酶，主要参与NF-κB信号通路，调控细胞增殖、凋亡、炎症反应和免疫反应。lncRNA通过调控MAP3K14表达影响这些过程，从而对卵巢发育产生影响^[20,21]。NF-κB信号通路通过MAP3K14的激活调控细胞增殖和凋亡，确保卵泡正常发育^[20]。lncRNA调控MAP3K14还可以影响卵巢的炎症和免疫状态，从而进一步影响卵泡发育^[21,22]。

STUB1基因编码E3泛素连接酶，参与蛋白质降解和质量控制，调节细胞内的蛋白质稳态和应激反应。STUB1在蛋白质的泛素化和降解过程中起关键作用，这对于维持卵巢细胞的正常功能至关重要。通过调节蛋白质稳态，STUB1影响卵巢细胞的存活和功能^[22,23]。此外，STUB1参与细胞应激反应，保护细胞免受损伤，在卵巢发育过程中帮助细胞应对氧化应激和热应激^[18]。STUB1还通过调节与细胞凋亡相关的蛋白质，影响细胞的生存和死亡，lncRNA通过调控STUB1表达，影响卵巢细胞凋亡，从而影响卵巢发育^[24]。

IQANK1基因编码一种调控细胞信号传导的蛋白质，关键作用于细胞增殖、分化和存活。它调控卵巢细胞的增殖和分化，确保卵母细胞和颗粒细胞的正常发育。lncRNA通过调控IQANK1的表达影响卵巢细胞的这些过程，从而影响卵巢的发育^[20,24]。此外，IQANK1参与细胞凋亡信号通路，适当的细胞凋亡对维持卵巢功能至关重要。lncRNA通过调控IQANK1调节卵巢细胞凋亡，影响卵巢发育^[25]。IQANK1还在免疫反应和应激反应等信号通路中发挥作用，这些通路对卵泡发育和成熟至关重要。lncRNA通过调控IQANK1影响这些关键通路，从而影响卵巢的整体发育和功能^[26]。

PKP3基因编码一种参与细胞粘附和细胞间连接的蛋白质，维持组织结构和信号传导。PKP3对卵巢中颗粒细胞和卵母细胞的正常功能至关重要，lncRNA通过调控PKP3的表达，影响细胞粘附性和结构完整性，从而影响卵巢发育^[22,26]。此外，PKP3在信号传导通路中调节细胞增殖、分化和存活，lncRNA通过调控PKP3，影响卵巢细胞的信号传导过程，进而调节卵巢功能^[24]。PKP3还参与调节细胞凋亡，适当的细胞凋亡对于清除受损或异常细胞和维持卵巢健康至关重要，lncRNA通过影响PKP3表达，调节卵巢细胞的存活和凋亡过程，影响卵巢发育^[26]。

3.3 GO和KEGG功能分析

结合GO和KEGG功能分析，发现差异表达LncRNAs、富集于与卵巢发育相关的信号通路有：cAMP信号通路（cAMP signaling pathway）、MAPK信号通路（MAPK signaling pathway）、PI3K-Akt信号通路（PI3K-Akt signaling pathway）和Wnt信号通路（Wnt signaling pathway）等。cAMP是细胞内重要的第二信使，参与调节卵巢细胞的增殖、分化和激素分泌，富集于cAMP信号通路的lncRNAs可能在调控卵巢激素反应和卵泡发育中发挥重要作用^[27,28]。MAPK通路在细胞增殖、分化和应激反应中发挥关键作用，富集于MAPK通路的lncRNAs可能参与调控卵巢细胞的生长和分化^[29-31]。研究表明，PI3K-Akt通路在细胞增殖、存活和代谢中起关键作用，调控细胞的生长、增殖和存活^[32,33]。此外，许多lncRNAs通过调控PI3K-Akt通路来影响细胞功能。例如：一些lncRNAs通过调控PI3K-Akt信号通路中的关键基因，调节细胞的增殖和存活，从而影响细胞的发育和功能^[34]。另有研究发现，lncRNA GAS5通过抑制PI3K-Akt-mTOR信号通路，抑制卵巢癌细胞的增殖和恶性进展^[27]。由此表明，PI3K-Akt通路在细胞存活、代谢和增殖中发挥重要作用，而富集于此通路的lncRNAs通过调控这些过程，可能在卵巢发育中起到关键作用。研究表明，Wnt信号通路通过调控卵巢细胞的增殖、分化和凋亡，在卵泡发育过程中发挥关键作用。例如：Wnt/β-catenin信号通路已被证明可以调节卵巢卵泡的发育，并且β-catenin在此过程中起核心作用。相关研究显示，Wnt2和Wnt4在卵巢颗粒细胞中的表达与卵泡发育相关，其表达水平的变化可以影响卵泡的成熟和功能^[20,35]。此外，特定的lncRNAs通过调控Wnt信号通路中的关键基因，可以影响卵巢细胞的增殖和分化，从而调节卵巢发育和功能。这些发现进一步支持了lncRNAs在Wnt通路中可能发挥的重要调控作用^[35]。

研究表明FXN基因编码的Frataxin蛋白主要定位于线粒体，参与Fe-S簇的合成，这是许多代谢酶的重要辅助因子，这些酶在DNA修复、呼吸链和能量代谢中发挥关键作用^[36,37]；同时，Frataxin缺乏会导致线粒体功能障碍，包括Fe-S簇合成的缺陷，导致细胞能量代谢紊乱，进而影响细胞的增殖和分化^[37,38]。这些功能障碍会对高代谢需求的细胞类型（如卵巢细胞）产生负面影响。CLP1蛋白在mRNA的3'端切割和多聚腺苷酸化过程中发挥重要作用，影响mRNA的成熟和稳定性^[39]。此外，CLP1还在RNA加工和基因表达调控中起重要作用，这对于维持细胞正常功能和发育至关重要，这些功能对于卵巢细胞的正常发育和功能维护具有重要意义^[39]。

4 结论

（1）本研究对饲料中添加不同浓度卷丹百合珠芽西藏藏猪的卵巢外观形态、卵巢指数、以及不同类型卵泡比例统计来判定卵巢的发育情况，发现卷丹百合珠芽对西藏藏猪卵巢指数无显著差异，但对原始卵泡的发育有着显著差异，添加1%百合珠芽可以促进原始卵泡的发育，添加2%浓度百合珠芽可以促进二级卵泡向成熟卵泡的发育，总而言之，饲料中添加一定浓度的卷丹百合珠芽可以促进西藏藏猪卵巢的发育。

（2）本研究利用高通量组学技术对BW_vs_BY、BW_vs_BR、BY_vs_BR三个组合LncRNA进行生物学信息分析，通过|log2FoldChange| > 1且P < 0.05的筛选标准进行差异LncRNA的筛选，并对靶基因做GO和KEGG分析，来分析饲料中添加了不同浓度百合珠芽后会对西藏藏猪卵巢发育相关通路的富集验证作用和差异表达LncRNA的筛选，发现在添加不同浓度百合珠芽后，靶基因显著富集于卵巢发育相关的通路有cAMP信号通路、MAPK信号通路、PI3K-Akt信号通路、Wnt信号通路等。筛选出了对西藏藏猪卵巢发育相关的基因LOC110261342、MSTRG.26467、FXN、CLP1、Gem、PODNL1、TGFBR3L。

总而言之，本研究通过LncRNA高通量测序技术，比较了添加不同浓度百合珠芽对西藏藏猪卵巢的差异表达LncRNA，通过卵巢发育相关富集通路筛选了相关的影响卵巢发育的靶基因，为促进藏猪产业和当地资源高效利用提供有力支撑。

参考文献

[1] 王嘉悦.亚洲百合不同品种珠芽诱导的研究[D].哈尔滨:东北农业大学,2020.

[2] 张恪.卷丹百合珠芽发育与花青素的积累研究[D].西宁:青海大学,2017.

[3] 朱昀,王未,李倩,等.百合珠芽与鳞茎营养成分及活性成分研究[J].生物技术进展,2016,6(05):336-340.

[4] 袁志鹰,罗林明,陈乃宏,等.基于UPLC-Q-TOF-MS法分析百合珠芽化学成分及其薯蓣皂苷元抗肿瘤活性研究[J].天然产物研究与开发,2019,31(05):808-813, 831.

[5] Shen M, Qi C, Kuang Y P, et al. Observation of the influences of diosgenin on aging ovarian reserve and function in a mouse model[J]. Eur J Med Res, 2017, 22(1): 42.

[6] 郝怀志,杨春芳,董俊.饲粮添加百合渣对三黄肉鸡生产性能、屠宰性能的影响[J].畜牧兽医杂志,2021,40(01):1-3, 7.

[7] Hangauer M J, Carpenter S, Mcmanus M T. Discovering the complexity of the metazoan transcriptome[J]. Genome Biol, 2014, 15(4): 112.

[8] Cirulli E T, Singh A, Shianna K V, et al. Screening the human exome: a comparison of whole genome and whole transcriptome sequencing[J]. Genome Biol, 2010, 11(5): R57.

[9] 禄欢.香猪卵巢microRNA组学研究[D].贵阳:贵州大学,2021.

[10] 杨少华.奶山羊发情期与间情期卵巢中circRNAs差异性表达谱筛选及功能预测分析[D].杨凌:西北农林科技大学,2019.

[11] Lin J, Guan L, Ge L, et al. Nanopore-based full-length transcriptome sequencing of Muscovy duck (Cairina moschata) ovary[J]. Poult Sci, 2021, 100(8): 101246.

[12] 赵晓钰,吴盈萍,李海英,等.伊犁鹅产蛋前后各期卵巢转录谱的构建及卵泡发育相关基因的分析[J].中国畜牧兽医,2022,49(12):4674-4687.

[13] 李加宇.长链非编码RNA调控小鼠卵巢发育的初步研究[D].广州:华南农业大学,2016.

[14] 薛倩,李国辉,邢伟杰,等.鸡繁殖性状近交衰退相关lncRNA的筛选[J].中国畜牧兽医,2022,49(06):2176-2185.

[15] 徐高骁.基于卵巢全转录组学和代谢组学筛选影响猪产仔数性状的候选基因、非编码RNA及miR-183-circTCP1轴的功能验证[D].杨凌:西北农林科技大学,2019.

[16] 吕学斌,刘锐,龚建军,等.藏猪种质特性研究[C].中国畜牧兽医学会养猪学分会第五次全国会员代表大会暨养猪业创新发展论坛,2010:86-90.

[17] Orisaka M, Tajima, Tsang B K, et al. Oocyte-granulosa-theca cell interactions during preantral follicular development[J]. J Ovarian Res, 2009, 2(1): 9.

[18] Cheng L, Wang P, Tian R, et al. LncRNA2Target v2.0: a comprehensive database for target genes of lncRNAs in human and mouse[J]. Nucleic Acids Res, 2019, 47(D1): D140-D144.

[19] Li J, Yang Z, Wang D, et al. WAFNRLTG: A Novel Model for Predicting LncRNA Target Genes Based on Weighted Average Fusion Network Representation Learning Method[J]. Front Cell Dev Biol, 2021: 820342.

[20] Dong L, Xin X, Chang, H M, et al. Expression of long noncoding RNAs in the ovarian granulosa cells of women with diminished ovarian reserve using high-throughput sequencing[J]. J Ovarian Res,2022,15(1):119.

[21] Lv Z, Lv Z, Song L, et al. Role of lncRNAs in the pathogenic mechanism of human decreased ovarian reserve[J]. Front Genet,2023:1056061.

[22] Huang Y, Li S, Tan Y, et al. Identification and functional analysis of ovarian lncRNAs during different egg laying periods in Taihe Black-Bone Chickens[J]. Front Physiol, 2024: 1358682.

[23] Tan Y, Huang Y, Xu C, et al. Long noncoding RNAs and mRNAs profiling in ovary during laying and broodiness in Taihe Black-Bone Silky Fowls (Gallus gallus Domesticus Brisson)[J]. BMC Genomics,2024, 25(1): 357.

[24] Augustino S M A, Xu Q, Liu X, et al. Integrated analysis of lncRNAs and mRNAs reveals key trans-target genes associated with ETEC-F4ac adhesion phenotype in porcine small intestine epithelial cells[J]. BMC Genomics,2020,21(1):780.

[25] Liu B, Liu, Sulaiman Z, et al. Comprehensive analysis of lncRNA-miRNA-mRNA ceRNA network and key genes in granulosa cells of patients with biochemical primary ovarian insufficiency[J]. J Assist Reprod Genet, 2024, 41(1): 15-29.

[26] Gao Q, Ren H, Chen M, et al. Long non-coding RNAs regulate effects of beta-crystallin B2 on mouse ovary development[J]. Mol Med Rep, 2016, 14(5): 4223-4231.

[27] Zhang H, Kong, Q, Wang J, et al. Complex roles of cAMP-PKA-CREB signaling in cancer[J]. Exp Hematol Oncol,2020, 9(1): 32.

[28] Kilanowska A, Ziolkowska A, Stasiak P, et al. cAMP-Dependent Signaling and Ovarian Cancer[J]. Cells, 2022: 11233835.

[29] Memczak S, Jens M, Elefsinioti A, et al. Circular RNAs are a large class of animal RNAs with regulatory potency[J]. Nature, 2013, 495(7441): 333-338.

[30] Ge P, Zhang J, Zhou L, et al. CircRNA expression profile and functional analysis in testicular tissue of patients with non-obstructive azoospermia[J]. Reprod Biol Endocrinol, 2019, 17(1): 100.

[31] Zhao L, Pan Y, Wang M, et al. Integrated analysis of the expression profiles of the lncRNA-miRNA-mRNA ceRNA network in granulosa and cumulus cells from yak ovaries[J]. BMC Genomics, 2022, 23(1): 633.

[32] Zhou T, Xie X, Li M, et al. Rat BodyMap transcriptomes reveal unique circular RNA features across tissue types and developmental stages[J]. RNA, 2018, 24(11): 1443-1456.

[33] Zhang T, Leng Y, Duan M, et al. LncRNA GAS5-hnRNPK axis inhibited ovarian cancer progression via inhibition of AKT signaling in ovarian cancer cells[J]. Discov Oncol, 2023, 14(1): 157.

[34] Liang G, Yang Y, Niu G, et al. Genome-wide profiling of Sus scrofa circular RNAs across nine organs and three developmental stages[J]. DNA Res, 2017, 24(5), 523-535.

[35] Li L, Shi X, Shi Y, et al. The Signaling Pathways Involved in Ovarian Follicle Development[J]. Front Physiol, 2021: 730196.

[36] Castro I H, Pignataro M F, Sewell K E, et al. Frataxin Structure and Function[J]. Subcell Biochem, 2019(93): 393-438.

[37] Monfort B, Want K, Gervason S, et al. Recent Advances in the Elucidation of Frataxin Biochemical Function Open Novel Perspectives for the Treatment of Friedreich's Ataxia[J]. Front Neurosci, 2022: 838335.

[38] Da Conceicao L M A, Cabral L M, Pereira G R C, et al. An In Silico Analysis of Genetic Variants and Structural Modeling of the Human Frataxin Protein in Friedreich's Ataxia[J]. Int J Mol Sci, 2024: 25115796.

[39] Haddad R, Maurice F, Viphakone N, et al. An essential role for Clp1 in assembly of polyadenylation complex CF IA and Pol II transcription termination[J]. Nucleic Acids Res, 2012, 40(3): 1226-1239.

基金资助

国家自然科学基金资助项目［藏猪精子高原适应性的DNA甲基化机制(31760669)

藏猪睾丸高原适应性的DNA甲基化机制(31660658)

西藏自治区科技厅重点研发计划项目(藏羚羊高原适应的特殊遗传机制研究（XZ202402ZY0025）)