基于TTC法对急尖长苞冷杉种子生活力分析

Analysis of Seed Viability of Abies georgei var. Smithii Based on TTC Method

摘要

急尖长苞冷杉（Abies georgei var. smithii）在我国的保护级别为二级，对环境有较高的敏感度，目前该种群有减少的趋势，种子繁殖是其天然更新的主要方式，因此，其种子生活力对该种群的延续至关重要。为了更加科学、高效地检测其种子生活力，本研究采用TTC法检测种子生活力，通过正交试验设计筛选出浸种温度、浸种时间、TTC浓度、染色温度、染色时间5个因素的最优组合。结果表明：（1）TTC法检测急尖长苞冷杉种子的生活力具有可行性，相比发芽试验，其在种子质量判断上更能节约时间成本；（2）各因素对急尖长苞冷杉种子生活力检测的影响由大到小依次为：TTC浓度 > 浸种温度 > 染色温度 > 浸种时间 > 染色时间；（3）TTC法检测急尖长苞冷杉种子生活力的最适条件为：种子在20 ℃浸泡12 h后，用0.3% TTC的溶液在30 ℃黑暗中染色12 h。

Abstract

The protection level of Abies georgei var. smithii acuminata in China is Grade II., which is highly sensitive to the environment. At present, the population of Abies georgei var. smithii has a decreasing trend, and seed reproduction is the main way of its natural regeneration. Therefore, its seed viability is crucial to the continuation of the population. In order to detect seed viability more scientifically and efficiently, the TTC method was used to detect seed viability, and the optimal combination of 5 factors including soaking temperature, soaking time, TTC concentration, dyeing temperature and dyeing time was selected through orthogonal experimental design. The results showed that: (1) The TTC method was feasible to detect the viability of Abies georgei var. smithii seeds. Compared with the germination test, the TTC method could save more time and cost in seed quality judgment; (2) The effects of various factors on the viability of Abies georgei var. smithii seeds were as follows: TTC concentration > soaking temperature > dyeing temperature > soaking time > dyeing time; (3) The optimum conditions for the determination of seed viability by TTC were as follows: after soaking seeds at 20 ℃ for 12 h, the dye was stained with 0.3% TTC solution at 30 ℃ for 12 h in the dark.

Graphical abstract

关键词

急尖长苞冷杉种子 / TTC法 / 生活力 / 色季拉山

Key words

Abies georgei var. smithii seeds / TTC Method / Viability / Sejira Mountain

种子生活力（Viability）是指种胚所具有的生命力或种子能够萌发的潜在能力，是评估种子品质和播种质量的重要指标之一^[1,2]。种子作为农林业的“芯片”，是确保农林业生产，提供优质物质保障，满足人民生活和其他行业发展需要的基础^[3,4]。

急尖长苞冷杉（Abies georgei var. smithii）为松科冷杉属常绿乔木，是西藏分布面积最广的冷杉属树种，也是藏东南暗针叶林的主要建群树种之一，在西藏主要分布在林芝、米林、察隅、波密等地，在色季拉山多以大面积纯林存在^[5-8]。该植物为我国特有树种，由于其种群有减少趋势，遭遇绝灭的风险较大，故被列入了中国物种红色名录，目前处于易危状态^[9]。鉴于急尖长苞冷杉林群落在藏东南森林生态系统中的重要作用及其种群自身的濒危性，多年来一直备受学者们的关注，经过多年研究与积累，其在树轮生态学、空间分布格局、功能性状、养分生态等方面的生态学过程与机制逐渐被知晓^[10-15]，近年来，该种群的天然更新过程也开始受到学者们的关注，罗大庆等^[16]研究发现，林隙是色季拉山急尖长苞冷杉林更新的主要场所；王瑞红等^[8,17,18]发现生境因子（海拔、坡向、林分郁闭度）、凋落物厚度、苔藓厚度等均会影响急尖长苞冷杉的林下更新；任毅华等^[19]认为，苔藓层对种子更新具有双重作用，一方面，苔藓提供给种子庇护场所，使其免被取食者发现，同时其持水特性给种子萌发提供了基础的水分，另一方面，苔藓也阻挡了幼苗根系接触土壤，使得幼苗无法过渡到幼树阶段，一定程度上抑制了林下更新；但是，作为影响天然更新的主要因素——种子生活力目前还未见报道，为了更加科学、高效地鉴定其种子质量，本研究采用《国际种子检验规程》和ISTA^[20]通用的TTC法检测种子生活力，选取浸种温度、浸种时间、TTC浓度、染色温度、染色时间5个因素，通过正交试验设计，进行相关分析后，选出TTC染色法检测种子生活力的最优组合条件，以期为急尖长苞冷杉繁殖生态与种子质量相关研究提供参考。

1 试验材料与方法

1.1 试验材料

本试验所用种子均于2022年10月份采集于林芝市色季拉山，母树均为生长健康的独立木（周边5 m内无相邻木），树高在6 ~ 15 m之间，胸径在13 ~ 24 cm之间，种子千粒重为13.639 g，期间种子阴干后一直在5 ℃低温密封条件下存储，直至试验开始。

1.2 种子发芽率测定

采用筛孔2 mm的网筛结合人工抛掷的方法挑选出3 000粒饱满种子，并均等分为2份，一份用于种子发芽试验，另一份用于种子生活力测定。发芽试验所用种子采用四分法挑选出500粒种子，将500粒种子分为5份，每份各100粒，分别用A，B，C，D，E编号，即5组重复。用超纯水流水冲洗干净其表面的灰尘后吸干表面水分，放入0.5%的KMnO₄溶液中消毒30 ~ 40 min，后用超纯水冲洗干净；再用100 mg·L^-1 GA₃溶液浸泡24 h^[21]。将经过高温消毒自然降温后的沙土放入花盆后，用超纯水将其浸湿，在每个花盆中均匀放入处理好的100粒种子，种子覆土厚度约1 cm，在光照为12 h·d^-1，温度恒定20 ℃，湿度为70% ~ 80%^[22,23]的人工气候室内进行发芽试验。突破种皮的胚轴长度超过2 mm时视为初次发芽^[24]。从种子置床开始，定期浇水、观察，并记录种子发芽情况，以连续7 d没有新种子萌发作为标准结束试验^[25]。发芽率、发芽势计算公式^[26]如下：

种子发芽率（%）＝（发芽种子数／供试种子总数） × 100%（1）

种子发芽势（%）＝第15天发芽种子数／供试种子数 × 100%（2）

1.3 种子生活力测定

1.3.1 正交试验设计

选择浸种温度、浸种时间、TTC浓度、染色温度、染色时间5个因素，并在每个因素下设置4个水平^[22,27]，即L₁₆（4⁵），设计正交试验（表1）。

1.3.2 种子生活力测定

种子生活力测定采用目前最为常用的TTC染色法，具体步骤如下：

（1）种子预处理：将筛选好的待测定种子按每份30粒的标准挑选48份，以满足每个正交试验处理组合3次重复。依据正交试验设计中的浸种温度和浸种时间2个因素，将种子用超纯水分别于20 ℃、25 ℃、30 ℃和35 ℃的条件下浸泡6 h、12 h、18 h和24 h。取出浸泡好的种子，用定性滤纸将种子表面的水分吸干，用刀片将种子纵向对半切开^[28]，取其一放入培养皿备用。此过程以不损伤种胚为佳。

（2）配制TTC染色溶液：鉴于TTC染色溶液时效性短，因此在种子预处理后再配制溶液，以保证试验溶液的时效性。配制过程参考雷慧霞^[27]等人的方法，按照本试验正交设计，在避光条件下，用pH=7.0的磷酸缓冲溶液（PBS）和红四氮唑（TTC）粉剂分别配制0.1%、0.3%、0.5%、1.0%浓度的TTC染色溶液。

（3）生活力测定：将等量浓度为0.1%、0.3%、0.5%、1.0%的现配TTC溶液分别按次倒入不同标记好的培养皿中，至种子完全浸没。之后，按正交试验设计将培养皿按次置于不同水平染色温度（25 ℃，30 ℃，35 ℃，40 ℃）的恒温培养箱内避光染色，依据正交设计表在6 h，12 h，18 h，24 h后取出，倒出染色液后将种子冲洗干净，后吸干表面水分并观察其染色情况，并以此作为判定种子是否具有生活力的标准，即胚和胚乳全部染色或胚全部染色但胚乳20%未染色的种子视为有生活力的种子，其他视为无生活力^[29]。种子生活力计算公式^[30]如下：

种子生活力（%）＝（有生活力的种子数／供试种子总数） × 100%（3）

1.4 数据分析

采用Excel 2017软件对数据进行统计，用SPSS 20.0对数据进行相关性分析。

2 结果与分析

2.1 急尖长苞冷杉种子的发芽率

从种子置床开始到发芽试验结束共计为34 d，且从第8 d开始陆续发芽。对5组试验平均发芽率进行统计，其发芽过程大致经历5个阶段（图1）：第1阶段为（1 - 7 d），此期间，种子均未发芽；第2阶段为（7 - 15 d），为种子发芽的第1次高峰，累计平均发芽率为5.6%；第3阶段为（15 - 17 d），为种子发芽过程中的短暂平稳期；第4阶段为（17 - 28 d），种子发芽的第2高峰，累计平均发芽率为11.8%；第5阶段为（28 - 34 d），连续7 d没有新的发芽，故发芽试验结束。就整体而言，急尖长苞冷杉种子的发芽时间主要集中在第11 - 21 d之间，平均发芽率为11.8%，平均发芽势为5.6%。

2.2 不同因素水平对种子生活力的影响

2.2.1 正交试验及极差分析

不同处理组合下，急尖长苞冷杉种子生活力介于14.0% ~ 61.0%（表2）。生活力最高值61.0%对应的是处理组合2，即种子先在20 ℃温度条件下用超纯水浸泡12 h，之后恒定温度为30 ℃，再转移至0.3% TTC染色溶液中避光染色12 h。处理组合14对应的生活力值最低，仅为14.0%，即在35 ℃温度下浸种12 h后，在恒温25 ℃条件下用0.5% TTC染色溶液避光染色24 h。且两种组合种子生活力差异显著（P < 0.05）（表2、图2）。

对正交试验结果作进一步极差分析（表2），结果表明，各因素对应的极差值大小次序依次为R₃（0.74） > R₁（0.4） > R₄（0.37） > R₂（0.28） > R₅（0.15），即TTC浓度对急尖长苞冷杉种子生活力测定染色结果影响最大，接下来依次是浸种温度、染色温度、浸种时间，而染色时间对染色结果的影响最小。

参考他人分析方法^[21,27,28]，选取各因素对应水平（I_j 、II_j 、III_j 、IV_j ）下种子生活力均值的最大值来筛选急尖长苞冷杉种子生活力测定的最适条件。因素A中1水平种子平均生活力最大，为I₁ ＝1.38，即最适合的浸种温度为20 ℃；因素B中4水平最大，为IV₂ ＝1.38，即最适合的浸种时间为24 h；因素C中2水平最大，为II₃ ＝1.65，即最适合的TTC浓度为0.3%；因素D中2水平最大，为II₄ ＝1.41，即最适合的染色温度为30 ℃；因素E中4水平最大，为IV₅ ＝1.34，即最适合的染色时间为24 h。综上所述，A1-B4-C2-D2-E4为染色较优组合，即急尖长苞冷杉种子在20 ℃温度条件下浸泡24 h后，在30 ℃避光条件下，用浓度为0.3%的TTC染色溶液浸泡24 h。

2.2.2 方差分析

进一步对正交试验数据进行方差分析表明（见表3），试验设定的5个因素中，TTC浓度、浸种温度、染色温度均对试验染色结果的影响达到了极显著水平（P < 0.01），浸种时间对试验染色结果影响显著（P < 0.05），而染色时间则无显著影响（P > 0.05）。该结果与极差分析结果一致。因此，相较浸种时间和染色时间而言，TTC浓度、浸种温度和染色温度是影响急尖长苞冷杉种子生活力检测的主要影响因素。

3 结论与讨论

3.1 急尖长苞冷杉种子的发芽率与发芽势

本研究发现，种子发芽试验经历了5个阶段，共计34 d。整个过程中经历了2次发芽高峰，而在2次高峰间出现了短暂的平稳期，这一现象与色季拉山西南花楸^[31]种子发芽过程较为相似。这可能与植物对高寒山地环境的适应机制有关，平稳期的出现可能是植物在生理上对高寒山地恶劣环境适应机制的一种表现，高寒山地环境中地形复杂，气候条件多变，环境异质性强，生境要素波动较大，因此导致该区域的植物形成了一种自我保护机制，即通过延迟种子萌发或错峰发芽的方式增加其捕捉适宜发芽时机的概率，以此来应对极端环境的出现，进而提高种群及群落的稳定性。本研究中急尖长苞冷杉种子的平均发芽势仅为5.6%，进一步说明该种子在发芽过程中发芽整齐度较差，通常情况下，急尖长苞冷杉种子在10月中旬开始成熟，而在调查过程中发现，9月份仍有种子萌发现象，这可能也是对上述推论的一个例证。但要进一步揭示高寒山地植物种子萌发机制还需扩大研究对象，深入研究高寒山地植物种子萌发特性。

此外，本研究中急尖长苞冷杉种子发芽率仅为11.8%，但有研究表明，该群落幼苗数量可达31 771株·hm^-2[19]，基本可满足种群更新需要，同时有研究发现幼苗阶段是植物种群生活史中最敏感脆弱的阶段^[32]，该阶段中种群对外界环境干扰的敏感性较高，因此，经过一系列环境因素的筛选，最终成功过渡到幼树阶段的幼苗数量有限，可见，色季拉山急尖长苞冷杉在幼苗阶段属于典型的r对策。

就整体而言，本研究种子的平均发芽率为11.8%，处于冷杉属植物正常发芽率10% ~ 25%范围内^[33]，可见，本研究中的种子质量满足本试验要求。

3.2 TTC法测定急尖长苞冷杉种子生活力的最佳条件

正交试验染色结果表明，急尖长苞冷杉种子在处理组合2中生活力最高（61.0%），即在20 ℃温度条件下浸种12 h后，恒温30 ℃下，用0.3%的TTC浓度避光染色12 h；但极差分析结果表明，较优组合为20 ℃温度条件下浸种24 h后，恒温30 ℃下用0.3%的TTC溶液避光染色24 h。对两种组合进行比较发现：两个组合的TTC浓度（0.3%）、浸种温度（20 ℃）、染色温度（30 ℃）均相同，而染色时间和浸种时间均不相同，处理组合2和较优组合的染色时间分别为的12 h和24 h，浸种时间分别为的12 h和24 h。通过比较II₅ =1.23与IV₅ =1.34，II₂ =1.17与IV₂ =1.38发现，两组的染色时间和浸种时间存在的差异较小，且极差分析和方差分析结果显示染色时间和浸种时间对急尖长苞冷杉种子染色效果影响相对较小，考虑时间成本的前提下，染色时间和浸种时间均选择12 h更适合。综上所述，急尖长苞冷杉种子TTC染色的最佳条件为：在20 ℃条件下浸种12 h后，用浓度为0.3% TTC溶液在30 ℃温度条件下避光染色12 h。

3.3 TTC法测定急尖长苞冷杉种子生活力的可行性

一般情况下，种子发芽率与TTC法测定结果接近，且种子发芽率应该小于或者等于生活力^[34-36]，但本研究结果显示的急尖长苞冷杉种子生活力为61.0%，而其种子发芽率仅为11.8%，种子生活力远高于发芽率，这与彭云霞^[36]、雷慧霞^[37]、邢丽伟^[38]等人的研究结果差异较大，这可能与不同植物种子的发芽势差异有关。本试验最优组合为A1-B2-C2-D2-E2，对急尖长苞冷杉种子生活力测定时间仅需1 d左右，但测定急尖长苞冷杉种子的发芽率需要大约5 w左右的时间。因此，在生产实践中，可以用TTC法提前测定急尖长苞冷杉种子的生活力，便于初步了解种子的质量并评估其种子的潜在发芽能力，利于林业管理及生产。

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基金资助

国家自然科学基金资助项目(32371651)

西藏高原森林生态教育部重点试验室研究生创新计划项目(XZA-JYBSYS-2023-21)