基于综合生物信息学分析拟南芥耐寒核心差异表达基因

Ananlysis of Arabidopsis Thaliana’s Coldtolerant Core Differentially Expressed Genes Based on Comprehensive Bioinformatics

摘要

为了筛选低温胁迫下拟南芥核心差异表达基因和相关的代谢通路，通过检索GEO数据库中与拟南芥低温胁迫相关的芯片数据集，并利用GEO中的GEO2R工具筛选差异基因，然后利用DAVID数据库对筛选后的差异表达基因进行GO富集和KEGG富集注释，再结合STRING数据库对差异表达基因构建蛋白质互作关系网络图。研究结果表明：确定芯片GSE106635中的GSM2844128、GSM2844129、GSM2844132和GSM2844133样本为研究对象，筛选出788个差异表达基因，其中491个上调差异表达基因，297个下调差异表达基因；通过DAVID在线功能富集分析可知，低温胁迫主要对拟南芥体内的蛋白质激酶活性和蛋白质结合有显著影响。挖掘出CCA1、LHY、LTI78、COR15A、SUS1、COR47、PRR5、GI、ABA1、LEA14等在低温逆境中起关键作用的核心差异表达基因。

Abstract

The objective of this study was to screen the differentially expressed genes and related metabolic pathways in the core of Arabidopsis thaliana under low temperature stress. The chip dataset related to low temperature stress in Arabidopsis thaliana was retrieved in the GEO database, and the GEO2R tool in GEO was used to screen the differentially expressed genes, and then the GO enrichment and KEGG enrichment annotations were performed on the selected differentially expressed genes by using the DAVID database, and then the protein-protein interaction network diagram was constructed by combining the STRING database with the differentially expressed genes. The results showed that 788 differentially expressed genes were screened out by identifying GSM2844128, GSM2844129, GSM2844132 and GSM2844133 samples in the chip GSE106635, of which 491 were up-regulated and 297 were down-regulated. DAVID online functional enrichment analysis showed that low temperature stress had a significant effect on protein kinase activity and protein binding in Arabidopsis. The core differentially expressed genes that played a key role in low temperature stress, such as CCA1, LHY, LTI78, COR15A, SUS1, COR47, PRR5, GI, ABA1 and LEA14, were excavated.

Graphical abstract

关键词

低温胁迫 / GEO数据库 / 拟南芥 / 生物信息学

Key words

Low temperature stress / GEO database / Arabidopsis thaliana / Bioinformatics

低温是影响北部地区植物生长发育和作物产量的最主要的原因之一，威胁着北部地区的粮食安全。在低温胁迫下，植物能够在一定程度上通过调控基因的表达和蛋白质的合成，来适应周围的环境温度的变化。为了更好地了解植物是如何感知和适应低温环境，选择用来探索植物生命活动的模式植物拟南芥来做相关的研究。

近年来，随着生物信息学的快速发展，为挖掘植物与低温胁迫相关的抗寒基因和代谢通路提供了有力的保障。许多基因已经在拟南芥中被证实在低温胁迫中发挥着重要作用。比如，与植物响应低温胁迫密切相关的生物钟调节基因，该类基因会在植物受低温胁迫后形成一个反馈调节回路，以此根据温度变化来提高植物抗寒适应性^[1]。植物生物钟调节回路主要包括：基因CCA1/LHY直接和CBF启动子的结合，会正向调控CCA基因的表达。研究表明，突变体cca1-11/lhy-21改变了CBFs和COFs正常表达节律，降低植物的低温耐受力^[2]；生物钟组分GI可增强植物对寒冷的耐受力，研究表明GI突变体gi-3的缺失，降低了植物的耐冷性。另外，GI不改变CBFs和COFs基因的表达，但可以通过增加可溶性糖含量来维持植物体内渗透调节物质，从而提高植物的抗寒性^[3]。其次，植物中的ICE-CBF-COR信号通路是植物适应低温胁迫的主要调控途径。当植物受到低温胁迫后，冷应激受体蛋白被激活，触发体内的信号传导，诱导剂（ICE）基因被激活，导致被受ICE调控的C重复序列结合因子（CBF）基因正向调节下游冷响应（COR）基因的表达，从而提高植物的耐寒性^[4]。在拟南芥中，冷胁迫诱导基因CBF主要包括CBF1、CBF2、CBF3，因为它们的氨基酸序列的不同，使其在低温响应过程中具有不同的作用^[5]。ICE有两个同源基因（ICE1、ICE2），ICE1可以在冷驯化过程中激活CBF3/DREB1A的表达^[6]，而ICE2可以触发CBF1的表达^[7]。CORs通常指所有冷调控基因编码的蛋白质^[4]，包括：胚胎发生后期丰富蛋白（LEA）、应激反应蛋白（SRP）、冷诱导（KIN）、低温诱导（LTI）。这些复杂的信号模块构成了一个调控通路，提高了植物对低温胁迫的耐受性。

本研究利用高通量基因表达数据库（GEO）检索植物耐寒性相关的差异表达基因，以揭示拟南芥冷响应的机制。利用秩聚合的方法从GEO数据库中鉴定出491个上调基因和297个下调基因，结合生物信息学挖掘冷响应差异表达基因的分子功能、信号通路和PPI互作网络。提高对植物冷响应机制的认识，并为研究低温胁迫下作物生长发育和作物产量提供一定的理论基础。

1 材料与方法

1.1 获取芯片数据

在高通量基因表达数据库GEO（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/）中，对“Low temperature stress”进行检索，共得到1 544个芯片数据集。再根据①样本来源选择“拟南芥（Arabidopsis thaliana (L.) Heynh）”；②数据表达类型选择“Expression profiling by array”两个条件，进一步对结果进行芯片数据集筛选；初步得到36个数据集，对其进行逐一筛选，最终选用GSE106635芯片为研究对象。该芯片数据集共包括8个样本数据，我们选择其中GSM2844128和GSM2844129两个样本为对照组（4 ℃ 0 h）；GSM2844132和GSM2844133两个样本为处理组（4 ℃ 6 h）为后续研究对象^[8]。

1.2 研究方法

1.2.1 差异表达基因筛选

采用GEO数据库中的在线分析程序GEO2R（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/geo2r/）对处理组和对照组两组数据进行比较分析，并利用微生信在线工具（http://www.bioinformatics.com.cn/plot_basic_3_color_volcano_plot_086）以P < 0.05和|log FC| ≥ 1作为筛选差异表达基因的条件，对所选数据集进行筛选并构建差异表达基因火山图。

1.2.2 GO富集功能注释及KEGG富集通路分析

采用在线数据库DAVID（http: //david. abcc. ncifcrf. gov/）对差异表达基因P < 0.05作为筛选标准，进行GO富集功能注释及KEGG富集通路分析^[8]。并利用微生信在线工具（http://www.bioinformatics.com.cn /plot_basic_gopathway_enrichment_bubbleplot_081）对前20进行气泡图的绘制。

1.2.3 PPI网络的构建

采用在线数据STRING（http://string-db.org/）构建差异表达基因编码蛋白质-蛋白质的互作关系（PPI）网络图，并利用Cytoscape软件中的Cytohubba插件对前30的核心基因构建基因表达网络图^[8]。利用微生信在线工具（http://www.bioinformatics.com.cn/plot_basic_cluster_heatmap_plot_024）对前30的核心差异表达基因进行层次聚类分析。

2 结果与分析

2.1 关键差异表达基因的挖掘

选取GSE106635芯片中的4个样本GSM2844128、GSM2844129、GSM2844132和GSM2844133为研究对象，利用GEO2R进行初步分析筛选，共得到22 204个差异表达基因；再利用微生信在线工具（http://www.bioinformatics.com.cn/plot_basic_3_color_volcano_plot_086）以P < 0.05和|log FC| ≥ 1作为筛选条件，对22 204个差异表达基因进行二次分析筛选，得到显著差异表达基因788个，其中491个基因上调表达，297个基因下调表达（图1）。

2.2 差异表达基因GO富集分析和KEGG富集分析

为进一步了解差异表达基因的功能，采用DAVID数据库对788个差异表达基因进行GO富集分析，结果表明：所参试的788个差异表达基因被富集到514个相关条目中。其中有生物过程（biological process，BP）共有316个条目，主要富集在蛋白质磷酸化、防御响应、对寒冷的反应、蛋白质折叠、碳水化合物代谢过程、对脱落酸的反应等生物学过程（图2）。分子功能（Molecular Function，MF）共102个条目，主要富集在蛋白质结合、ATP结合、转录调控区序列特异性DNA结合、蛋白丝氨酸/苏氨酸/酪氨酸激酶活性、蛋白激酶活性、金属离子结合、钙调蛋白结合等分子功能（图2）。细胞组分（cellular component，C）共96个条目，主要富集在细胞质、胞浆、叶绿体及其膜系统、质膜、质体、高尔基体等细胞组分（图2）。

所参试的789个差异表达基因主要富集在29个差异代谢通路中，主要包括淀粉和蔗糖代谢、植物－病原体相互作用、甘油磷脂代谢、糖酵解/糖异生、辅因子的生物合成、碳代谢、甘油脂代谢、谷胱甘肽代谢、半胱氨酸和蛋氨酸代谢、光合作用等代谢通路（图3）。

2.3 差异表达基因蛋白互作网络构建和核心差异表达基因的筛选

对上调差异表达基因和下调差异表达基因分别构建蛋白－蛋白互作网络（图4a、4b）。利用Cytohubba软件分别对蛋白互作网络进行核心基因的筛选，其中共筛选出30个上调差异表达基因和30个下调差异表达基因（图5a、5b），上调差异表达基因中主要包括CCA1、LHY、LTI78、COR15A、SUS1、COR47、PRR5、GI、ABA1、LEA14等核心基因；下调差异表达基因中主要包括WRKY33、WRKY40、AT3G44260、DIC2、HSPRO2、AT4G27280、ACS6、ERF6、SZF1、ERF104等核心基因。

2.4 核心差异表达基因层次聚类分析

对筛选出的核心差异表达基因，进行层次聚类分析，结果显示：30个核心上调差异表达基因在低温胁迫处理下呈现出不同程度的上调趋势（图6a），其中CCA1、ADH1、DREB1A、LTI30、CP1、AT3G12320、STH、GolS3、LHY、AT5G06980等基因表达量上调趋势明显；30个核心下调差异表达基因在低温胁迫处理下呈现出不同程度的下调趋势（图6b），其中AT4G27280、AT2G20670、AT5G22920、TCH4、ORA47、AT1G32920、HSPRO2、BT5、NUDT21、MYB77等基因表达量下调趋势明显。

3 讨论

非生物胁迫对植物生长发育和作物产量会造成严重的影响。为揭示植物的耐冷机制，许多学者都以拟南芥为模式植物，来研究植物是如何响应低温胁迫引起的抗寒生理调控机制^[8]。在过去的研究中，大量的分子靶点和耐冷应激反应机制已被证实，并报道了植物对不同应激反应的响应基因^[9]。目前还不清楚植物响应不同非生物胁迫和生物胁迫具体的调控机制。因此，需要更多的研究来提供植物响应多重胁迫下基因调控和蛋白质变化。

本研究通过对GSE106635芯片数据分析发现，在低温胁迫下，拟南芥有788个差异表达基因（491个上调差异表达基因，297个下调差异表达基因）。对其进行GO富集和KEGG富集分析可知，低温胁迫主要对拟南芥体内的蛋白质激酶活性和蛋白质结合有显著的影响。本研究还对上下调差异表达基因分别构建了蛋白－蛋白互作网络图，并利用Cytohubba软件分别计算出上下调差异表达基因的前30个核心差异表达基因，对其进行网络图的构建和层次聚类热图分析。其中，CCA1与LHY是生物节律钟发挥功能所必需的蛋白^[10]，CCA1通过对环境光和温度信号的响应和冷胁迫后自我调节^[11]，来增强植物的抗寒性。生物钟调节基因GI和PRR5-VP可以通过延迟植株开花时间间接地调控生物节律^[12]，来增强植物的抗寒性。LTI30和LTI78是低温响应蛋白，在植物响应低温胁迫中有重要的作用^[13,14]。半乳糖醇合酶GolS3基因^[15]、蔗糖合成酶SUS1基因^[16]和乙醇脱氢酶ADH1基因^[17]表达量的增加，可以提高植物的抗寒性。COR15A、COR47和CBF调控基因的瞬时诱导可作为植物一种自我保护机制，即植物认为温度下降是极端寒冷条件开始的前奏^[18]。COR15a基因在细胞水平（如原生质体）和组织水平（如叶绿体）上的高表达，可以提高植物抗寒性^[19]，研究人员通过电解质泄漏、表型和存活率研究发现，过表达的CbADH1显著提高了拟南芥和烟草的耐冷性^[20]。过表达的JfDREB1A基因在低温胁迫下通过维持细胞膜的稳定性、降低电导率和增加保护性酶的活性，来提高转基因拟南芥植株的存活率^[21]。以上研究结果表明了研究的准确性和可靠性。

4 结论

本研究为拟南芥对低温胁迫耐受性研究提供了新的思路，揭示了拟南芥响应低温胁迫的冷响应的差异表达基因和相关的代谢通路，以及相互作用网络。本研究有助于解释植物在低温胁迫下的耐寒机制，有助于后续研究植物耐寒反应的潜在靶点。

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基金资助

黑龙江省省属科研院所科研业务费项目(CZKYF2023-1-B002)