水曲柳枝枯病病病原菌分离鉴定、生物学特性及发病前后真菌多样性分析

Isolation, Identification, Biological Characteristics, and Analysis of Fungal Diversity before and after the Onset of Fraxinus mandshurica Shoot Blight by High-throughput Sequencing

摘要

本研究对采集的病枝条进行组织分离纯化后获得代表性菌株，通过柯赫氏法则对病原菌进行致病性验证，结合形态学和分子生物学鉴定病原菌种类；通过不同培养基、不同温度、不同pH和不同光照初步研究病原菌生物学特性。采用高通量测序法，探究水曲柳枝枯病发生前后病皮与健皮之间真菌群落结构的差异。该研究为水曲柳枝枯病害的田间诊断及防控提供了科学理论指导，具有较高的应用价值。结果表明：分离纯化后获得6株菌株，菌株FL1致病性测定与田间症状相符；结合形态学和分子生物学，将引起水曲柳枝枯病的病原菌鉴定为Diaporthe cotoneastri；在人工培养条件下，菌株最适生长环境为PDA培养基、25 ℃、pH = 6和12 L/12 D。病皮与健皮真菌的ASV变化较大，2组样品共有的真菌种类有86个，占真菌总数的16.96%。2组样品中真菌菌落结构基本相同，但相对丰度差异较大。在门水平下，子囊菌门（Ascomycota）是两组的优势真菌。在属水平下，亚隔孢壳属（Didymella）是健皮中的优势真菌，间座壳属Diaporthe是病皮中的优势真菌，其次是亚隔孢壳属（Didymella）。本研究明确了D. cotoneastri引起水曲柳枝枯病，感病前后真菌种类数量变化明显。

Abstract

Through tissue isolation and purification of the collected diseased branches, representative pathogenic strains were obtained. Pathogenicity was verified by Koch's rule, and the types of pathogens were identified by combining morphology and molecular biology; Through different culture media, different temperature, different pH and different lighting conditions, a preliminary study was conducted on the biological characteristics of pathogen. The high-throughput sequencing was used to investigate the differences in fungal community structures between diseased skin and healthy skin before and after the occurrence of F. mandshurica shoot blight. This study aimed to provide scientific theoretical guidance for the field diagnosis and prevention of F. mandshurica shoot blight, with strong practical significance. Six strains were obtained after isolation and purification, and the pathogenicity of strain FL1 was consistent with field symptoms; by combining morphology and molecular biology, the pathogen causing F. mandshurica shoot blight was identified as D. cotoneastri; under artificial cultivation conditions, the optimal growth environment for the strain was PDA medium, 25 ℃, pH = 6, and 12L/12D. The fungal ASV changed greatly before and after susceptibility to disease. The two samples shared 86 fungal species, accounting for 16.96%, with two substantially identical sample colonies structures, but large differences in relative abundance. At the phylum level, Ascomycota was the dominant fungus. At the genus level, Didymella was the predominant fungus in healthy skin, and Diaporthe was the predominant fungus in diseased skin, followed by Didymella. This study confirms that D. cotoneastri causes F. mandshurica shoot blight, and there is a significant change in the number of fungal species before and after infection.

Graphical abstract

关键词

水曲柳枝枯病 / 病原菌鉴定 / 生物学特性 / 真菌多样性

Key words

F. mandshurica shoot blight / Pathogen identification / Biological characteristics / Fungal diversity

水曲柳（Fraxinus mandshurica）是木犀科（Oleaceae）梣属（Fraxinus）的高大落叶乔木，是东北地区“三大珍贵硬阔”之一，为东北地区的主要造林树种，同时也是工业和民用高级用材^[1,2]。枝枯病是一种常见的林木病害，导致林木枝条干枯，严重时整株林木死亡，对林业生产造成严重损失^[3,4]。目前枝枯病的防治以化学防治为主，长此以往会造成环境污染或产生耐药性等现象，利用拮抗菌防治林木病害是是一种有效可行的办法^[5,6]。高通量测序技术相比较传统的生物测定方法更加快速、准确、高效且能全面分析物种组成以及群落结构^[7]。为明确导致水曲柳枝枯病发生的主要病原菌，本研究采用组织分离的方法对病原菌进行分离，运用形态学以及分子生物学相结合的方法对病原菌进行鉴定，明确病原菌的分类地位，科学认识该病原菌的生物学特性。同时采集东北林业大学帽儿山林场同一林分中健康和感染水曲柳枝枯病的水曲柳枝条样品，采用Illumina平台对群落DNA片段进行双端（Paired-end）测序，对样品的真菌菌群结构进行分析，旨在研究水曲柳枝枯病对真菌菌群多样性和丰富度的影响，从而指导筛选优势的枝枯病拮抗菌。

1 材料和方法

1.1 样本采集

采集东北林业大学帽儿山实验林场的水曲柳健康枝条和感枝枯病的病枝样品。采用“S”形多点采样法，分别剪取10棵10 a生10 cm长水曲柳健康枝条和感枝枯病枝条，放入密封袋，编号为CK、B。部分感病枝条直接用于病原菌的分离鉴定，各选取5棵用于后续DNA提取处理。

1.2 培养基

PDA培养基：去皮马铃薯200 g，葡萄糖20 g，琼脂20 g，蒸馏水1 000 mL。

CMD培养基：玉米粉30 g，葡萄糖20 g，琼脂20 g，蒸馏水1 000 mL。

MEA培养基：麦芽浸粉20 g，琼脂20 g，蒸馏水1 000 mL。

TDXA培养基：淀粉20 g，天冬酰胺1.5 g，磷酸二氢钾（KH₂PO₄）0.5 g，硫酸镁（MgSO₄·7H₂O）0.5 g，琼脂20 g，蒸馏水1 000 mL。

改良MMN培养基为：氯化钙（CaCl₂·H₂O）0.05 g，氯化钠（NaCl）0.025 g，葡萄糖10 g，磷酸氢二钾（K₂HPO₄）0.025 g，磷酸氢二铵（NH_{4 2}HPO₄）0.25 g，硫酸镁（MgSO₄·7H₂O）0.05 g，琼脂20 g，蒸馏水为1 000 mL。

水曲柳树皮煎汁培养基：水曲柳树皮100 g，琼脂20 g，蒸馏水1 000 mL。

PLA培养基：去皮马铃薯200 g，乳糖20 g，琼脂20 g，蒸馏水1 000 mL。

PMA培养基：去皮马铃薯200 g，麦芽糖20 g，琼脂20 g，蒸馏水1 000 mL。

1.3 病原菌分离纯化

将采集到的感枝枯病枝条样品用自来水冲洗干净后，分别将切取的组织样品放置于75%的酒精中 1 min，无菌水清洗3遍后，再放入2%次氯酸钠溶液2 min，无菌水清洗3遍。将消毒过的样品放于PDA培养基中，每个培养皿3块样品，倒置于25 ℃恒温培养箱中培养，逐日观察，待样品边缘长出少许菌丝后，使用无菌玻璃毛细管挑取尖端菌丝接种于新的培养基中纯化。等到菌丝长满培养基，放入4 ℃冰箱保存，待用。

1.4 分离株致病性测定

将水曲柳健康小枝使用无菌水冲洗5遍，清洗表面，放置于干净台面自然阴干。将小枝修剪为10 cm左右长，枝条上端使用嫁接膜封口，下端呈45°剪切，插入广口瓶中水培。使用无菌针刺伤小枝，将待测菌株打制成菌饼，接种到刺伤小枝上，用喷有无菌水的无菌脱脂棉包裹，再用嫁接膜缠绕包裹，每个待测菌株接种10个重复。保湿培养48 h后，脱去脱脂棉和嫁接膜。每日观察，直到小枝上产生明显症状。从水曲柳的病变组织中重新分离纯化菌株，进行柯赫氏法则验证。

1.5 病原菌鉴定

1.5.1 待测菌株的形态学鉴定

用内径5 mm的打孔器将待测菌株打制成菌饼，接种至PDA培养基上。25 ℃恒温培养箱中培养25 d，定期观察培养基上的菌落的质地，颜色，形态。用接种针挑取少量菌体，在光学显微镜（40×）下进行菌丝和孢子形态观察。

1.5.2 待测菌株的分子生物学鉴定

参照Ezup柱式真菌基因组DNA抽提试剂盒说明书提取待测菌株基因组DNA，以基因组DNA为模板，使用通用引物ITS1：（5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′）和ITS4：（5′-TCCTCCGCTTATTGATAT GC-3′），扩增真菌ITS序列。扩增体系组成如表1和表2所示。

PCR产物经1.0%的琼脂糖电泳检测，产物送至工生物工程（上海）股份有限公司进行测序，结果在NCBI上进行BLAST比对。

1.6 病原菌生物学特性分析

1.6.1 培养基对菌落生长的影响

选取PDA培养基、CMD培养基、MEA培养基、TDXA培养基、改良MMN培养基、水曲柳树皮煎汁培养基、PLA培养基和PMA培养基等8种培养基。将5 mm病原菌菌饼分别接种至不同培养基中心，每个处理3个重复，置于25 ℃恒温培养箱中暗培养，培养10 d后，采用十字交叉法测量菌落直径并记录。

1.6.2 温度对菌落生长的影响

选取PDA培养基作为供试培养基，将5 mm病原菌菌饼接种至培养基中心。将接种了病原菌菌饼的培养基分别置于10 ℃、15 ℃、20 ℃、25 ℃、30 ℃的恒温培养箱中暗培养，每个处理3个重复，培养10 d后，采用十字交叉法测量菌落直径并记录。

1.6.3 pH对菌落生长的影响

选取PDA培养基作为供试培养基，用1 mol/L的HCl和1 mol/L的NaOH溶液调节PDA培养基的pH值至5.0、6.0、7.0、8.0、9.0。将5 mm病原菌菌饼分别接种至不同pH的培养基中心，每个处理3个重复，置于25 ℃恒温培养箱中暗培养，培养10 d后，采用十字交叉法测量菌落直径并记录。

1.6.4 光照对菌落生长的影响

选取PDA培养基作为供试培养基，将5 mm病原菌菌饼接种至培养基中心，分别置于全黑暗（24 D）、全光照（24 L）和光暗交替（12 L/12 D），每个处理3个重复，置于25 ℃恒温培养箱中暗培养，培养10 d后，采用十字交叉法测量菌落直径并记录。

1.7 水曲柳枝枯病发生前后真菌多样性

1.7.1 总DNA的提取

将采集到的健康和感枝枯病的枝条样品用自来水冲洗干净，分别将切取的组织样品放置于75%的酒精中1 min，无菌水清洗3遍后，再放入2%次氯酸钠溶液2 min，无菌水清洗3遍。每组样品设置3个样本重复，装入无菌样品袋中，使用液氮预冷冻后储存于- 80 ℃冰箱。

将冷冻样品送至南京派森诺基因科技有限公司提取基因组DNA，以样品基因组DNA为模板，引物选择标准真菌ITS1F：（5′-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3′）和ITS2：（5′-GCTGCGTTCTTCATCGAT GC-3′），扩增真菌ITS序列，使用Illumina NovaSeq PE250平台进行高通量测序，下机的测序原始数据以FASTQ格式保存。

1.7.2 数据分析

使用QIIME2软件，按照DADA2方法对测序原始数据进行去引物，质量过滤，去噪，拼接和去嵌合体等步骤，得到最终有效的ASVs（amplicon sequence variants）数据。

物种注释及分类学组成分析：使用QIIME2软件的classify-sklearn算法，对于每个ASVs的特征序列，使用Naive Bayes分类器进行物种分类学注释，参考数据库选用UNITE数据库。通过对抽平后的ASV表格进行统计，可以获得每个样本中的微生物群落在各分类水平的具体组成表，计算不同样本在各分类水平所含有的分类单元的数量，依据序列物种分类学注释的结果以及选择的样品，统计样本的物种注释结果中门、属2个分类水平各自含有的分类单元的数量。

Alpha多样性分析：使用未抽平的ASV表，调用“qiime diversity alphararefaction”命令，设置参数“--p-steps 10 --p-min-depth 10 --p-iterations 10”，计算所选的alpha多样性指数。选取最大抽平深度时的得分平均值作为alpha多样性指数。

Beta多样性分析：使用抽平后的ASV表，依据树文件的有无调用“qiime diversity core-metrics-phylogenetic”命令，计算Bray-Curtis距离矩阵，并对距离矩阵做PCoA分析，输出QZV文件。同时，在R中进行PCoA分析输出样本点的PCoA坐标，对获得的Bray-Curtis 距离矩阵进行NMDS分析，并通过二维排序图展示微生物群落的组成差异。

2 结果

2.1 病原菌分离纯化

水曲柳枝枯病的病枝组织样品在PDA培养基上培养3 d时，样品边缘可见菌丝长出。使用无菌玻璃毛细管挑取尖端菌丝，获得27个分离株。通过形态学观察，将27个分离株归为6个菌株，分别编号为FL1、FL2、FL3、FL4、FL5和FL6。

2.2 分离株致病性测定

依照柯赫氏法则进行回接试验，将分离出来的6个菌株回接至水培的健康水曲柳枝条上。在接种后的10 d，接种了菌株FL1的枝条的皮孔明显肿大，而对照组和其他处理组未见明显变化。接种后的37 d，发现FL1处理组的枝条上产生了分生孢子器，孢子器颜色黑色，硬质。随后，从发病部位重新分离获得菌株培养后与接种菌株形态特征一致，由此认定菌株FL1为水曲柳枝枯病的病原菌。

2.3 病原菌鉴定

2.3.1 形态学鉴定

菌株FL1的形态学观察如图2所示，在PDA培养基上25 ℃恒温培养10 d，菌落直径达70 mm。培养3 d时，菌落表面呈白色绒毛状，气生菌丝发达，紧贴培养基生长，菌落边缘整齐，菌落背面白色。培养6 d时，菌落表面呈绒毛状，气生菌丝浅灰色，发达，长度是营养菌丝的两倍左右，紧贴培养基生长，菌落背面呈浅黄色圆形，边缘呈白色。培养10 d时，菌落表面呈绒毛状，气生菌丝深灰色，呈辐射状紧贴培养基生长，菌株背面呈深灰色，边缘白色。培养25 d时，菌落上散生黑色的分生孢子器，分泌有浅黄色的孢子角。分生孢子呈线状，单孢，无色透明，无隔。

2.3.2 分子生物学鉴定

以菌株FL1的基因组DNA为模板，使用真菌通用引物ITS1/ITS4进行PCR扩增，将PCR产物送去测序，获得病原菌FL1的基因序列为531 bp。在NCBI上进行Blast搜索相似性较高的参考序列，用MEGA11对获得的产物序列和参考菌株的序列进行校正，确定最佳进化模型为GTR + G + I，使用邻接法（NJ）重复1 000次建立系统发育进化树，分析结果表明菌株FL1与Diaporthe cotoneastri的同源性为98%，如图3所示。因此，结合形态学鉴定结果，确定病原菌为D. cotoneastri。

2.4 病原菌生物学特性分析

2.4.1 培养基对菌落生长的影响

菌株FL1在不同培养基上菌落生长情况如图4所示，病原菌在8种不同的培养基上均可生长。菌丝在PDA培养基中生长最快，菌丝致密，菌落直径达70.12 mm，其次为CMD、PMA、TDXA、PLA、MEA、MMN培养基，生长最慢为水曲柳树皮煎汁培养基，菌落直径为20.31 mm。7种培养基均与PDA培养基差异显著。

2.4.2 温度对菌落生长的影响

菌株FL1在不同温度下PDA培养基上的菌落生长情况如图5所示，病原菌在10 ℃ ~ 30 ℃下均可生长，但在10 ℃和15 ℃时菌落生长迟缓，在25 ℃时生长最迅速。不同温度的菌丝生长量都差异显著。

2.4.3 pH对菌落生长的影响

菌株FL1在不同pH值下PDA培养基上的菌落生长情况如图6所示，病原菌在5种不同的pH下均可生长。在pH = 6时菌丝生长最优，菌落直径达78.67 mm。pH = 8和pH = 9时菌丝生长差异不显著，与其他pH下的菌丝的生长量差异显著。

2.4.4 光照对菌落生长的影响

菌株FL1在不同光照下的PDA培养基上菌落生长情况如图7所示，病原菌在不同光照下均可生长。菌株在12L/12D培养条件下生长最快，菌落直径达为75.69 mm。完全光照和完全黑暗对两种菌株生长的影响不显著。

2.5 水曲柳枝枯病发生前后真菌多样性

2.5.1 感病前后样品的真菌群落结构差异性

通过与UNITE数据库比对，结合ASVs在不同样本中的分类学注释，共获得了507个ASVs，计算了两组的门水平和属水平的相对丰度。由表3可知：感病前后样品中的真菌群落结构组成基本相同，差异较大的是相对丰度。这说明两组样品中群落结构未发生根本改变。从真菌分类门水平看，两组占据主导地位的都是子囊菌门（Ascomycota），分别占88.90%和68.71%。其次是担子菌门，其他和未鉴定的真菌平均丰度分别为9.21%和28.96%。在属水平上，CK组占据主导地位的主要是亚隔孢壳属（Didymella，78.60%）、球针壳属（Phyllactinia，1.86%）和Neosetophoma（1.63%），B组3水曲柳枝枯病对真菌多样性的影响占据主导地位的主要是间座壳属（Diaporthe，20.23%）、亚隔孢壳属（Didymella，19.62%）和Arthrocatena（8.70%）。

2.5.2 Alpha多样性分析

基于抽平的ASVs数据绘制韦恩图，CK组和B组共有的ASV为86个，CK组特有的ASV为164个，B组特有的ASV为257个，如图8所示。

Alpha多样性分析采用抽平后的计算其群落丰富度指数（Chao1）和多样性指数（Shanno，Simpson），并通过事后检验计算其显著性（p值）。如图9所示，与CK组相比，B组的丰富度指数（Chao1）上升，同时多样性指数（Shanno，Simpson）显著上升，表明水曲柳枝枯病改变了水曲柳真菌的群落结构，提高了真菌的丰富度和多样性。

2.5.3 Beta多样性分析

使用Bray-Curtis距离评估了水曲柳枝枯病对样品真菌群落Beta多样性的改变，并进行了主坐标分析，如图10，图11所示，CK组和B组形成了不同簇，两组数据间分区良好，说明水曲柳枝枯病显著影响水曲柳真菌结构。

3 讨论与结论

枝枯病的发生比较普遍，国内外均有研究报导。研究表明，枝枯病病原菌的种类多，单一寄主上可能寄生多种枝枯病病原菌^[8]，同时一种病原菌可以寄生多种寄主，在病原菌传播阶段还能发生寄主跳跃现象^[9,10]。小新壳梭孢（Neofusicoccum parvum）可以引起核桃枝枯病、麻风树芽枯病和葡萄枝枯病^[11-13]。Diaporthe nobilis可以引起梨树枝枯病^[14]，桃拟茎点霉（Phomopsis amygdali）、D. eres和葡萄座腔菌（Botryosphaer dothidea）均可以引起桃树枝枯病^[15,16]。小新壳梭孢（N. parvum）、可可毛色二孢（Lasiodiplodia theobromae）、假可可毛色二孢（L. pseudotheobromae）和伊朗毛色二孢（L. iranensisdeng）等均可引起樟树枝枯病^[17]。本研究表明水曲柳枝枯病由D. cotoneastri引起，这与现有引起枝枯病的病原不同，并初步研究了病原菌生物学特性。

本研究分离纯化得到致病菌株FL1，将其鉴定为D. cotoneastri。在人工培养条件下，菌株最适生长环境为PDA培养基、25 ℃、pH = 6和12L/12D。水曲柳感枝枯病后，病皮内真菌种数量较健康皮变化明显，2组样品中真菌菌落结构基本相同，但相对丰度差异较大。在门水平下，子囊菌门(Ascomycota)是两组的优势真菌。在属水平下，亚隔孢壳属（Didymella）是健皮中的优势真菌，间座壳属Diaporthe是病皮中的优势真菌，其次是亚隔孢壳属（Didymella）。

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基金资助

国家自然科学基金项目(31670494)