金黄色葡萄球菌野生株与耐药株的竞争

The Competition between Wild-type Staphylococcus Aureus and Antibiotic-Resistant Strains

摘要

本研究旨在探究无抗生素药物压力环境中金黄色葡萄球菌野生型菌株与耐药型菌株竞争互作过程。选用野生型菌株ATCC6538和耐药型菌株P01为出发菌株，在液态培养基中接种共同培养32 h，通过在液体培养基中活菌密度消长动态判断两菌的竞争适应能力。结果表明：在单独培养过程中，菌株ATCC6538和P01活菌密度均可以达到10⁸ ~ 10⁹ CFU·mL^-1；而在混合培养过程中，菌株ATCC6538活菌密度均可以达到10⁸ CFU·mL^-1，菌株P01活菌密度达到10⁶ ~ 10⁷ CFU·mL^-1，即两菌株在无抗生素选择背景和同一环境中存在竞争关系。随着培养环境中活菌数量与营养资源变化，菌株ATCC6538与P01的竞争相互作用在初期处于菌液浓度变化相似，而在混合培养约12 h左右，菌株ATCC6538菌液浓度持续增长，菌株P01的菌液浓度转为下降趋势，最终以菌株ATCC6538获得竞争优势，即野生型菌株ATCC6538比耐药型菌株P01在混合后期表现出更高竞争能力。结果说明耐药性也会影响到细胞的代谢及功能性状而影响竞争适应性，而在生长过程中的变化表明资源可利用性也是两菌株共存竞争的重要影响因素。研究结果以期为微生物竞争关系的深入研究提供参考依据。

Abstract

This study aimed to explore the competitive dynamics between wild-type and drug-resistant strains of Staphylococcus aureus under antibiotic-free conditions. The wild-type strain ATCC6538 and the resistant strain P01 were co-cultured in liquid medium for 32 hours, and to evaluate the competitive adaptability of the two strains, we monitored the dynamic changes in their viable cell densities in the medium. During separate cultures, both ATCC6538 and P01 reached viable cell densities of 10⁸ to 10⁹ CFU·mL^-1. However, in the mixed culture, the viable cell density of strain ATCC6538 reached 10⁸ CFU·mL^-1, whereas strain P01 reached 10⁶ ~ 10⁷ CFU·mL^-1, indicating that in the absence of antibiotic selection pressure, the wild-type strain demonstrated superior competitive fitness compared to the resistant strain. During the early stage of co-culture, both strains exhibited similar changes in cell density, but approximately 12 h into the mixed culture, strain ATCC6538 continued to increase in density, while strain P01 began to decrease, ultimately leading to strain ATCC6538 gaining a competitive advantage, likely due to differences in metabolic efficiency and resource utilization. This suggests that the wild-type strain ATCC6538 exhibited greater competitive capability compared to the resistant strain P01 in the later stages of mixed culture. The development of antibiotic resistance has been shown to impose a metabolic burden on the cells, which can negatively impact cellular growth rates and functional traits, thereby reducing competitive fitness under nutrient-limited conditions. Moreover, changes during the growth process indicate that resource availability is also a crucial factor affecting coexistence and competition between the two strains. These findings provide a reference for further analysis of microbial competitive interactions.

Graphical abstract

关键词

金黄色葡萄球菌 / 混合培养 / 竞争 / 耐药性成本 / 活菌密度

Key words

Staphylococcus aureus / Mixed cultivation / Competition / Cost of drug resistance / Viable bacterial density

金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus，SA）是引起人体感染的常见条件致病菌^[1]。人类发现的第一个抗生素——青霉素（Penicillin）于1941年用于临床成为治疗SA感染的特效药。然而青霉素应用于临床的几年内就出现了能够水解青霉素的耐药SA，为解决这一严峻问题，科学家发现并合成了半合成青霉素——甲氧西林（Methicillin）。然而随着耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（Methicillin-resistant Staphylococcus aureus, MRSA）发现且难以用抗生素治疗及后续的万古霉素治疗SA失败也不断被报道^[2,3]。同时又有流行病学数据研究表明，耐药菌作为一种社区病原体可能走上了另一条进化道路，一种MRSA中发现的移动遗传元件（Staphylococcal Chromosome Cassette mec, SSCmec）可将来自正常人类菌群的抗生素敏感菌种转化为耐药菌种^[4]。时至今日MRSA已成为世界范围内医院和社区引起感染的主要病原菌之一，微生物耐药性事件和抗生素研发窘迫使相关的科研工作者认识到在未来产生新耐药性的威胁会持久存在。

Melnyk等统计研究得到细菌中的大多数耐药突变都会产生适应性成本，耐药适应性成本会使得耐药菌相对于其野生菌的部分代谢功能改变^[5,6]。那么，这样是否会有如《后汉书》中“失之东隅，收之桑榆”的哲理思想，金黄色葡萄球菌耐药性的获得是否也会使得其竞争适应力发生变化在获得耐药性能力的同时付出某种功能代价而失去与其野生型的竞争优势呢？Loh等强调将生态方法整合到人畜共患疾病研究中的重要性，相关生态过程是在理解传染病出现中的重要内容^[7]；Sanz-garcí等提出一种猜想是否能利用生态共存的理解找到解决处理掉抗生素应用与微生物耐药性进化权衡的策略^[8]。微生物种间相互作用会对自然界竞争的结果产生深远的影响^[9]，“野生菌种与耐药菌种种间的相互作用”更是被讨论的焦点，对于“野生株与耐药株的竞争共存”研究远少于对单一微生物的研究。本研究选择生长习性相似和对人类的健康影响很大的常见致病菌野生株SA和耐药株MRSA之间的竞争关系为研究对象。现代共存理论指出物种间的共存取决于生态位差异和平适应度差异^[10]。将研究方法聚焦于平均适应度差异，通过观察活菌数量动态变化解释它们的平均适应度和竞争作用差异以探讨野生菌和耐药菌因耐药差异而产生竞争适应能力的差异。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌种来源

本试验所用菌种为金黄色葡萄球菌模式菌株SA ATCC6538，后文中以“ATCC6538”代指；耐甲氧西林金黄色葡萄球菌菌株MRSA P01，后文中以“P01”代指，菌种来源于中国科学院病原微生物与免疫学重点实验室，保存于西藏高原森林生态教育部重点实验室。

1.1.2 主要试剂

注射用青霉素钠（规格：4.8 g（800 万U）/瓶），由瑞阳制药有限公司购入；TINAamp Bacteria DNA Kit、细菌通用引物（8F: 5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'; 1492R: 5'-GGTTACCTTGTTACGAC TT-3'）、dNTP、Taq DNA Polymerase、Primers、Buffer，均由上海派诺森生物科技有限公司购入。

1.1.3 培养基

Mueller Hinto、牛肉膏（Beef Extract）、胰蛋白胨（Casein Tryptone）、琼脂（Agar），均由北京陆桥技术责任有限公司购入。

液体牛肉膏蛋白胨培养基；固体牛肉膏蛋白胨培养基，记为“PNC-肉汤平板”，在1 000 mL液体牛肉膏蛋白胨培养基的基础上加16 g琼脂，121 ℃高压灭菌30 min，倒平板（规格：直径90 mm）；青霉素牛肉膏蛋白胨平板，记为“PNC+肉汤平板”：取青霉素钠溶液（1 万U/mL，将一瓶青霉素钠溶于800 mL无菌水配制而成）10 mL加入到500 mL灭菌冷至约55 ℃还未凝固的固体牛肉膏蛋白胨培养基，倒平板；液体LB培养基。

1.1.4 标准菌液

本研究所用标准菌液配制如下：按照方法1.2.4配制菌株ATCC6538与P01活菌密度约为1 × 10⁴ CFU·mL^-1的标准菌液。

1.2 方法

1.2.1 菌株形态观察

将保存于低温冰箱（- 80 ℃）的菌株ATCC6538和P01菌种的冻存管取出，在超净台中于PNC-肉汤平板上划线，置于培养箱（37 ℃）中培养24 h。为确保试验菌种的正确及其相关特性符合要求，从而保证后续试验结果的准确性，对两菌进行形态观察鉴定。观察生长菌落是否具有SA和MRSA的典型菌落形态和培养24 h的革兰氏染色后在光学显微镜下用油镜观察菌体形态。

1.2.2 16S rDNA检测

将菌株ATCC6538和P01分别接种于LB液体培养基中，置于摇床（37 ℃、200 r/min）培养24 h，使用TINAamp Bacteria DNA Kit提取菌株遗传物质。扩增其16S rDNA得到的PCR产物，寄送上海派诺森生物科技有限公司测序。测序结果于NCBI（https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/）进行序列比对，确定两菌株是否为金黄色葡萄球菌。

1.2.3 耐药性检测

从培养菌株ATCC6538和P01活化平板上挑取菌体，分别划线于PNC-肉汤平板和PNC+肉汤平板上，置于培养箱（37 ℃）中培养48 h。两菌株应都能在PNC-肉汤平板上生长；菌株ATCC6538应在PNC+肉汤平板上不能生长，而菌株P01应能在PNC+肉汤平板上正常生长，说明菌株P01耐药性正常，可用于后续试验。

1.2.4 竞争试验

1）标准菌液的制备方法在混合液体培养中，初始接种数量比例是影响竞争结果的关键因素^[11]。因此要求对接种菌体密度定量，需要对所接种的菌体进行密度标定。本试验以菌落形成单位（colony-forming units, CFU）计数，设计接种用菌液活菌密度为1.0 × 10⁴ CFU·mL^-1。从置于培养箱（37 ℃）培养24 h生长菌株ATCC6533平板和生长菌株P01平板上各挑取一个单菌落，分别加入1支盛有1.0 mL无菌生理盐水（溶有0.9% NaCl的蒸馏水并灭菌制得）的EP（规格1.5 mL）管中，用涡旋震荡仪震荡2 min，使菌液充分混均；用微量移液器吸取10 μL菌液加入到盛有10 mL无菌生理盐水的离心管（规格15 mL）中并用涡旋仪混匀，用移液器从匀液中吸取100 μL菌液加入到盛有10 mL无菌生理盐水的离心管（规格15 mL）中混匀。取100 μL菌液涂布于PNC-肉汤平板培养24 h，根据每毫升CFU数加入无菌生理盐水稀释菌体细胞含量至1.0 CFU·mL^-1× 10⁴ CFU·mL^-1作为菌株ATCC6538与P01的标准菌液。如菌体细胞密度不足1.0 × 10⁴ CFU·mL^-1，可离心去上清液加生理盐水重悬至该密度。将菌液置于4 ℃冷藏以保持菌体密度稳定。

2）单独接种培养及活菌密度计数方法为防止误差影响做3个重复。将1 mL标准密度菌液（1.0 × 10⁴ CFU·mL^-1）接入含99 mL液体牛肉膏蛋白胨培养基的三角瓶（容量为200 mL）中，置于摇床（37 ℃；200 r/min）培养。将单独培养菌液按0 ~ 32 h，每4 h取样测活菌密度。两菌在液体培养中0 h初始密度是两菌株标准菌液接种后的菌体密度为1.0 × 10² CFU·mL^-1，其余时间节点活菌菌液密度则通过平板菌落计数法获得。等待培养时间节点取菌液样品100 μL，稀释处理至适当密度后，涂布于PNC-肉汤平板，将其置于培养箱（37 ℃）中培养24 h统计平板单菌落数。

3）混合接种方法及活菌密度计数方法为防止误差影响做3个重复。将两菌株前后一同接种于含液体牛肉膏蛋白胨培养基的三角瓶中，总培养体积加至100 mL，置于摇床（37 ℃；200 r/min）培养。3种比例混合培养的菌株ATCC6538和P01标准菌液的接种量分别为A（1 mL:1 mL）比例、B（1 mL:5 mL）比例、C（5 mL:1 mL）比例。将混合培养菌液按0 h ~ 32 h，每4 h取样测活菌密度。A（1 mL:1 mL）比例、B（1 mL:5 mL）比例、C（5 mL:1 mL）比例的0 h活菌密度是两菌株标准菌液接种后的菌体密度，分别为100 CFU·mL^-1:100 CFU·mL^-1、100 CFU·mL^-1:500 CFU·mL^-1、500 CFU·mL^-1:100 CFU·mL^-1，其余时间节点通过平板菌落计数法获取单位活菌密度。等待培养时间节点取菌液样品100 μL，稀释处理至适当密度后，涂布于PNC-肉汤平板和PNC+肉汤平板上，培养24 h后计算单菌落数。PNC-肉汤平板上两菌均能生长，PNC+肉汤平板上只有耐药菌能够长出。因此，PNC-肉汤平板上的总CFU数减去PNC+肉汤平板上耐药型菌株P01的CFU数为菌株ATCC6538的CFU数。

1.2.5 数据分析

为了更好地了解多微生物生长竞争情况，探究同一液体培养基环境中多微生物竞争动态，需引入竞争指数（Competitive index, CI）。一般定义为“在特定时间点下突变型与野生型比例与起始时间点下突变型与野生型比例之比”。Macho等引入一个类似于CI的参数:相对增长率（Relative increase ratio, RIR）^[12]。与CI不同，RIR关注的是单独培养下各微生物的生长情况：一般定义为“在特定时间点下单独培养的突变型与野生型比例与起始时间点下单独培养的突变型与野生型比例之比”。基于同一液体培养混合培养菌体生长数量的CI通常用于评估在相同环境条件下，不同微生物物种之间的相对竞争能力。基于单独培养体菌体生长数量的RIR表示各微生物种在没有竞争的情况下，多种微生物在同一种环境下的适应能力，可作为CI对照值。

竞争指数计算公式：

CI=\frac{\frac{SAmixculture\left(outputCFU\right)}{MRSAmixculture\left(outputCFU\right)}}{\frac{SAmixculture\left(inputCFU\right)}{MRSAmixculture\left(inputCFU\right)}}（1）

RIR=\frac{\frac{SAmonoculture\left(outputCFU\right)}{MRSAmonoculture\left(outputCFU\right)}}{\frac{SAmonoculture\left(inputCFU\right)}{MRSAmonoculture\left(inputCFU\right)}}（2）

在上式中，如果CI值大于1，则表示第1种微生物比第2种具有更高的竞争力；如果CI值小于1，则表示第2种微生物具有更高的竞争力。本文结果值可能会很大，为了后续的数据展示，故将菌体密度、CI和RIR值取对数。CI或RIR对数值为0，说明两种微生物数量相当；如果CI或RIR对数值为正值，说明第1种微生物更有适应力（竞争力）；如果CI或RIR对数值为负值，说明第2种微生物更有适应力。

统计与分析及作图均通过Excel 2021、Origin 2022软件完成。

2 结果与分析

2.1 菌种鉴定结果

2.1.1 菌落形态

菌株ATCC6538的单菌落形态呈圆形，直径约为1.0 mm，较厚凸起，边缘整齐，呈较浓的金黄色，为典型的金黄色葡萄球菌的菌落形态；菌株P01的单菌落呈圆形，与菌株ATCC6538相比，直径相当，凸起略差，边缘整齐相当，菌落的金黄颜色较淡。

2.1.2 革兰氏染色

染色后两菌细胞颜色均为蓝紫色，形态均呈球形，直径均约0.6 μm，菌体细胞均呈葡萄串状排列，细胞形态均为葡萄球菌的典型菌体形态。

2.1.3 16S rDNA序列比对

菌株ATCC6538与菌株P01的16S rDNA碱基序列比对结果均为金黄色葡萄球菌种，且碱基序列相同。

2.1.4 耐药性检测

将菌株ATCC6538与P01用划线法分别接种于PNC-肉汤平板和PNC+肉汤平板上置于培养箱（37 ℃）中培养48 h后，取出平板观察P01菌种在两种平板上的生长情况，结果见图1。菌株ATCC6538在PNC-肉汤平板上生长良好，单菌落呈金黄色；菌株ATCC6538在PNC+肉汤平板没有观察到的菌落，表示菌株ATCC6538无法在含有青霉素的平板上生长繁殖。菌株P01在PNC-肉汤平板和PNC+肉汤平板上都能生长良好。比较菌株P01在2种平板上的生长状况，不论是菌落还是菌苔的长势都没有明显差异，说明菌株P01对青霉素的耐受性正常。而无论是否在青霉素背景下培养的均存在菌株P01菌落金黄颜色较浅。菌株ATCC6538和菌株P01可以用于后续的共存竞争试验。

2.2 标准密度菌液的制备

制备菌株ATCC6538与菌株P01标准密度菌液，配制过程参数如下表1。

2.3 菌株ATCC6538与P01培养活菌密度结果与分析

2.3.1 两菌单独液体培养结果与分析

在图2中，单独培养菌株ATCC6538和P01的生长曲线相似，各培养时间节点的RIR对数值均接近于零，说明两菌的种群在同一环境下培养增长速率相似，并没表现差异。在0 ~ 12 h阶段，菌株ATCC6538和P01快速繁殖，种群密度快速增加；12 ~ 24 h阶段，种群增长率下降，可能是活菌密度逐渐增加和营养物质的不断消耗，使得种群密度不断接近环境容纳量，发生种群密度效应。菌株ATCC6538和P01活菌密度均可以达到10⁸ ~ 10⁹ CFU·mL^-1，随后达到种群密度稳定期。

2.3.2 菌株ATCC6538与P01混合液体培养竞争结果与分析

3种初始比例混合培养过程中，两种微生物均表现为在0 ~ 12 h大量增殖（图3）。菌株ATCC6538活菌密度均可以达到10⁸ CFU·mL^-1，随后达到与单独培养下最高种群密度的数量级而进入稳定期；菌株P01活菌密度达到10⁶ ~ 10⁷ CFU·mL^-1，后进入短暂的稳定状态，随后活菌密度便开始呈下降趋势。3种不同初始接种比例使得两菌种达到活菌密度峰值的时间提前和后移，但都最终均为菌株ATCC6538获得竞争相互作用优势。而约28 h后菌株ATCC6538的活菌密度也开始发生下降趋势，可能是因为营养成分消耗殆尽和代谢物质浓度较高使菌体死亡数量大于菌体新生数量。

对比图2、图3，菌株ATCC6538与P01在单独培养下活菌密度增长率(0 ~ 4 h阶段的代时菌株ATCC6538、P01分别为25.83 min、25.61 min；0 ~ 8 h阶段的菌株ATCC6538、P01分别为31.78 min、31.78 min)与1:1初始接种比例混合培养下活菌密度增长率(0 ~ 4 h阶段每代时菌株ATCC6538、P01分别为47.66 min、46.88 min；0 ~ 8 h阶段每代时菌株ATCC6538、P01分别为45.10 min、46.69 min)有较大差别。而试验室条件下，金黄色葡萄球菌的繁殖速度可以达到每代时20 min。显然，单独培养与混合液体活菌的增值代数存在差异说明两菌株存在竞争相互作用。但测定菌体密度的频率为4 h/次，无法确定0 h ~ 4 h内何时或者何活菌密度下开始发生竞争相互作用。

图3 b中，3种比例混合培养在4 h节点的CI指数皆为负值，A比例在8 h为负值随后转变为正值，A与B比例转变为正值，得到接种比例影响到竞争过程。CI竞争指数的在0 ~ 8 h段内出现的负值，可能表示P01可能处于轻微竞争相互作用的优势方或者平衡共存状态。结合菌株ATCC6538和P01单独培养过程当中的RIR大多为负值比较，这也可能表示菌株P01的生长速度可能稍优于菌株ATCC6538。所以菌株P01在竞争相互作用中，可能因在繁殖速度差异原因产生一定的竞争相互作用优势。

0 ~ 8 h阶段混合液体培养中的菌株ATCC6538与P01的竞争能力是相似的。在8 ~ 16 h，对于单独液体培养中菌株P01并没有出现因为自身活菌密度、代谢浓度上升与资源浓度下降等原因而与菌株ATCC6538的活菌密度增长速率有较大差别；而在混合培养中出现了竞争相互作用，所以可能是在于高菌体密度下两菌种的竞争相互作用变大。菌株ATCC6538转变为竞争相互作用优势方，菌株P01转变为竞争相互作用劣势方。最后，将完全混合液体培养的两菌种竞争过程大约分为三段时期，前期（竞争平衡期）、中期（菌株ATCC6538优势期）与后期（营养耗尽期）。

3 讨论

3.1 金黄色葡萄球菌野生型与耐药型的竞争相互作用与定殖分布探讨

在完全混合培养过程中，前期营养浓度高、活菌密度小的情况下野生型菌株ATCC6538与耐药型菌株P01处于竞争相互作用平衡状态；随着营养物质消耗和活菌密度增加、代谢浓度上升的逐渐变化过程中，野生型菌株ATCC6358逐渐在竞争互相作用中变为优势，这与Miller等研究做出“物种优势度将随着资源比例的浓度而改变”的结论相符合^[13]。然而，野生型菌株ATCC6538在竞争中占据优势，这与Rao等研究发现，MRSA在竞争过程逐渐占据优势的结果不完全相同^[14]。Rao等还得出MSSA（Methicillin-sensitive Staphylococcus aureus）与MRSA之间的相互作用是可变的结论，这可能是选取不同种类分型的金黄色葡萄球菌或其与本培养环境存在差异所致^[10,14-16]。此外，Zago等研究得到白色念珠菌、MSSA和MRSA可以以协同共存方式存在于生物膜中，可能是因为此类微生物可以通过生物膜的方式产生非直接接触生存空间^[17]。完全混合环境中菌株ATCC6538与P01的竞争相互作用和环境背景各物质浓度具有相关性。

有MRSA定殖人鼻孔的研究得到在没有抗生素干扰背景的情况下，内源性MSSA鼻孔定植不能防止MRSA感染^[18]；另一部分医疗机构患者入院人群鼻孔MSSA和MRSA定殖分布统计研究中，MRSA定殖的占人群8%、MSSA定殖的占人群17%、MRSA与MSSA共定殖占人群0.6%^[19]。定殖与MSSA的定殖无相关性，MRSA定殖的数量比MSSA少得多，这可能是MRSA的定殖与MRSA之间菌种的表型相关。多项流行病统计研究也表明有许多耐药型微生物在没有抗生素压力环境下，虽然种群数量会下降，但也能长期存在自然环境中^[5]。

Larsen等报道了野生动物中临床相关抗生素耐药性基因的进化以及自然、农业和人类生态系统的连通性，同时表明耐甲氧西林耐药性的出现早于抗生素的临床使用^[20]。选择压力不是引起耐药基因出现的内因，耐药性微生物大量存在与环境选择相关^[21]。这也一定程度体现了耐药型与野生型微生不适合生于无抗生素压力选择的环境中耐药型菌种与处于同一生态位野生型菌种的竞争中处于不利而不能成为优势菌种；也展现出无法从自然环境中容易分离耐药菌种。然而这却不符合上述竞争与定殖讨论的内容，可能是因为金黄色葡萄球菌种的各亚型之间相互作用多样复杂及与人类的各种对自然环境的改造影响^[16]。这体现了现代物种共存机制中以环境背景和物种适应力是物种共存相互作用的两大焦点。

3.2 野生菌种获得耐药性对其适应性能力造成影响

Lehtinen等阐述了一个简单的种群模型预测，由于耐药菌种和敏感菌种在同一环境竞争，更适合生存的菌种应该排除较弱的菌种，主要由抗菌药物暴露水平和耐药成本决定^[22]。耐药基因的表达可能产生过多代谢成本，即耐药性成本^[23]。细胞的生长速度不可能无限制地增加，进化会通过优化细胞内部资源的分配来平衡生长和生存的需求^[24,25]。将有限的内部资源分配给细胞生长所需的各种功能时，总是存在权衡，这可能会导致其他代谢途径受到影响，从而干扰细胞功能。例如，假单胞菌对氟喹诺酮类的耐药性可导致运动性受损^[26]，对氨基糖苷类的耐药性可改变核糖体的结构^[27,28]。

将MRSA和MSSA菌种进行代谢比较，代谢差异主要与荚膜和细胞壁生物合成途径、杆菌硫醇的积累以及嘌呤/嘧啶代谢有关^[29]。MRSA能够表达mec基因，该基因通过细胞膜的青霉素结合蛋白结构的改变赋予其对β-内酰胺类抗生素的耐药性^[30,31]。敏感株与耐药株之间还包括SigB和SarA等调节因子的表达差异^[32-34]。SigB因子调节细胞膜合成(包括青霉素结合蛋白、葡萄球菌黄素合成的调节)参与调控应激反应基因以帮助细胞应对环境压力^[35,36]。SarA因子的表达差异调节着多种毒力因子和表面蛋白的表达，影响细菌的毒力和适应性^[37]。同时，SarA因子参与调控细胞壁合成和细胞膜的功能，影响细菌的生存和抗性^[33,38]。试验结果观测得到耐药型菌株P01的色素沉着弱于野生型菌株ATCC6538的色素沉着。且有研究得到能通过金黄色葡萄球菌落橙黄颜色深度可代表葡萄球菌黄素的产量^[39]。King等研究得MRSA的SigB因子活性增加导致抗氧化色素葡萄菌黄素的产量上升^[40]，这可能与本研究的菌种之间耐药性差异与表型差异之间产生相关性。葡萄菌黄素是一种类胡萝卜素色素，赋予金黄色葡萄球菌特有的金色，并防止氧化应激及提高细胞膜的刚性^[41,42]。因此，不同色素沉着的金黄色葡萄球菌在抗氧化性和细胞膜的质量上存在差异。两菌菌落形态具有差异表示菌株ATCC6538与P01具有对β-内酰胺类等抗生素的耐受性差异，其情况也可能反映在其菌落表型差异上。SA对β-内酰胺类抗生素的耐药性突变会对其部分功能产生影响，基因表达差异可能导致病原性和环境适应性上的不同表现。

野生型菌株ATCC6538的竞争优势的原因可能是具有更高的竞争适应性，而耐药性菌株P01耐药性获得可能会影响耐药株的代谢机制和功能特性，菌株P01在资源偏匮乏或者资源可用性低时竞争力下降。所以资源可用性和耐药性成本是解释耐药型与敏感型共存和竞争排除的重要因素。然而，关于两菌株的竞争适应性代谢机制仍不清楚，需要进一步研究微生物共存相互作用机制。此外，鉴于此菌种的类型多样性，不同的MSSA和MRSA及其克隆系之间的竞争力差异研究仍可能是未来研究的一个重要领域^[43]。

4 结论

（1）在单独培养条件下，野生型菌株ATCC653和耐药型菌株P01的生长繁殖速率并无显著差异。在混合竞争中，野生型菌株ATCC653表现出比耐药株P01更强的竞争优势。

（2）两菌株的竞争适应能力不仅依赖于是否存在抗生素的环境，同时也可能受到相对营养环境条件变化及其限制的影响。因此，在评估测试这两株菌株的竞争力（适应力）时，还应综合考虑不同环境因素的综合作用。

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基金资助

国家自然科学基金资助项目(31960013)

西藏自治区自然科学基金重点项目(XZ202301ZR0047G)

西藏自治区科技计划项目(XZ202301YD0028C)

西藏高原森林生态教育部重点实验室开放课题项目(XZA-JYBSYS-2024-09)

西藏高原森林生态教育部重点实验室开放课题项目(XZA-JYBSYS-2023-15)

西藏农牧学院研究生教育创新计划项目(YJS2024-43)