云南沙棘三萜类化合物提取纯化工艺研究

A Study of Extraction and Purification Process of Triterpenoids from Seabuckthorn Fruits in Yunnan

摘要

云南沙棘含有丰富的具有降血糖活性的三萜类化合物成份。为建立云南沙棘中降血糖有效成分的提取纯化工艺，本研究以云南沙棘果为原料，通过乙醇提取、AB-8大孔树脂纯化等方法获取三萜类化合物。结果表明，云南沙棘中三萜类化合物最佳提取工艺为：液料比40：1 mL/g，乙醇浓度65%，提取温度57 ℃，提取时间30 min。AB-8大孔树脂最佳吸附条件、解析条件为：样品浓度为20 mg/mL，pH为6，吸附流速为2.5 mL/min，乙醇浓度为55%；纯化后，纯度提高2.49倍。该方法稳定可行，可用于提取纯化云南沙棘三萜类化合物。

Abstract

Yunnan sea buckthorn is rich in triterpene acids with hypoglycemic activity. In order to establish the extraction and purification process of hypoglycemic active ingredients in Tibetan seabuckthorn, this study used Yunnan seabuckthorn fruit as raw material to obtain triterpenoid acid by ethanol extraction and AB-8 macroporous resin purification. The results showed that the optimum extraction conditions were as follows: liquid-solid ratio 40 mL/g, ethanol concentration 65%, extraction temperature 57℃, extraction time 30 min. The optimum adsorption and desorption conditions of AB-8 macroporous resin were as follows: the sample concentration was 20 mg/mL, the pH was 6, the adsorption flow rate was 2.5 mL/min, and the ethanol concentration was 55%. After purification, the purity increased by 2.49 times. This method proved stable and feasible, and can be used for the extraction and purification of triterpene acids from Yunnan seabuckthorn.

Graphical abstract

关键词

沙棘 / 三萜类化合物 / 提取纯化 / 均匀试验

Key words

Seabuckthorn / Triterpenic acid / Extraction and purification / Homogeneous test

沙棘(Hippophae rhamnoides L.)作为胡秃子科沙棘属的一种多年生灌木或乔木，广泛分布于中国、印度、俄罗斯、芬兰及蒙古等欧亚国家，特别是在我国西部地区，沙棘已成为最具代表性的生态经济林树种之一^[1,2]。西藏有大约10万hm²的野生自然沙棘林，主要分布于西藏林芝地区的察隅、波密和米林，那曲地区巴青和申扎，阿里地区改则和日土，吉隆和定日，山南错那等，其海拔高度都处于1 000 ~ 5 200 m之间^[3-5]。因资源分布、交通条件、基础研究等制约，西藏地区沙棘资源一直未进行产品加工。在《晶珠本草》《藏药志》等古籍中沙棘含有黄酮、三萜类化合物、非淀粉多糖及氨基酸等多种有效组分均有记载^[6,7]。

沙棘不仅以其独特的生态适应性和经济价值受到关注，其果实更是因其丰富的营养和功能而备受瞩目。三萜类化合物类化合物是沙棘果中重要的活性成分，其中五环三萜类化合物最为丰富，以游离或苷类形式存在，主要包括熊果酸( UA )、齐墩果酸( OA )、山楂酸( MA )、科罗索酸( CA )和白桦脂酸( BA )等^[6,7]。研究表明，UA不仅降低糖尿病小鼠体内血糖、甘油三酯( TG )、游离脂肪酸( FFA )和总胆固醇 ( TC )等生理生化指标，还通过增加糖原合成和葡萄糖吸收，发挥胰岛素促泌剂和模拟剂的作用^[8]。Ma^[9]等研究表明，UA具有抗CCl₄致小鼠肝纤维化的作用，与OA类似，UA通过抑制固醇调节元件结合蛋白-1c ( SREBP-1c )的表达改善大鼠脂肪肝^[10]；UA降低天门冬氨酸氨基转移酶（AST）、丙氨酸转氨酶（ALT）对肝脏的损伤作用^[10]，改善液态果糖诱导的大鼠IR^[11]，链脲佐菌素（STZ）致糖尿病大鼠胰岛素敏感性及糖原合成增加^[12]，MA促进HepG2细胞糖原合成，抑制糖原磷酸化酶活性，对小鼠酒精性肝损伤有保护作用^[12]；CA减少T2DM斑马鱼模型糖原降解，增加葡萄糖消耗；BA通过激活AMP活化蛋白激酶( AMPK )磷酸化，抑制SREBP-1c表达可减轻非酒精性脂肪性肝病的发生^[13]。

当前，围绕云南沙棘（H. rhamnoides subsp. yunnanensis Rousi）中三萜类化合物的研究还处空白，本研究即采用超声辅助提取法提取云南沙棘果实中的总三萜，运用比色法以沙棘总三萜提取率为指标，通过单因素试验、均匀试验探究云南沙棘总三萜提取工艺，在此基础上，采用大孔吸附树脂纯化工艺，获得高纯度沙棘三萜类化合物，为后续相关产品的开发提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料

云南沙棘鲜果（鉴定人:罗建，植物学教授，西藏农牧大学）均采自西藏自治区林芝米林市南依沟，采用真空冷冻干燥进行处理得沙棘果渣粉（去籽）。

1.2 试剂与仪器

1.2.1 试剂

香草醛、高氯酸、冰乙酸、乙醇均为分析纯（国药集团化学试剂有限公司）；AB-8大孔树脂、D101大孔树脂、X-5大孔树脂、HPD-100大孔树脂、HPD-300大孔树脂、HPD-450大孔树脂；（源叶化学试剂有限公司，优级纯，纯度≥ 99.0%），齐墩果酸标准品（源叶化学试剂有限公司，纯度≥ 98.0%）。

1.2.2 主要仪器设备

UV-6100紫外可见光分光光度仪：上海元析仪器有限公司；Vortex 2涡旋混合器：德国IKA公司；PURIST超纯水仪：上海乐枫生物科技有限公司；台式冷冻离心机：湖南湘仪实验室仪器开发有限公司。

1.3 方法

1.3.1 齐墩果酸标准曲线的绘制和样品总三萜含量的测定

参考宋福江^[14]制作标准曲线，得回归方程：

\begin{array}{cc}Y=\mathrm{2.33384}x+\mathrm{0.005},& r=\mathrm{0.9997}\end{array}（1）

样品测定方法：精密吸取试样1 mL于10 mL的塞塞管中，用水浴氮吹吹干，然后按0.5 mL的新配制的5 %的香草醛-冰醋酸试液和1.4 mL的高氯酸混合均匀。在60 ℃的水浴中浸泡30 min，在冰水浴中（流动）15 min，然后将其与冰醋酸溶液混合。在547 nm处测量吸收率，用线性回归法求出总三萜的含量。总三萜提取率（%）用下式表示：

Y=(C\times V)/M\times \mathrm{100}\mathrm{\%}（2）

式中，C（mg/mL）为样品的总三萜浓度，V（mL）为滤液的总体积，M（mg）为原料的重量。

1.3.2 单因素试验设计

参考谭志梅^[15]研究，确定料液比、超声时间、超声温度、乙醇浓度为4个因素为本研究中影响云南沙棘果三萜类化合物提取的主要因素；通过预实验确定研究范围，分别为料液比为1:10 ~ 1:40 g/mL；提取时间为25 ~ 60 min；超声温度为30 ℃ ~ 65 ℃；乙醇浓度为50% ~ 90%。

称取沙棘果渣粉末1.0 g，以总三萜提取率为指标，固定其他变量(乙醇浓度80%、超声温度40 ℃、超声时间30 min和料液比1:20 g/mL)，考察乙醇浓度(50、55、60、65、70、75、80、85、90%)、超声温度(30、35、40、45、50、60、65 ℃)、超声时间(25、30、35、40、45、50、55、60 min)和料液比(1:10 g/mL、1:15 g/mL、1:20 g/mL、1:25 g/mL、1:30 g/mL、1:35 g/mL、1:40 g/mL)对总三萜提取率的影响。

1.3.3 混合水平均匀试验设计

根据单因素筛选料液比、超声时间、超声温度、乙醇浓度的结果，选取超声温度3水平，料液比、超声时间和乙醇浓度6水平设计混合水平均匀试验，见表1。试验方案见表2。

1.3.4 大孔树脂纯化沙棘总三萜

（1）沙棘提取液的制备：称取干燥后的沙棘果粉112 g，根据方法1.3.3进行样品制备，得上清液，将上清液放入旋转蒸干器中蒸干，浓缩后，所得粗三萜粗品溶液中添加硅藻土除去大分子蛋白质及糖类，然后用石油醚进行脱脂处理，乙酸乙酯萃取。上层提取液部分真空浓缩，-20 ℃保存备用。

（2）大孔树脂预处理：参考Yan et al.^[16]所述的大孔树脂预处理。首先，用无水乙醇浸渍树脂24 h，再用去离子水对其进行完全冲洗。其次，用5%盐酸浸渍洗过的树脂5 h，再用去离子水清洗，使其具有中性。第三步骤，用5%氢氧化钠浸渍该树脂5 h，然后用去离子水清洗，使其具有中性。最后，将所制备的树脂通过定量滤纸（φ9 cm，孔径 ≤ 20 μm）吸附于树脂上，并回收其用于后续的实验。

（3）静态吸附与解吸实验：将大孔树脂（X-5、AB-8、D-101、HPD-100、HPD-350、HPD-400）各2.0 g，加入100 mL锥形烧瓶内。接着，在25 ℃、125 r/min的恒温振荡器中连续摇动24 h。当吸附平衡时，以15 mL 70%的乙醇为溶剂，以与吸附条件相同的振动参数进行过滤^[17]。各树脂对应的吸附解吸比按以下公式计算：

\mathrm{吸附}\mathrm{量}=(C_{\mathrm{0}}{V}_{\mathrm{0}}-C_{\mathrm{1}}{V}_{\mathrm{1}})/C_{\mathrm{0}}{V}_{\mathrm{0}}（3）

\mathrm{解吸}\mathrm{率}=(C_{\mathrm{1}}{V}_{\mathrm{1}}-C_{\mathrm{2}}{V}_{\mathrm{2}})/C_{\mathrm{1}}{V}_{\mathrm{1}}\times \mathrm{100}\mathrm{\%}（4）

式中C₀ 为总三萜溶液的初始浓度（mg/mL）；V₀ 为样品溶液的初始体积；V₁ 为吸附后样品溶液的体积（mL）；C ₁ 为吸附后样品溶液浓度（mg/mL）；C₂ 和V₂ 为解吸后样品溶液的浓度（mg/mL）和体积（mL）。

（4）动态吸附与解吸实验：将AB-8大孔树脂（20 g）湿装到树脂柱上，每10 mL收集一管流出液，测定流出液的总三萜浓度。绘制树脂动态泄漏曲线，确定最佳进料量。用不同浓度的样品溶液（1 ~ 6 mg/mL）吸附吸附树脂，按上述方法吸附并计算吸附比。用HCl（0.1 mol/L）和NaOH（0.1 mol/L）将粗总三萜溶液的pH调整到不同的值（3 ~ 7），按上文所述进行吸附，计算吸附比。同样，也计算了上样流速（1.0 ~ 3.0 mL/min）。此外，用不同的乙醇溶液（10% ~ 90%，v/v）对吸附树脂进行解吸，并计算解吸比。在基于前述的动态吸附与脱附实验之上，确定了最优的上样参数与洗脱流程。随后，在这些经过优化的条件下执行洗脱操作，过程中每10个床体积（BV）为单位收集一次洗脱液。为了定量分析各洗脱组分中的总三萜含量，采用了UV分光光度法进行检测。最终，根据所得数据，绘制出了一条动态洗脱曲线，以直观展现总三萜在洗脱过程中的浓度变化。

（4）纯度计算：按照优化后的工艺条件，对粗品总三萜进行了动态吸附脱附实验。将萃取后的洗脱物在50 ℃旋转蒸发器中进行浓缩，然后采用冻干工艺得到干燥产物。对产品进行称重后，将其均匀分散于乙醇中，制备成样品溶液。接着通过测定该样品溶液的浓度，并依据特定公式，我们能够计算出总三萜的纯度。

\mathrm{纯度}(\mathrm{\%})=m/M\times \mathrm{100}\mathrm{\%}（5）

式中：m为三萜类化合物质量（g）；M为干燥后样品质量（g）。

1.4 统计与分析

所有实验重复3次，采用 DPS v9.10 数据处理软件进行数据分析和处理，数据以均值 ± 标准差(SD)表示。差异的显著性采用单因素方差分析(ANOVA)结合SPSS 20.0软件进行Duncan检验，p < 0.05和p < 0.01，用origin 9.3作图。对均匀设计的试验结果使用二次多项式回归分析方法，通过数学模型模拟获得最优配方。

2 结果与分析

2.1 单因素试验结果

2.1.1 料液比对总三萜提取率的影响

由图1可知，在料液比为1:10 ~ 1:40 g/mL范围内，沙棘果中总三萜提取率呈现先上升后趋于平缓。当料液比达到1:25 g/mL时，沙棘果中总三萜提取率达到最高，为7.76 %。此后，随着料液比的进一步增加，提取率趋于平缓且有下降趋势。这可能由于浓度梯度的增加导致的，传质驱动力引起沙棘果中总三萜提取率下降^[18]，故超声提取沙棘果中总三萜最佳料液比为1:25 g/mL。

2.1.2 超声时间对总三萜提取率的影响

由图2可知，在超声时间为10 ~ 60 min范围内，沙棘果中总三萜提取率呈现先升高后降低的趋势。当超声时间达到40 min时，沙棘果中总三萜提取率达到最高，为9.65 % 。此后，随着超声时间的进一步增加，提取率有下降趋势。这可能由于超声波的空化和机械效应促进了物料与溶剂的充分混合，提高了总三萜的溶解度^[19]，然而超声时间40 min后，提取率反而有所下降，这是由于超声波的作用时间过长，会使三萜类化合物的结构发生变化，或者是有更多的杂质被引入，从而导致提取率下降^[20]。故超声提取沙棘果中总三萜最佳超声时间为40 min。

2.1.3 超声温度对总三萜提取率的影响

由图3可知，在超声温度为30 ℃ ~ 65 ℃范围内，沙棘果中总三萜提取率呈现先升高后降低的趋势。当超声温度达到60 ℃时，沙棘果中总三萜提取率达到最高，为7.64 %。沙棘总三萜提取率的初始增加可归因于溶剂渗透的增加和传质动力学的改善，从而促进了从植物基质中释放更多的三萜类化合物。然而过高的温度可能会导致三萜类化合物的热降解，最终导致所观察到的升高温度下TTY降低^[21]。故超声提取沙棘果中总三萜最佳超声温度为60 ℃。

2.1.4 乙醇浓度对总三萜提取率的影响

由图4可知，在乙醇浓度为50 % ~ 90 %范围内，沙棘果中总三萜提取率呈现先升高后降低的趋势。当乙醇浓度达到60 %时，沙棘果中总三萜提取率达到最高，为10.45 % 。这可能由于三萜类化合物的疏水性，基于相似相溶原则，较高的乙醇浓度有利于三萜类化合物的提取^[22]。故超声提取沙棘果中总三萜最佳乙醇浓度为60 %。

2.2 混合水平均匀实验优化结果

从表2中可以看出，试验组17的提取率最大，该组试验为直观最优。因试验组17的拟合误差最小为-0.0008，故选择试验组17为参数进行验证试验。

使用 DPS9.10软件，将表格中的数据抽取速率作为目标函数（Y），进行二次多项式的逐步回归分析，得出的回归方程式是：

Y=-104.6312+2.9329X₁ +0.6117X₂ -0.0973X₃ +0.7189X₄ -0.0249X₁ *X₁ -0.0049X₂ *X₂ -0.0005X₃ *X₃ -0.0039X₄ * X₄ +0.0005X₁ *X₃ -0.0025X₁ *X₄ +0.0029X₂ *X₃ -0.0023X₂ *X₄ -0.0026X₃ *X₄。

通过对回归方程的检验，得出了多重相关系数 R=0.9988，从这一点可以看出，三萜类物质的提取率和回归方程中各实验因子的含量之间存在着密切的相关关系，其显著性检验值F值为1910.7636, P值=0.0001 < 0.01，残余差标准差 SSE=0.04860663，校正后的相关系数 Ra=0.9986，表明该方程的可靠性较高。各实验因素回归系数及 t检验值显示于下表。

从该表3可以看出，上述4个因子的方差分别为X₁（超声波温度）和X₄（料-液比例）、X₂（乙醇浓度）和X₃（超声时间）之间的相互关系，以及X₁（超声温度）X₂（乙醇浓度）X₃（超声时间）和X₄（料液比）这4个因子的方差（p值）都在0.01以上，这表明它们对总三萜的提取率有很大的影响，达到了非常显著的水平。观测值，拟合值，拟合误差列于表2中。

2.3 均匀设计试验结果的验证

利用 DPS9.10软件对沙棘总三萜的超声波提取，采用数学建模仿真，得出最佳超声波提取工艺参数如下表所示，并与最佳配方17进行比较验证。结果见下表4所示。

表4可知，在试验理论最优条件下，料液比为1:40 g/mL，乙醇浓度为61.1788%，超声温度为60 ℃，超声时间为30 min，沙棘果中总三萜的最大预测提取率为10.72%。考虑到提取工艺实际操作，将提取条件修改为：料液比为1:40 g/mL，乙醇浓度为61%，温度为57 ℃，提取时间为30 min。经校正后的总三萜含量可达10.26%，与理论计算结果吻合较好，表明所建立的数学模型能较好地预测总三萜的含量。

为了预测自变量和因变量之间的关系，我们建立了各2因素之间的互作三维图，如图5所示。这一3D曲面可以直观地说明两个测量变量间的交互作用，也可以直观地说明各参数对试验结果的影响。

2.4 不同大孔树脂对总三萜的静态吸附和静态解吸结果

如图6所示，研究了6种不同性质的大孔树脂，以选择吸附和解吸能力最好的一种。AB-8树脂吸附量解吸率最大，分别为12.60 mg/g、66.76 %。天然三萜类成分均能较好地被弱极性树脂所吸收，且与其它三萜类成分比较，AB-8的极性较大，且孔径较大，对有较强的吸附作用^[23,24]。并以AB-8树脂为材料，研究了该树脂对沙棘三萜类化合物的吸附/脱附性能。

2.5 AB-8大孔树脂静态吸附动力学曲线

如图7所示，从0 ~ 360 min范围内，AB-8大孔树脂对沙棘果的总三萜吸附量呈现先上升后趋于平缓。当吸附时间为240 min时，沙棘果的总三萜吸附量最大，为20.84 mg/g，此后，随着时间的进一步增加，吸附量趋于平缓且有下降趋势，这表明树脂已达吸附饱和。这可能由于初始吸附速度高是在树脂上有足够的吸附区域及吸附位点。随着时间增加沙棘果的总三萜在树脂表面积聚时，分子间斥力及传质阻力增大，沙棘果的总三萜难以被吸附，从而降低了吸附速率^[25]。故AB-8大孔树脂对沙棘果的总三萜最佳吸附时间为240 min。

2.6 上样溶液浓度对动态吸附的影响

如图8所示，在20 mg/mL的条件下，吸附效果最好。在30 mg/mL的条件下，吸附量有轻微的降低，差异非常显著（p<0.01）。这可能是因为更高的浓度会阻碍AB-8树脂的流动，进而减少低吸附量^[26]。因此，选取20 mg/mL的试样溶液作吸附溶剂。

2.7 上样溶液PH对动态吸附的影响

如图9所示，pH值为3 ~ 5时，吸附量增大，pH值为6时吸附量最大。随pH值增加，三萜类化合物的吸附量逐渐下降（p < 0.01）。一般而言，酸性条件下，总三萜类水解物的溶出和提高其吸附能力^[27,28]。因此，最适pH为6。

2.8 上样流速对动态吸附的影响

图10为上样流速对总三萜吸附量的影响显示，在1 ~ 3 mL/min的吸附量总体上是先上升后降低的，2.5mL/min的吸附率达到最高，为11.71 mg/g。研究发现，吸附速率随上样流速的增大而降低，其原因可能与吸附性能有关^[29]。这可能是由于上料流速增加，所含沙棘果的总三萜不能被树脂完全吸收，从而从树脂柱中排出。在较低的上样流速下，可以提高吸附率，但会延长吸附时间。因此，根据上述结果，优选的上样流速是2.5 mL/min。

2.9 泄露曲线的考察

如图11所示，当上样量为11 BV时，沙棘果的总三萜漏失量急剧增加，并迅速增加，当上样量为10-11 BV的时候，已达到吸附饱和状态。

2.10 不同乙醇浓度洗脱时的解吸效果

如图12所示，乙醇浓度对树脂脱附特性的影响很大。由曲线可以看出，当乙醇浓度由10 %增至50 %时，脱附速率也逐渐增大，当乙醇浓度为50 %时，解吸速率最大，为60.29 %。 故50 %的乙醇为较佳的乙醇浓度。

2.11 动态解吸曲线的考察

从图13中所得，收集到第7 BV时，吸附在大孔树脂上的总三萜已全部洗脱完毕，所以1-7BV为三萜类化合物的洗脱液，洗脱剂用量为70 mL。

2.12 所得样品总有效成分的纯度测定

以AB-8大孔树脂为研究对象，以20 mg/mL、pH 6、上样流速2.5 mL/min为优化条件。在乙醇浓度为55%的条件下，得到了较好的动力学脱附条件。分离纯化后，用旋流式蒸发器对提取物进行浓缩，然后进行冻干，从而获得沙棘三萜类化合物。纯化后样品中总三萜的纯度为64.33%，高于纯化前51.47%的含量。

3 结论

本研究以云南沙棘果为原料，通过乙醇提取、AB-8大孔树脂纯化等方法获取三萜类化合物。结果表明，云南沙棘中三萜类化合物最佳提取工艺为：液料比40 ml/g，乙醇浓度65%，提取温度55 ℃，提取时间45 min。AB-8大孔树脂最佳吸附条件、解析条件为：样品浓度为20 mg/mL，pH为6，吸附流速为2.5 mL/min，乙醇浓度为55%；纯化后，纯度提高2.49倍。该方法稳定可行，可用于提取纯化云南沙棘总三萜。因此，本研究为云南沙棘中总三萜的工业化生产提供了理论依据，并为进一步研究总三萜作为功能性产品提供依据。

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基金资助

西藏科技(XZ202201ZD0001N)

西藏农牧学院研究生创新计划资助项目(YJS2024-52)