西藏林芝某养殖场牦牛源大肠杆菌分离鉴定与耐药性分析

Identification and Antibiotic Resistance Analysis of Escherichiacoli Isolated from Yaks in a Livestock Farm in Linzhi, Xizang

摘要

为了解西藏林芝地区牦牛源大肠杆菌的流行性、耐药性及毒力基因携带情况，本试验采集自西藏林芝某屠宰场牦牛腹泻粪便样品60份，进行分离鉴定纯化、染色镜检、生化试验和PCR鉴定后，确实分离到42株牦牛源大肠杆菌，检出率为70.0%。对检出大肠杆菌通过试剂盒进行血清分型，而后通过K-B纸片扩散法对分离菌株进行药敏试验。结果显示：42株牦牛源大肠杆菌对红霉素和青霉素耐药率最高，分别为64.48%、59.53%；对氧氟沙星、米诺环素、复方新诺明、多粘菌素B耐药率最低，均为4.77%。其中还存在多重耐药菌株，4重耐药菌株占比23.81%，6重耐药菌株占比14.29%。采用PCR技术对分离菌株进行耐药基因与毒力基因检测，结果可得：12种耐药基因中，耐药基因tetM未检出，其余11种耐药基因均检出，其中ermB检出率最高为100%，可见该地区大肠杆菌耐药情况较严重；16种毒力基因中，发现42株大肠杆菌均携带CS31A、Sta、K99、K88、PhoA毒力基因且多重毒力因子的检出率较高。

Abstract

In order to understand the prevalence, drug resistance and virulence gene carrying of Escherichia coli from yaks in Linzhi, Xizang, 60 fecal samples of yaks with diarrhea were collected from a slaughterhouse Linzhi, Xizang. After isolation, identification and purification, staining mi croscopy, biochemical test and PCR identification, 42 strains of Escherichia coli from yaks were i ndeed isolated, with a detection rate of 70.0%. Serotyping of Escherichia coli was performed usin g a reagent kit, followed by drug susceptibility testing of the isolated strains using the K-B disk di ffusion method. The results showed that 42 strains of yak derived Escherichia coli had the highest resistance rates to erythromycin and penicillin, at 64.48% and 59.53%, respectively; The resistan ce rates to ofloxacin, minocycline, compound sulfamethoxazole, and polymyxin B were the lowes t, all at 4.77%. Among them, there are also multidrug-resistant strains, with 4-fold resistant strains accounting for 23.81% and 6-fold resistant strains accounting for 14.29%. PCR technology was used to detect resistance genes and virulence genes in isolated strains. The results showed that among the 12 resistance genes, the tetM gene was not detected, while the other 11 resistance genes were detected. Among them, ermB had the highest detection rate of 100%, indicating that the resistance situation of Escherichia coli in this area is relatively serious; Among the 16 virulence genes, 42 strains of Escherichia coli were found to carry CS31A, Sta, K99, K88, PhoA virulence genes, and the detection rate of multiple virulence factors was high.

Graphical abstract

关键词

牦牛 / 腹泻 / 大肠杆菌 / 耐药性 / 毒力基因

Key words

Yak / Diarrhea / Escherichia coli / Drug resistance / virulence gene

大肠杆菌（Escherichia coli）作为自然界中常见细菌之一，为条件致病菌，某些特定的菌株能引起严重的犊牛腹泻以及内脏感染，极大影响畜牧业生产。近年来，西藏规模化牦牛养殖业发展迅速，养殖群体不断扩大，牦牛腹泻病比例也呈上升趋势^[1]。经统计发现，感染大肠杆菌为该地区牦牛主要腹泻病因之一，同时抗生素在治疗大肠杆菌病中发挥关键作用，因此兽用抗生素的需求急剧上升。目前发达国家对畜牧业抗生素使用的管理较为严格，但仍存在耐药性问题。发展中国家由于抗生素滥用，耐药性问题更为严重。根据中国报告大厅日前发布的《2023年中国畜禽养殖中抗生素使用情况调研报告》称，中国养殖业是抗生素使用量最大的领域，超过国内抗生素消费总量的一半。2023年国内抗生素总产量为21 WT（重量吨），国内消费量约18 WT（重量吨），其中，用于畜牧及饲料行业的抗生素就高达9.7 WT，约占54%，中国畜牧业抗生素滥用情况已不可忽略^[2,3]。其中西藏养殖场落后的不合理的滥用抗生素治疗牦牛细菌感染类疾病情况尤为突出，导致该地区大肠杆菌出现了较为严重的耐药情况。

通过数据分析与对比文献发现，西藏牦牛源大肠杆菌的耐药性与内地养殖动物相比具有独特性，可能与高原环境和抗生素使用模式有关。目前，国内对西藏牦牛源大肠杆菌耐药性的系统性监测数据较少，研究多局限于小范围样本。本研究旨在对林芝某牧场牦牛源大肠杆菌进行分离鉴定及生化试验，通过药敏试验及耐药基因检测对其进行耐药分析，以及通过毒力基因检测对其进行致病性分析。以此了解该地区大肠杆菌的耐药机制及流行特征，为该地区大肠杆菌病综合防治及畜牧业发展提供重要的参考价值。

1 材料与方法

1.1 样品来源

2023年10月采集自西藏林芝市某养殖场牦牛新鲜腹泻粪便60份，于西藏农牧学院高原动物疫病检测实验室4 ℃保存。

1.2 试剂与仪器

试剂：TSB（胰酪大豆胨液体培养基）、麦康凯培养基、革兰氏染色试剂盒均购自青岛高科技工业园海博生物技术有限公司，MH培养基（水解酪蛋白琼脂）、10种微量生化反应管、16种抗生素药敏片均购自杭州微生物试剂有限公司，EPEC血清型、EIEC血清型、ETEC血清型、EHEC血清型试剂盒购自宁波天润生物有限公司,2 × Taq PCR Mixture购自北京博奥龙免疫技术有限公司，TAE、琼脂糖均购自Bio Sharp公司，核酸染料购自Gentihold公司。

仪器：超净工作台购自北京圣达共创科技有限公司，恒温恒湿培养箱购自上海博讯实业有限公司医疗设备厂，数显游标卡尺购自宁波得力工具有限公司，PCR仪购自Analytik JenQ公司，电泳仪购自北京君意东方电泳设备公司，凝胶成像仪购自美国伯乐公司。

1.3 大肠杆菌的分离鉴定

将牦牛腹泻粪样2 g接种于TSB液体培养基中，37 ℃恒温过夜培养，平板三区划线法将菌液接种于麦康凯培养基中，37 ℃恒温过夜培养。用接种环挑取生长良好的粉红色单菌落，在滴有一滴生理盐水的载玻片上均匀涂布，固定，进行革兰氏染色镜检，观察其形态特征。

1.4 致病性大肠杆菌血清分型

使用血清诊断试剂盒对检出大肠杆菌进行血清分型，主要包括，EPEC血清型、EIEC血清型、ETEC血清型、EHEC血清型试剂盒。

1.5 PCR鉴定

参考文献[4]设计合成16S rRNA通用引物，引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，引物信息详见表1。PCR反应体系（25 μL）：Premix Tap（TaKaRa Taq Version 2.0 plus dye）12.5 μL，10 μmol/L上、下游引物各1 μL，DNA模板2 μL，ddH₂O 8.5 μL。PCR反应条件：95 ℃预变性5 min；95 ℃变性30 s；50 ℃退火30 s；72 ℃延伸1 min，共35个循环；72 ℃延伸10 min。取PCR扩增产物10 μL于1%的琼脂糖凝胶进行电泳检测观察，拍照记录结果。将PCR产物送上海生工成都测序部测序。

1.6 生化试验

将分离菌株置于37 ℃恒温培养箱中过夜培养，接种于微量生化反应管（硫化氢、蔗糖、半乳糖、甘露醇、枸橼酸盐、麦芽糖、棉子糖、山梨醇、果糖、葡萄糖）中37 ℃恒温培养24 h后，观察记录其变化，并根据大肠杆菌生化反应标准进行结果判定。

1.7 药敏试验

根据美国临床试验标准委员会（CLSI）推荐的K-B纸片扩散法对分离菌株进行药物敏感性试验与结果判定标准^[5]。取菌液均匀涂布于90 mm水解酪蛋白琼脂（MH琼脂）平板上，将药敏片贴在琼脂平板表面，37 ℃恒温培养24 h。每种药敏片做三组平行实验，实验结果取其平均值。使用数显游标卡尺测量抑菌圈直径，结果参照CLSI推荐的《抗菌药物敏感性试验执行标准》和制造商的说明书对分离菌的耐药情况进行判定。判定标准详见表2。

1.8 耐药基因与毒力基因PCR检测

1.8.1 耐药基因检测

参考文献[6,7]设计合成大肠杆菌耐药基因引物，引物均由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。PCR反应体系参考1.4，PCR反应条件：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性30 s；退火30 s；72 ℃延伸1 min，共30个循环；72 ℃延伸10 min。引物序列及片段大小详见表3。

1.8.2 毒力基因检测

参考文献[6,8]设计合成大肠杆菌毒力基因引物，引物均由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。PCR反应体系参考1.4，PCR反应条件：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性30 s；退火30 s；72 ℃延伸1 min，共35个循环；72 ℃延伸10 min。引物序列及片段大小详见表4。

2 结果分析

2.1 大肠杆菌分离与鉴定

经分离纯化（见图1）和染色镜检（见图2）后从50份粪样中分离到42株疑似大肠杆菌，经PCR扩增和凝胶电泳后，结果显示42株分离菌株均扩增出约1 500 kb目的条带（见图3），并将PCR产物送至生工生物工程（上海）股份有限公司测序，测序结果与Gen Bank上的序列进行BLAST比对分析，同源性达99%以上，判定疑似菌株为大肠杆菌。

2.2 生化试验结果

42株疑似大肠杆菌经微量生化反应管反应后，得到的结果如表5。发现疑似菌株均能分解乳糖、蔗糖、麦芽糖、半乳糖、果糖、葡萄糖、棉子糖；枸橼酸盐、尿素酶试验均为阴性。与相关文献比较该疑似大肠杆菌菌株生化鉴定结果符合大肠杆菌特征。

2.3 药敏试验结果

对42株大肠杆菌进行药敏试验后，结果显示：42株大肠杆菌对红霉素和青霉素耐药率最高，分别为64.48%、59.53%；对头孢他啶、头孢拉定、头孢唑啉、环丙沙星耐药率次之分别为23.81%、23.81%、19.05、14.28%;对氨苄西林、头孢曲松、多西环素、米诺环素、四环素、氧氟沙星、多粘菌素B、卡那霉素、庆大霉素、复方新诺明耐药率最低分别为7.14%、11.91、7.14%、4.77%、11.91%、4.77%、4.77%、11.91%、9.52%、4.77%（见表6）。其中还存在多重耐药菌株，4重耐药菌株占比23.81%，6重耐药菌株占比14.29%。

2.4 致病性大肠杆菌血清分型结果

经试剂盒检验后，42株大肠杆菌检出率最高的为ETEC血清型，检出38株，占比86%；其次为EHEC，检出2株，占比5%；未检出EPEC血清型及EIEC血清型。

2.5 耐药基因检测结果

42株大肠杆菌分别检出blaSHV、blaTEM、tetA等11种耐药基因，其中ermB、ermA耐药基因检出率最高为100%、35.71%；blaCTX、blaSHV、blaTEM、tetA、Mcr-1耐药基因检出率次之分别为28.57%、26.19%、19.05%、19.05%、19.05%；blaOXA、strA、tetB、aphA耐药基因检出率最低分别为14.28%、11.90%、9.52%、4.80%；未检出tetM耐药基因。各耐药基因检出率与相应的耐药表型相差不大。

2.6 毒力基因检测结果

对42株大肠杆菌进行毒力基因检测，结果见表8。结果显示42株大肠杆菌均携带毒力基因，检出率为100%。CS31A、Sta、K99、K88、PhoA毒力基因检出率最高，均为100%；EAST1、F17、bfpA、F41毒力基因检出率次之分别为95.24%、76.19%、54.76%、28.57%；IT毒力基因检出率最低为9.52%；未检出eaeA毒力基因。42株大肠杆菌同时携带CS31A、Sta、K99、K88、PhoA5种毒力基因；4株大肠杆菌同时携带F17、CS31A、Sta、K99、K88、PhoA6种毒力基因；12株大肠杆菌同时携带CS31A、Sta、K99、K88、PhoA5、F41、F17 7种毒力基因。结果表明感染多重毒力因子菌株检出率较高，林芝地区大肠杆菌优势毒力因子为K99菌毛、K88菌毛和sta半抗原等。与血清型检出结果基本一致。

3 讨论

本试验采集自西藏林芝某屠宰场牦牛腹泻粪便60份，对样品进行分离纯化、染色镜检、生化试验和PCR鉴定，共分离出42株大肠杆菌，分离率为70.0%。苏中华等^[9]从西藏那曲市11份牦牛腹泻粪便中分离到5株大肠杆菌，其分离率为45.5%；王蕾等^[10]从林芝和那曲市565份牦牛腹泻粪便中共分离到488株大肠杆菌，其分离率为86.4%；刘正明等^[11]从内蒙古260份羊腹泻病例中分离到108株大肠杆菌，其分离率为41.5%。由此可见，内蒙古和西藏那曲市大肠杆菌的分离率较低，并且还有大量关于藏猪、藏鸡大肠杆菌分离鉴定的报道^[12,13]，表明大肠杆菌在西藏地区分布广泛、污染较为严重。经致病性大肠杆菌血清分型后发现该地区优势菌株为ETEC血清型，表明该养殖场腹泻主要病因主要为肠产毒素大肠杆菌感染，与江婉琳等^[14]研究结果相差较大，可能与海拔及自然环境有关，具有独特性。

本试验根据CLSI推荐的K-B纸片扩散法对分离菌株进行药敏试验，结果显示：42株牦牛源大肠杆菌对红霉素和青霉素耐药率最高，分别为64.48%、59.53%；对氧氟沙星、米诺环素、复方新诺明、多粘菌素B耐药率最低，均为4.77%。刘玉华等^[15]的江苏省泰州市犊牛大肠杆菌对氨苄西林的耐药率高达100%，与本试验的7.14%相差较大；索朗斯珠等^[16]在2017年林芝牦牛源大肠杆菌对卡那霉素的耐药率为12.5%，与本试验的11.91%基本一致。结果表明，西藏林芝市养殖户应减少对红霉素和青霉素的使用，并且对单一药物的耐药现象较为严重，可考虑采取联合用药、交叉轮换用药等方法。相关耐药基因也是细菌产生耐药性的主要原因，本试验共选取12种耐药基因，其中有11种耐药基因检出阳性，耐药基因tetM未被检出；检出率为高的是ermB，为100%；王巧梅等^[17]在2023年北疆牛乳源大肠杆菌blaTEM、tetB的检出率分别为100%、71.4%，均比本试验结果高出很多。梁圆等^[18]在晋北地区犊牛源大肠杆菌tetB、tetM的检出率分别为8.33%、0%，均与本实验结果相近。综合上述结果，牦牛源大肠杆菌对大环内酯类药物的耐药性最高，应避免使用相应的抗生素进行治疗，可采用四环素类和氨基糖苷类药物联合使用的方法，避免药物滥用。

大肠杆菌的致病性与其携带的毒力基因密切相关，ETEC菌株主要是通过K88、K99、F41菌毛黏附于宿主肠道上皮细胞，而后产生肠毒素破坏宿主肠道正常消化功能，造成肠腔积液从而引起犊牛腹泻^[19]。本试验分离得到的42株大肠杆菌中，CS31A、Sta、K99、K88、PhoA毒力因子检出率均达到100%，与张震等^[20]的黑龙江省部分牛场牛源大肠杆菌的检出率（39.13%、6.52%、16.52%、13.04%）相差较大；F41毒力基因检出率28.57%，与张玥等^[21]的河北省部分地区腹泻犊牛源大肠杆菌的检出率（0%）相差较大，并且同时携带7种毒力基因的大肠杆菌占比28.57%，其中毒力因子K88\K99\CS31A常在同一菌株中检出。结果显示西藏林芝地区牦牛源大肠杆菌致病性较强，一年四季均会导致牦牛发病，发病时呈地方流行性，是牛肠毒血症病原之一，对畜牧业生产危害日益显著。本研究对牦牛腹泻粪样进行大肠杆菌分离鉴定与毒力基因检测，为西藏地区牦牛大肠杆菌防控与疾病治疗提供数据支撑和相关参考。

4 结论

本研究对林芝市某养殖场采集的60份腹泻牦牛粪样中分离的42株大肠杆菌进行分离鉴定、致病性血清分型、药敏试验、耐药基因与毒力基因检测，结果显示该地区ETEC血清型检出率高达86%，对青霉素头孢他啶、头孢拉定、头孢唑啉、环丙沙星、红霉素等药物均存在不同程度的耐药性，同时全部携带ermB耐药基因，耐药情况严重；42株大肠杆菌均为感染多重毒力因子菌株，优势毒力因子为K88菌毛、K99菌毛，说明该地区牦牛源大肠杆菌毒力因子携带较多，致病性较强，与血清型检出结果基本一致。

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基金资助

国家肉牛牦牛产业技术体系(CARS-37)

大学生创新实践技能提升训练计划项目(S202410693048)