马铃薯干腐病拮抗细菌的筛选与鉴定及其促生特性测定

Screening and Identification of Antagonistic Bacteria of Potato Dry Rot and Determination of Their Growth Promoting Characteristics

摘要

本研究旨在筛选出防治马铃薯干腐病的优良拮抗细菌。试验选用健康的马铃薯茎块分离内生细菌作为拮抗菌源，采用平板对峙法筛选出抑菌率较高的拮抗细菌，进行室内防治试验确定该菌防治效果，依据形态学、生理生化特性和分子生物学特征，对该菌进行分类，并测定其抑菌谱和促生特性。试验结果表明：通过平板对峙法筛选出了1株对马铃薯干腐病菌抑制率达52.23%的拮抗细菌MH1；经鉴定该菌为枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis；室内防治试验显示，经MH1处理的马铃薯茎块与对照相比未观察到病斑扩展，相对防效为83±3.43%；抑菌谱试验结果显示，对测定的7株病原菌均表现出抑菌活性，抑菌率介于41.18%至75.58%之间，表明该菌株抑菌谱广；促生试验显示该菌具有固氮、解钙、产铁载体和IAA的能力。试验结果显示该菌具有开发为马铃薯干腐病生防菌剂的潜力。

Abstract

This study aimed to screen antagonistic bacteria with potential for controlling potato dry rot. Endophytic bacteria were isolated from healthy potato tubers and screened via dual-culture plate assays for antagonistic activity against the pathogen.A strain designated MH1, which exhibited an inhibition rate of 52.23% against Fusarium spp., was selected for further study. Based on morphological, physiological, biochemical, and molecular characteristics, MH1 was identified as Bacillus subtilis. In vivo assays demonstrated that MH1 treatment effectively suppressed lesion expansion on potato tubers compared to the control. Moreover, MH1 displayed broad-spectrum antagonistic activity against seven tested plant pathogens, with inhibition rates ranging from 41.18%to 75.58%. Additionally, MH1 showed plant growth-promoting traits, including nitrogen fixation, calcium solubilization, siderophore production, and indole-3-acetic acid(IAA)biosynthesis.These results indicate that Bacillus subtilis MH1 has strong potential for development as a biocontrol agent against potato dry rot.

Graphical abstract

关键词

马铃薯干腐病 / 拮抗菌筛选 / 抑菌谱 / 促生特性

Key words

Potato dry rot / Screening of antagonistic bacteria / Inhibitory spectrum / Plant growth promoting characteristics

马铃薯（Solanum tuberosum）作为全球第四大粮食作物，其块茎不仅蛋白质、糖类与维生素等营养元素含量丰富，可食用比例高达全株的85%，能够满足人体多方面营养需求，同时还在工业、农业和饲料加工等领域具有广泛的应用价值^[1]。根据联合国粮食及农业组织最新统计，2024年全球共160个国家进行种植，总种植面积达2 000万hm²，我国种植面积稳定在600万hm²左右，全球总产量3.74亿t，我国总产量近9 000万t，产量多年稳居世界第一。马铃薯干腐病由致病镰孢菌（Fusarium sp.）侵染引起，对马铃薯的种植和贮藏带来严重危害，受害马铃薯不仅品质差且产量降低，还有部分镰孢菌会产生萎蔫酸、串株菌素、玉米赤霉烯酮、伏马菌素和恩镰孢菌素等毒素和次生代谢产物，使其失去食用价值^[2]。目前主要的防治方式为化学防治，噻菌灵是唯一允许在鲜食马铃薯上使用的杀菌剂，长期使用噻菌灵已经导致马铃薯干腐病不同致病菌产生了抗药性，且化学药剂的施用对环境不利、影响人畜安全^[3-5]。采用生物防治是极具前景的绿色防控方法之一，近年来利用芽孢杆菌、木霉菌和链霉菌等防治植物病害的研究越来越多。芽孢杆菌来源广泛、种类多、营养需求简单、理化性质稳定且繁殖迅速，因此被广泛应用于植物病害的防治当中^[6]。蒙耀等^[7]利用响应面优化的方法优化了暹罗芽孢杆菌（Bacillus siamensis）的发酵条件，优化后的暹罗芽孢杆菌发酵上清液抑制马铃薯干腐病病原菌抑制率达到65.20%。刘治会等^[8]采用1:1:1复配解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）、死谷芽孢杆菌（Bacillus vallismortis）和甲基营养型芽孢杆菌（Bacillus methylotrophicus）对马铃薯干腐病进行防效试验，防治率高达79.75%。贾鹏莉等^[9]提取贝莱斯芽孢杆菌（Bacillus velezensis）发酵液的正丁醇提取物对马铃薯干腐病抑制率达到80.07%。沈硕^[10]研究了特氏盐芽孢杆菌（Halobacillus trueperi）有机溶剂萃取物对马铃薯干腐病的抑菌效果，其对马铃薯干腐病的抑菌率达66.00%。因此，研究芽孢杆菌对马铃薯干腐病的防治有着重要的意义。本研究拟对实验室分离自健康马铃薯块茎且对马铃薯干腐病病原菌有拮抗效果的一株内生菌进行鉴定，并测定其抑菌谱和促生特性，以期为马铃薯干腐病的生物防治提供菌物资源。

1 材料与方法

1.1 材料

菌株来源：供试靶标病原菌为马铃薯干腐病病原菌（Fusarium solani）和抑菌谱测定菌株，由西藏农牧大学真菌实验室提供。拮抗菌分离自健康马铃薯茎块内生菌。

供试培养基：马铃薯琼脂固体培养基（Potato Dextrose Agar）、牛肉膏蛋白胨固体培养基（Nutrient Agar）、有机磷固体培养基、无机磷固体培养基、阿须贝无氮培养基^[11]、亚历山德罗夫培养基^[12]、酵母甘露醇琼脂（Yeast Mannitol Agar）解钙培养基和酵母甘露醇琼脂解镁培养基^[13]。

1.2 方法

1.2.1 内生菌分离、纯化及保存

将健康的马铃薯块茎洗净后，切成约2 cm宽的薄片，依次使用75%乙醇消毒30 s、1%次氯酸钠处理5 min，然后用无菌水涮洗3次。取出后置于灭菌滤纸上吸干表面水分，放入研钵中并加入1 mL无菌水进行研磨。取研磨液稀释至10⁻¹、10⁻²、10⁻³，各取200 μL涂布于培养皿中，再倒入约50 ℃的NA培养基进行混菌培养，取第3次涮洗的无菌水200 μL涂布于培养皿中作为对照。于25 ℃条件下暗培养2 d，待菌落长出后进行计数，并挑取形态差异明显的单菌落进行划线纯化。将纯化所得细菌在NA培养基上划线培养后保存^[14]。

1.2.2 拮抗菌筛选

将纯化得到的内生菌菌株采用平板对峙法以病原菌为目标菌株进行初筛，以PDA为基础培养基，平板中央接入5 mm病原菌菌饼，在4周2 cm处划线接种纯化后的植物内生菌，25 ℃培养5 d筛选出有抑菌带的拮抗菌，以相同方法进行复筛，以清水接种为对照，每个处理重复3次，相同条件培养5 d记录病原菌直径计算抑菌效果，筛选出抑菌率最高拮抗菌^[15]。计算公式为：

平均抑制率（%）=（对照菌落平均面积–处理菌落平均面积）/对照菌落平均面积 × 100%（1）

1.2.3 拮抗菌离体防效实验

取健康马铃薯茎块按1.2.1消毒并切成直径3 cm左右的圆块，浸泡在拮抗菌发酵液中30 min，以无菌水浸泡作为对照，并接种5 mm病原菌菌块在圆块中央。25 ℃黑暗保湿培养7 d，重复3次，观察马铃薯受害状况以确定防效^[16,17]。计算公式为：

防效（%）=（对照组病斑面积–实验组病斑面积）/对照组病斑面积×100%(2)

1.2.4 拮抗菌鉴定

形态学鉴定：观察复筛得到的拮抗菌菌落形态并进行革兰氏染色在油镜下观察记录其单细胞形态和颜色。

生理生化特性测定：参照《常见细菌系统鉴定手册》^[18]提供的方法，对筛选所得拮抗细菌进行多项生理生化指标鉴定，具体包括淀粉水解、甲基红（Methyl Red）试验、硫化氢产生能力、柠檬酸盐利用、V-P试验及色氨酸脱氨酶活性等，以初步判定拮抗菌的分类归属。

分子生物学鉴定：采用美基磁珠法基因组提取试剂盒对样本进行核酸提取。将提取所得的细菌DNA作为模板，采用16 S通用引物27 F（5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'）、1492 R（5'-TACGG YTACCTTGTTACGACTT-3'）进行PCR扩增，PCR反应体系配制：先向灭菌管中加入超纯水12 µL，再加入2 × Taq PCR Master Mix15 µL，加入基因组DNA（20 ng）1.0 µL后加入27 F、1492 R各2 µL。PCR反应体系及条件：95 ℃预变性5 min；95 ℃变性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，30个循环；72 ℃终延伸5 min^[19,20]。对得到的PCR扩增液进行琼脂糖凝胶电泳，检查是否扩增成功。将电泳条带符合理论目的大小的良好PCR产物送Sanger测序，测序平台为ABI公司的3730 xL DNA Analyzer测序仪。将所得的序列结果用BLAST程序在NCBI GenBank数据库中进行同源性分析，并在Mega11.0软件中进行多序列比对，构建系统发育树。

1.2.5 抑菌谱测定

抑菌谱测定菌株由西藏农牧大学真菌实验室提供，分别为玉米大斑病Setosphaeria turcica、烟草赤星病Alternaria alternata、小麦赤霉病Fusarium graminearum、小麦根腐病Bipolaris sorkiniana、辣椒枯萎病Fusarium oxysporum、青稞网斑病Pyrenophora teres和桃儿七褐斑病Xylaria brevipes，采用平板对峙法进行测定，暗培养5 d，十字交叉法测定病原菌直径，计算抑菌率，分析拮抗菌抑菌谱^[21]。

1.2.6 拮抗菌促生特性测定

（1）溶磷与解矿物能力

采用透明圈法测定溶磷、解钾、解钙和解镁特性。挑取拮抗菌分别接种至有机磷固体培养基、无机磷固体培养基、亚历山德罗夫培养基、YMA解钙和解镁培养基平板中央，置于培养箱中25℃暗培养7 d后，直接观察菌落周围，若出现透明圈即可判定该菌株具有相应特性。

（2）固氮能力

挑取拮抗菌单菌落于阿须贝无氮平板上划线培养5 d，观察培养基表面是否有菌落出现，连续重复试验3次，若3次都出现菌落，表明该菌株具有固氮活性。

（3）产IAA与产铁载体能力

挑取单一拮抗菌落，接种于100 mL NA液体培养基中，于30℃、160 r/min条件下振荡培养24 h。随后取1 mL上述菌悬液，接入含100 mg/L King氏液体培养基的实验组，并设置等体积无菌水作为空白对照组，于25 ℃、180 r/min条件下振荡培养5 d。取一定量的菌悬液加入等量的PC比色液滴在白瓷板上，观察颜色变化，颜色变粉或变红，说明具有产IAA能力^[22]。以CAS平板检测法测定产铁载体能力^[23]。

2 结果与分析

2.1 拮抗菌的分离与筛选结果

经过分离与初筛，共获得5株对靶标病原菌有拮抗作用的内生细菌，编号为MH1-MH5。通过复筛得到菌株MH1抑菌率较好，抑菌率为（52.23± 0.74）%（见表1）。

2.2 拮抗菌离体防效实验结果

防效实验结果表明，马铃薯茎块接种病原菌菌饼培养7 d后，3组经MH1发酵液浸泡的实验组均未观察到病斑扩展，而无菌水处理的对照组病原菌菌丝侵染整个薯块，薯块表面被粉白色菌丝完全覆盖（见图2），相对防效为（83± 3.43）%。说明MH1对马铃薯干腐病有着良好的离体实验防效。

2.3 拮抗菌MH1的鉴定

形态学鉴定：菌株MH1为革兰氏阳性菌；菌落粗糙，乳白色，边缘呈不规则放射状，有黏性和臭味；在油镜下观察（目镜10 × 物镜100），菌体杆状，大小为(0.7 ~ 0.9 μm) × (1.5 ~ 3.0 μm)，芽孢椭圆状，大小为(0.6 ~ 0.9 μm) × (1.0 ~ 1.4 μm)（见图3）。

生理生化特性测定：结果显示，菌株MH1的甲基红试验、V-P试验、淀粉水解、柠檬酸盐利用、色氨酸脱氨酶及产吲哚试验结果均为阴性，产硫化氢、尿酶、接触酶试验和明胶液化试验测定为阳性（表2）。

分子生物学测定：MH1 PCR产物送武汉天一华煜基因科技有限公司测序，所得序列经NCBI GenBank数据库BLAST进行同源性分析，并在Mega11.0软件中进行多序列比对，构建系统发育树（如图4所示）。结果表明：MH1与登录号OQ942034.1（Bacillus subtilis）在同一分支，相似度达到100%，置信度达到100%，结合生理生化测定结果和形态特征可确定MH1为枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）。

2.4 MH1抑菌谱测定结果

将MH1与7种农业病害病原菌进行平板对峙实验，发现MH1对子囊菌（Setosphaeria）和镰刀菌（Fusarium）均有显著抑制，对小麦根腐病的抑制效果最好，抑菌率达到了75.58%，其余病害抑菌率分别为：玉米大斑病43.82%、烟草赤星病41.87%、小麦赤霉病菌47.47%、桃儿七褐斑病71.52%、辣椒根腐病47.87%、青稞网斑病41.18%（图5）。

2.5 拮抗菌促生特性测定结果

对菌株MH1促生特性进行检测，结果（图6）显示，在阿须贝无氮培养基上有菌落出现，连续培养3次，结果相同，说明该菌具有固氮活性；在有机磷固体培养基、无机磷固体培养基、亚历山德罗夫培养基平板上无透明圈出现，说明该菌无溶磷解钾活性；在以碳酸钙为唯一钙源的培养基表面产生透明圈，而在以碳酸镁为唯一镁源的培养基表面无透明圈产生，说明该菌能溶解碳酸钙，不能溶解碳酸镁；在CAS平板上产生橘黄色光圈，说明该菌具有产生铁载体的能力；在白瓷板上滴加PC比色液30 min后，发酵液微微变红，而对照组无颜色变化，说明该菌具有产生IAA的能力。另推测阿须贝无氮培养基平板表面产生透明圈是因为该菌能溶解碳酸钙，而阿须贝无氮培养基中含有碳酸钙。

3 讨论

枯草芽孢杆菌在自然界中广泛分布，具有易于分离筛选、抑菌谱广和定殖能力强等优点，对马铃薯的疮痂病、早疫病、晚疫病、炭疽病、黄萎病和黑痣病等具有良好的防治效果^[24-28]。但有关枯草芽孢杆菌防治马铃薯干腐病的研究较少。本研究筛选出的拮抗菌枯草芽孢杆菌MH1对马铃薯干腐病病原菌表现出拮抗活性，且离体防效试验结果良好，与已报道的马铃薯干腐病拮抗菌株，如暹罗芽孢杆菌（抑菌率65.20%）、贝莱斯芽孢杆菌（抑菌率80.07%）等相比抑菌率稍低，但其兼具广谱抑菌活性与促生功能，显示出良好的综合应用潜力。该菌株对供试7种病原真菌均有拮抗活性，其中对小麦根腐病的抑菌率达75.58%，显著高于王博申报道的枯草芽孢杆菌M51（抑菌率64.35%），表明MH1在禾谷类作物病害防治中亦具有应用价值^[29]。其抑菌机制可能与其作为枯草芽孢杆菌所产生的脂肽类抗生素、抗菌蛋白和细菌素等活性物质有关，具体代谢产物类型尚待进一步解析^[30]。

除广谱抑菌性外，MH1还具有固氮、解钙、产铁载体和分泌IAA等促生特性，这些功能可能通过增强宿主营养吸收与抗性间接提升其对病害的整体防控效果。杨玲^[31]研究发现枯草芽孢杆菌YB-04有70个与促生物质合成相关的基因，这些基因与铁载体、生长素和表面活性素等生防相关代谢产物的合成有关，盆栽试验中能于48 h内大量定植于黄瓜幼苗根部，对尖孢镰刀菌的相对防效试验显著高于化学试剂对照组。黄勋等从土壤中分离的贝莱斯芽孢杆菌JYC1217具备类似促生特性，并表现出防病潜力。MH1从马铃薯块茎内分离获得，其内生定殖能力可能有助于提升植株体内的微生态稳定性及田间防效。

本研究菌株MH1同时具备抑菌与促生潜能，尤其其内生来源与多功能特性为开发马铃薯干腐病生防制剂提供了新的菌种资源与理论依据。后续需通过大田试验进一步验证其促生防病效果及应用稳定性。

4 结论

本研究从马铃薯茎块中分离得到一株内生枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）MH1，其对马铃薯干腐病原菌的抑菌率为（52.23 ± 0.74）%，离体防治试验中相对防效达（83 ± 3.43）%，能够显著抑制病原菌对马铃薯切块的侵染。此外，该菌株还具有固氮、解钙、产铁载体和分泌IAA等多种益生功能，并表现出广谱抑菌活性和促进植物生长的潜力。上述特性表明枯草芽孢杆菌MH1具备开发为生防菌剂的良好应用前景。

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基金资助

国家自然科学基金“西藏特有荒漠植物砂生槐根际促生菌（PGPR）促生与增强抗旱性机制研究”(31560001)