金东乡辣椒根腐病病原菌鉴定及其生物学特性研究

Identification of Pathogenic Bacteria of Pepper Root Rot in Jindong Township and Its Biological Characteristics

摘要

为明确林芝市金东乡“朗县辣椒”根腐病病原菌及其生物学特性，从金东乡采集到辣椒根腐病样品进行病原菌分离，采用伤根灌接法进行致病性检验，结合形态学鉴定及分子学鉴定确定病原菌物种，并测定不同温度、培养基、pH、碳源、氮源、无机盐对病原菌的影响。结果表明，病原菌被鉴定为茄病镰刀菌（Fusarium solani），在茄子培养基上生长速率最快，在辣椒培养基上菌丝最浓密；最适温度为30 ℃，最适pH为7 ~ 8；最适碳源为半乳糖，最适氮源为亚硝酸钠 ；最适无机盐是氯化钠。本研究可为金东乡辣椒根腐病的防治奠定了基础。

Abstract

In order to identify the root rot pathogens of 'Langxian Capsicum' in Jindong Township, Linzhi City, and their biological characteristics, the pathogenic bacteria were isolated from the samples collected from Jindong Township. Samples of capsicum root rot were collected from Jindong Township for isolation of the pathogen, and the pathogenicity test was carried out by wounding and root grafting method, which was combined with morphological and molecular identification to determine the species of the pathogen, and to determine the effects of different temperatures, culture media, pH, carbon sources, nitrogen sources and inorganic salts on the pathogen. The pathogen was identified as Fusarium solani, with the fastest growth rate on aubergine medium and the densest mycelium on capsicum medium; the optimum temperature was 30°C, the optimum pH was 7 ~ 8; the optimum carbon source was galactose, the optimum nitrogen source was NaNO₂; the optimum inorganic salt was NaCl. This study lays the foundation for the control of Capsicum root rot in Jindong Township.

Graphical abstract

关键词

金东乡 / 朗县辣椒 / 辣椒根腐病 / 茄病镰刀菌

Key words

Jindong Township / Lang County Chili Pepper / Pepper root rot / Fusarium solani

辣椒（Capsicum annuum L.）原产于拉丁美洲热带地区^[1]，明朝末年引入中国^[2]。辣椒长期以来作为调味品和蔬菜在国际市场上十分畅销。中国作为全球最大的辣椒生产、消费和出口国，中国辣椒产业的发展对全世界的辣椒产业具有重要的影响^[3]。朗县辣椒也称“小牛角”，是西藏自治区林芝市朗县的辣椒特有品种^[4]，朗县辣椒维生素C含量以及花青素含量均高于市面上一般辣椒品种^[5]。2018年9月5日，中华人民共和国农业农村部批准对“朗县辣椒”实施国家农产品地理标志登记保护^[6]。朗县辣椒农产品地理标志地域保护范围为西藏自治区林芝市朗县全域范围，包括洞嘎镇、朗镇、仲达镇、拉多乡、金东乡、登木乡6个乡镇的雅鲁藏布江沿江两岸区域^[7]。

经过走访调查，发现朗县金东乡辣椒根腐病的发生严重，但其病原尚不明确，发生规律也未见报道。调查发现辣椒根腐病大多数在地势低洼积水量大的区域严重发生，据农民阐述，辣椒根腐病严重发生区域常年种植辣椒，无轮作，且常年发生辣椒枯萎情况，逐年严重。造成辣椒产量严重下滑，对当地经济影响较大。朗县辣椒根腐病症状（如图1）：整株枯萎，发病后期植株颜色整体依然为绿色，叶片内收，维管束纵切面发褐，无菌脓，根部发褐且须根软榻无活力。湿度高的情况下根部周围有白色菌丝且根部表皮易脱落。本研究以金东乡朗县辣椒根腐病植株为材料进行病原菌的分离鉴定，结合分子生物学技术明确其物种，并探究不同培养基、不同pH、不同碳源、不同氮源、不同无机盐对病原菌菌丝生长的影响。为金东乡朗县辣椒根腐病的进一步防治研究奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 培养基

马铃薯葡萄糖培养基（PDA）：马铃薯200 g、葡萄糖20 g、琼脂15 g、蒸馏水1 000 mL（不加琼脂为PDA液体培养基）。

马铃薯琼脂培养基：马铃薯200 g、琼脂15 g、蒸馏水1 000 mL。

葡萄糖培养基：葡萄糖20 g、琼脂15 g、蒸馏水1 000 mL。

水琼脂培养基（WA）：琼脂15 g、蒸馏水1 000 mL。

茄子葡萄糖培养基：茄子200 g、葡萄糖20 g、琼脂15 g、蒸馏水1 000 mL。

辣椒葡萄糖培养基：辣椒根200 g、葡萄糖20 g、琼脂15 g、蒸馏水1 000 mL。

番茄葡萄糖培养基：番茄根200 g、葡萄糖20 g、琼脂15 g、蒸馏水1 000 mL。

察氏液体培养基：硝酸钠3 g，磷酸氢二钾1 g，硫酸镁（硫酸镁·7H₂O）0.5 g，氯化钾0.5 g，硫酸亚铁0.01 g，蔗糖30 g，蒸馏水1 000 mL。

1.1.2 主要仪器

超净实验工作台（SW-CJ-2DF，浙江苏净净化有限公司）、立式压力蒸汽灭菌锅（LT-CPS80C，上海立德泰勀科学仪器有限公司）、电热恒温培养箱（GZP-750S，上海静宏实验设备有限公司）、超微量分光光度计（GENESYS 140，上海赛默飞世尔科技有限公司）等。

1.2 方法

1.2.1 病原菌的分离

采集金东乡（北纬28°88′, 东经93°41′）朗县辣椒根腐病植株18株，将植株根部表面土壤流水冲洗干净，用75%酒精消毒30 s，用2%次氯酸钠溶液浸泡15 min，用无菌水将次氯酸钠冲洗干净。将植株的茎截成约5 mm厚接入含浓度为0.3%链霉素的PDA固体培养基中，出现菌落后，根据形态不同对真菌进行纯化培养^[8]。并利用科赫法则验证分离到的菌株是否为“朗县辣椒”根腐病病原菌。

1.2.2 致病性检验

伤根灌接法：用刀片割断辣椒苗的部分须根后，给每株苗灌入病原菌孢悬液15 mL，以未接种孢悬液的作为对照。然后将各处理置放在大棚温室中，并及时浇水，以保持土壤润湿为宜，观察发病情况。待辣椒发病后对病株进行病原菌分离，并同原先的病原菌进行比较^[9]。

病原菌孢悬液：将直径8 mm病原菌菌饼接入50 mL液体察氏培养基中，培养72 h、4层纱布过滤，滤液即为病原菌孢悬液。

1.2.3 病原菌形态学鉴定

将通过科赫法则验证的病原菌接到PDA培养基培养5 d，观察其产色素情况以及菌落形态。通过小室培养^[10]的方法制作临时玻片于光学显微镜下观察病原菌菌丝、小型分生孢子、大型分生孢子、厚垣孢子等形态。

1.2.4 病原菌分子学鉴定

分子学鉴定：采用磁珠法基因组提取试剂盒对样本进行核酸提取。将提取所得的真菌DNA作为模板，采用ITS 通用引物ITS1（5'-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3'）、ITS4（5'-TCCTCCGCTTATTGATA TGC-3'）进行PCR扩增，PCR反应体系配制：先向灭菌管中加入超纯水12 µL，再加入2×Taq PCR Master Mix 15 µL，加入基因组DNA（20ng）1.0 µL后加入ITS1、ITS4各1 µL。PCR反应体系及条件：95 ℃预变性5 min；95 ℃变性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，35个循环；72 ℃终延伸5 min。对得到的PCR扩增液进行琼脂糖凝胶电泳，检查是否扩增成功。PCR 扩增产物送至武汉天一华煜基因科技有限公司进行测序，将所得的序列结果用BLAST程序在NCBI GenBank数据库中进行同源性分析，并在 Mega7.0 软件中进行多序列比对，构建系统发育树^[11]。

1.2.5 不同温度对病原菌菌丝生长的影响

取直径8 mm病原菌菌饼置于PDA培养基上分别15、20、25、30、35℃培养7 d，每处理3重复，记录菌丝生长状况并利用十字交叉法^[12]测量菌落直径。

1.2.6 不同培养基对病原菌菌丝生长的影响

取直径8 mm病原菌菌饼分别接到水琼脂培养基、葡萄糖培养基、茄子葡萄糖培养基、辣椒葡萄糖培养基、番茄葡萄糖培养基上25 ℃培养7 d，每处理3重复，记录菌丝生长状况并利用十字交叉法测量菌落直径。

1.2.7 不同pH对病原菌菌丝产量的影响

以PDA液体培养基为基础，调节培养基的pH分别为4、5、6、7、8、9、10，培养基装液量为47.5/100 mL三角瓶，接种5%病原菌孢悬液（2.5 mL），25 ℃、100 r/min振荡培养6 d，过滤、收集菌丝，菌丝体于35 ℃烘干12 h至恒重后称重。每处理3重复，计算菌丝体产量（平均每 100 mL 发酵液得到的菌丝体干重）。

1.2.8 不同碳源对病原菌菌丝生长的影响

以马铃薯琼脂培养基为基础，分别添加不同碳源：乳糖、半乳糖、果糖、木糖、阿拉伯糖、壳聚糖（添加量为20 g/L），取直径为8 mm菌饼分别接到不同碳源的培养基上25℃培养6 d，每处理3重复，以马铃薯琼脂培养基为对照（CK1），记录菌丝生长状况并利用十字交叉法测量菌落直径。

1.2.9 不同氮源对病原菌菌丝生长的影响

以PDA培养基为基础，分别添加不同氮源：牛肉膏、蛋白胨、尿素、硝酸钾 、硝酸铵、亚硝酸钠（添加量为3 g/L），取直径为8 mm菌饼分别接到不同氮源的培养基上25 ℃培养7 d，每处理3重复，以PDA培养基为对照（CK2），记录菌丝生长状况并利用十字交叉法测量菌落直径。

1.2.10 不同无机盐对病原菌菌丝生长的影响

以PDA培养基为基础，分别添加不同无机盐：硫酸亚铁、磷酸氢二钾、氯化钠、磷酸二氢钠、硫酸镁、碳酸钙（1 g/L），取直径为8 mm菌饼分别接到不同氮源的培养基上25 ℃培养7 d，每处理3重复，以PDA培养基为对照（CK2），记录菌丝生长状况并利用十字交叉法测量菌落直径。

2 结果与分析

2.1 致病性检验

利用伤根灌接法将真菌接到辣椒苗上，如图2、图3，12 d后处理组辣椒苗出现萎蔫症状，叶片内收、下垂，须根无活力、软塌，符合辣椒根腐病症状，未接种处理的对照组无发病症状。将发病植株根部进行病原菌再分离，成功分离到与JD-7、JD-8、JD-11形态相同的菌株，符合科赫法则。以上结果表明JD-7、JD-8、JD-11均为金东乡“朗县辣椒”根腐病病原菌。

2.2 病原菌形态学鉴定

通过科赫法则检验，得到3株疑似朗县辣椒根腐病病原菌，编号分别为JD-7、JD-8、JD-11。经形态学鉴定，3株病原菌均为同一物种。JD-7 菌株在 PDA 培养基上呈菌丝白色，棉絮状（图4A、图4B）；小型分生孢子散生，有0 ~ 1个隔膜（图4C）；大型分生孢子纺锤形，稍弯曲，一般为2 ~ 4个隔膜（图4D）；厚垣孢子顶生，单生，球形（图4E）。初步确定JD-7、JD-8、JD-11均为镰孢菌属。

2.3 病原菌分子学鉴定

将公司所给序列结果用BLAST程序在NCBI GenBank数据库中进行同源性分析，并在 Mega7.0 软件中进行多序列比对，构建系统发育树（如图5所示）。结果表明JD-7、JD-8、JD-11均与登录号OR478034.1（Fusarium solani）和登录号MT605584.1（Fusarium solani）在同一分支，且置信度达93%，结合形态学鉴定可确定JD-7、JD-8、JD-11均为茄病镰孢菌（Fusarium solani）。

2.4 不同温度对病原菌菌丝生长的影响

图6为菌株JD-7不同温度的长势情况，图7为菌株JD-7不同温度的菌丝生长速率。不同温度之间菌株JD-7的生长速率均有显著性差异（P < 0.05）。30 ℃时菌株生长速率最快，不同菌株JD-7的生长速率呈：30 ℃ > 25 ℃ > 20 ℃ > 35 ℃ > 15 ℃。

2.5 不同培养基对病原菌菌丝生长的影响

图8为菌株JD-7在不同培养基上的长势情况，图9为菌株JD-7在不同培养基上的菌丝生长速率。结合图4、图5可知，菌株JD-7在水琼脂培养基和葡萄糖琼脂培养基上虽然生长速率较快，但其菌丝非常稀疏（图6A、图6B），几乎看不见；菌株JD-7在辣椒葡萄糖琼脂培养基上虽然菌丝生长速率最慢，但其菌丝最浓密（图6C）；菌株JD-7在番茄葡萄糖琼脂培养基上菌丝生长速率较快但菌丝较为稀疏（图6D）；菌株JD-7在茄子葡萄糖上菌丝生长速率最快但菌丝也较为稀疏（图6E）。

2.6 不同pH对病原菌菌丝产量的影响

图10为不同pH菌株JD-7的菌丝产量。菌株JD-7在不同pH条件下均可生长，在pH为7 ~ 8条件下菌丝产量显著高于pH4、pH9、pH10时菌丝产量，菌株JD-7在不同pH下的菌丝产量呈：“pH7”>“pH8”>“pH5”>“pH6”>“pH9”>“pH10”>“pH4”。

2.7 不同碳源对病原菌菌丝生长的影响

图11为菌株JD-7不同碳源的长势情况，图12为菌株JD-7不同碳源的菌丝生长速率。相对于对照CK1，添加半乳糖、果糖、阿拉伯糖可使菌株JD-7的生长速率显著加快（P < 0.05），添加乳糖、木糖可使菌株JD-7的生长速率加快。添加不同碳源菌株JD-7的生长速率呈：半乳糖 > 果糖 > 阿拉伯糖 > 木糖 > 乳糖 > CK1 > 壳聚糖。

2.8 不同氮源对病原菌菌丝生长的影响

图13为菌株JD-7不同氮源的长势情况，图14为菌株JD-7不同氮源的菌丝生长速率。相对于对照CK2，添加牛肉膏、亚硝酸钠可使菌株JD-7的生长速率加快，添加蛋白胨、尿素、硝酸钾、硝酸铵可使菌株JD-7的生长速率显著降低（P < 0.05）。添加不同氮源菌株JD-7的生长速率呈：亚硝酸钠 > 牛肉膏 > CK2 > 硝酸铵 > 硝酸钾 > 尿素 > 蛋白胨。

2.9 不同无机盐对病原菌菌丝生长的影响

图15为菌株JD-7不同氮源的长势情况，图16为菌株JD-7不同氮源的菌丝生长速率。相对于对照CK2，添加磷酸氢二钾、氯化钠、磷酸二氢钠、硫酸镁、碳酸钙可使菌株JD-7生长速率显著加快（P < 0.05），添加硫酸亚铁可显著降低JD-7的生长速率（P < 0.05）。添加不同无机盐菌株JD-7的生长速率呈：氯化钠 > 磷酸二氢钠 > 磷酸氢二钾 > 碳酸钙 > 硫酸镁 > CK2 > 硫酸亚铁。

3 结论与讨论

辣椒根腐病是一种典型的土传病害，根据辣椒品种、土壤类型、生态条件等不同致病菌也不同^[8]，经过试验对金东乡朗县辣椒根腐病病原菌分离、科赫法则验证，并利用形态学鉴定和分子学鉴定结合的方法确定金东乡辣椒根腐病病原菌为茄病镰刀菌（F. solani）。郝蓉蓉等^[13]人对西藏设施辣椒根腐病病原菌进行分离鉴定，研究发现西藏设施辣椒根腐病是由尖镰孢菌（F. oxysporum）引起的。另外，茄病镰刀菌（F. solani）是目前发现主要引起辣椒根腐病的一类病原菌，蔡高磊等^[14]报道了十堰辣椒根腐病是茄病镰刀菌（F. solani）引起的，黄建都等^[15]报道福州地区辣椒根腐病也是茄病镰刀菌（F. solani）引起的。连芸芸等^[16]人研究发现，庆阳市的辣椒根腐病是尖镰孢菌（F. oxysporum）和茄病镰刀菌（F. solani）两种致病菌引起的。除此之外，茄病镰孢菌（F. oxysporum）不光能引起辣椒根腐病，还能引起石斛根腐病^[17]、牡丹根腐病^[18]、马铃薯干腐病^[19]、马铃薯根腐病^[20]、北苍术根腐病^[21]、百合根腐病^[22]、黄瓜根腐病^[23]、白鲜根腐病^[24]、番茄根腐病^[25]等病害，严重影响作物产量。

生物学特性的研究是病原菌的基础研究，可为抗病育种和生物防治提供理论依据^[26]。菌株JD-7在15 ℃ ~ 35 ℃条件下菌丝均能生长，在30 ℃下菌丝生长速率最快，这与杨静美^[27]等对番木瓜茄病镰孢菌（F. oxysporum）的研究结果一致。菌株JD-7在辣椒葡萄糖琼脂培养基上菌丝相比于其他培养基较为浓密，表明其相对于茄子和番茄根，辣椒根更适合作为JD-7的营养载体，但是否侵染茄子和番茄还需进行下一步的盆栽试验验证。探究pH对菌株JD-7的影响，发现JD-7在pH4~10时菌丝均能生长，但在pH7 ~ 8时菌丝产量明显高于其他pH条件，这与田凤鸣^[28]等对陇南花椒茄病镰孢菌（F. oxysporum）的研究结果不一致，这可能根据茄病镰孢菌（F. oxysporum）的寄主生活习性以及发现地区气候条件不同而不同。与对照相比，半乳糖、果糖、阿拉伯糖、木糖、乳糖为氮源对菌株JD-7的生长均有促进作用，半乳糖为菌株JD-7的最适碳源。研究发现添加大多数氮源都会抑制JD-7的生长，这与连芸芸^[16]的报道刚好相反，亚硝酸钠为菌株JD-7的最适氮源。氯化钠为菌株JD-7的最适无机盐。菌株JD-7的菌丝致死温度为57 ℃、10 min。即朗县辣椒根腐病病原菌是一种能够以各种碳源、无机盐以及某些氮源为营养来源、喜中性偏碱性环境、适宜在春夏秋季节生长的病原真菌。因此，在生产中特别是易发病的夏季要注意该病的防控， 种植时可以适当提高土壤酸性，以减少辣椒根腐病病害的发生，提高金东乡朗县辣椒的产量。

参考文献

[1] Gezahign F, Mulugeta K, Baye S, et al. Biocontrol effects of endophytic and rhizospheric bacteria against the root pathogen Fusarium oxysporum of hot pepper (Capsicum annum L.)[J]. Vegetable Science, 2022, 49(1): 75-85.

[2] 李晴,韩玉珠,张广臣.国内外辣椒产业现状与发展趋势[J].湖北农业科学,2009,48(09):2278-2281.

[3] 王永平,何嘉,张绍刚,等.我国辣椒国内外市场需求现状及变化趋势[J].北方园艺,2010,01:213-216.

[4] 徐平.朗县辣椒种植现状及发展对策[J].西藏科技,2002,05:10-12+17.

[5] 赵艳宁,蒋兵涛.西藏朗县辣椒在不同生态区种植的品质性状分析[J].农业与技术,2021,41(21):25-28.

[6] 王忠红,王元林,关志华,等.西藏朗县地方辣椒品种的产业化发展思考[J].高原农业, 2018,2(06):629-635.

[7] 赵艳宁,高彪,王陆州,等.蛋白质组解析西藏本土辣椒辣度差异的分子机制[J].分子植物育种,1-16.

[8] H.T. K N, G. A R. Assessment the Efficiency of the Bioagent and the Biohealth Formula with Fungicide Beltanol in Control of Causing Pepper Root Rot[J]. IOP Conference Series: Earth and Environmental Science, 2023, 1262(3):

[9] 陈晓旭,郑亚娟,王作英,等.丹东草莓根腐病病原菌鉴定及生物学特性研究[J].辽宁农业科学,2023,06:75-78.

[10] 方晓翠.新疆加工辣椒根腐病病原鉴定及其防治药剂筛选[D].石河子:石河子大学,2016.

[11] 申李旖琦,聂丽妍,杜娟,等.一株青稞根际溶磷真菌的鉴定及其促生特性研究[J].高原农业,2024,8(01):46-56.

[12] 韩振,何建清,葛彦宏,等.一株野生白黄卷毛菇FAHZ03的分离鉴定及其生物学特性研究[J].高原农业,2023,7(05):499-505.

[13] 郝蓉蓉,郭海东,杨成德,等.西藏设施辣椒根腐病病原的分离及鉴定[J].西北农业学报,2015,24(12):139-143.

[14] 蔡高磊,赵昌松,彭宣和,等.十堰辣椒根腐病病原菌分离鉴定及高氏15号的生物防治作用研究[J].华中师范大学学报(自然科学版),2019,53(02):248-254.

[15] 黄建都,陈群航,陈仁,等.福州地区设施栽培辣椒根腐病病原菌鉴定[J].福建农业学报,2017,32(02):201-205.

[16] 连芸芸,李焕宇,李惠霞,等.甘肃省庆阳市辣椒镰孢菌根腐病病原鉴定及生物学特性[J].甘肃农业大学学报,2021,56(05):55-61+68.

[17] 王芳,张硕,杜琳,等.西藏蜂胶抑菌活性及对金钗石斛茄病镰刀菌抑菌机理探究[J].安徽农业大学学报,2023,50(05):847-854.

[18] 毛咪,吕长平,帅佳琪,等.湖南牡丹根腐病病原菌的分离鉴定及其拮抗菌的筛选[J].经济林研究,2023,41(02):290-298.

[19] 朱艳,朱福鹏,陈富,等.甘肃窖藏马铃薯干腐病病原菌分离鉴定及致病性分析[J].食品安全质量检测学报,2023,14(09):240-248.

[20] 姚凡,王喜刚,郭成瑾,等.绳状青霉P-19不同固体发酵浸提液对马铃薯镰刀菌根腐病病原菌的抑制作用[J].植物保护,2022,48(06):368-373.

[21] 罗守杨.北苍术根腐病生防菌筛选,优化及其防病促生作用研究[D].长春:吉林农业大学,2023.

[22] 刘彤珂,宋水林,熊桂红,等.百合根腐病病原分离与鉴定[J].生物灾害科学,2023,46(01):1-7.

[23] 杨东亚,祁瑞雪,李昭轩,等.黄瓜茄病镰刀菌拮抗芽孢杆菌的筛选,鉴定及促生效果[J].生物技术通报,2023,39(02):211-220.

[24] 沈宝宇,孙文松,张天静,等.白鲜根腐病病原菌分离与鉴定[J].分子植物育种,2024,22(07):2265-2270.

[25] Zene A S.番茄根腐病生防菌的筛选及防治效果研究[D].兰州:兰州交通大学,2021.

[26] Shao D, Xu Y, Zhang C, et al. Identification and Biological Characteristics ofMortierella alpinaAssociated with Chinese Flowering Cherry ( Cerasus serrulata ) Leaf Blight in China[J]. Journal of Fungi, 2024, 10(1): 50.

[27] 杨静美,陈健,罗金棠,等.番木瓜茄病镰刀菌的生物学特性研究[J].中国热带农业,2011,01:56-58.

[28] 田凤鸣,陈强,王瀚,等.陇南花椒根腐病病原菌的分离鉴定及生物学特性的研究[J].东北农业科学,2022,47(01):95-99+107.

基金资助

西藏自治区重点科技项目(XZ202001ZY0019N)

西藏农牧学院研究生创新计划项目(YJS2023-42)