裂褶菌抗枯草芽孢杆菌潜在机制研究

Studies on the Potential Mechanism of Resistance to Bacillussubtilis by Schizophyllum commune Fr.

摘要

基于生物信息学分析裂褶菌活性成分抗枯草芽孢杆菌的潜在作用机制。利用PubMed、中国知网等数据库查阅并筛选出裂褶菌的主要活性成分，利用分子对接技术、KEGG 通路、GO功能分析等方法探究裂褶菌活性成分抗枯草芽孢杆菌的潜在作用机制。结果表明，裂褶菌抗枯草芽孢杆菌的主要活性成分为Schizophyllan、Schizines B、Schizines A，主要通过DNA模板转录调控、细菌孢子形成激活调控、DNA-蛋白质复合物、转录顺式调控区结合、相同的蛋白质结合、DNA 结合及DNA结合转录抑制因子活性和GO功能活性以及组氨酸激酶与其下游的反应调节子共同组成典型的双组分调节系统发挥抗枯草芽孢杆菌的作用。研究表明，裂褶菌可能通过多条通路、多种代谢途径调控多种逆境响应相关的基因表达，影响着细菌的孢子形成过程及细菌的总体代谢、细胞增殖及分裂等达到抗枯草芽孢杆菌的效果。

Abstract

To analyze the potential mechanism of action of the active components of Schizophyllum commune Fr. against Bacillus subtilis based on bioinformatics. The main active components of Schizophyllum commune Fr. were identified and screened by PubMed and China Knowledge Network, and the potential mechanism of action of the active components against Bacillus subtilis was investigated by molecular docking technology, KEGG pathway and GO function analysis. The results showed that the main active components of P. schizophylla against B. subtilis were Schizophyllum commune Fr, Schiz B and Schizines A, which had an anti- Bacillus subtilis effect through a typical two-component regulatory system consisting of DNA template transcriptional regulation, bacterial sp formation activation regulation, DNA-protein complex, transcriptional cis-regulatory element binding, the same protein binding, DNA binding and DNA binding transcriptional inhibitory factor activity function activity and histidine kinase and its downstream response regulator. To sum up, Schizophyllum commune Fr. may regulate the expression of a variety of genes related to multiple responses through multiple pathways and various metabolic pathways, affecting the process of bacterial spore formation and the overall metabolism, cell proliferation, and division of bacteria to achieve the effect of anti-Bacillus subtilis.

Graphical abstract

关键词

药用菌 / 药用菌活性成分 / 枯草芽孢杆菌 / 生物信息学 / 分子对接技术

Key words

Medicinal mushrooms / Medicinal mushroom active ingredients / Bacillus subtilis / Bioinformatics / Molecular docking technology

枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis），革兰氏阳性菌，内生抗逆孢子的杆状细菌，是芽孢杆菌属的益生菌。枯草芽孢杆菌生命力顽强，能存活于各种环境中，对人及畜禽无害^[1]。因此枯草芽孢杆菌作为一种绿色饲料添加剂已被广泛应用于畜禽业生产中^[2]。此外在禽畜养殖中适当予以补充枯草芽孢杆菌对禽畜生长有一定益处，枯草芽孢杆菌在进入禽畜消化道中可迅速大量繁殖消耗其肠道内大量氧气进而造成肠道低氧环境，促进有益厌氧菌生长及间接抑制其他致病菌生长，在代谢过程中产生有机酸，降低畜禽肠道局部 pH 值，达到抑制禽畜肠道中有害菌的繁殖，进而促进禽畜肠道菌群平衡^[3]。但在畜牧业中过量使用枯草芽孢杆菌会造成畜禽肠道有益菌群单一进而造成畜禽抵抗力下降并发生消化系统疾病，更有甚者导致禽畜大面积死亡从而造成不可估量的损失。此外枯草芽孢杆菌在不利或恶劣条件下即生成抗逆性孢子，其能耐受加工、生产、运输、贮藏等过程中不利于枯草芽孢杆菌生存的条件。同时枯草芽孢杆菌又是一种在厌氧条件下还能繁殖的需氧菌之一，枯草芽孢杆菌可通过利用糖类、淀粉及蛋白质分解色氨酸形成吲哚从而液化明胶、还原硝酸盐及水解淀粉。但这些作用会致使生鲜牛乳出现凝块，口感上出现苦味、酸味，甚至可以闻到腐败气味等生鲜牛乳变质现象，严重影响着乳制品的品质和风味^[4-6]。当前有效且绿色方式杀灭枯草芽孢杆菌的方式鲜有，因此寻求一种高效且绿色的杀灭枯草芽孢杆菌的药物迫在眉睫。

裂褶菌（Schizophyllum commune Fr.）又称云南白参、树花、白花、八担柴等，隶属于裂褶菌科，裂褶菌属（Schizophyllum）裂褶菌，形态呈散生或群生，白色或灰白色，质韧，呈多瓣裂状，菌褶窄是食药两用菌，是一种肉质鲜美的蘑菇，深受大众喜爱，同时具有丰富的营养价值和药用功效^[7]。近年来研究发现裂褶菌具有提高机体免疫力、抗菌、抗肿瘤、抗氧化性、益生元^[8]等益处，深受食品业、医药行业、畜牧业及生物化工行业的青睐，然而裂褶菌抗枯草芽孢杆菌研究仍处于空白阶段，本研究致力于裂褶菌抗枯草芽孢杆菌的潜在机制研究，为进一步研究裂褶菌抗枯草芽孢杆菌活性及开发有机抗菌农药提供一定理论依据。

1 试验方法

1.1 裂褶菌的活性成分获取

利用PubMed、中国知网等数据库，输入“Schizophyllum commune Fr.”或“裂褶菌”进行检索其主要的活性成分，后通过活性成分的CAS号下载其化学结构式，通过StoneMIND Collector 软件进行结构识别并对活性成分进行修饰和下载其sdf格式。

1.2 枯草芽孢杆菌的核心靶点基因及相应蛋白结构获取

利用NCBI数据库中的Gene数据库，以“Bacillus subtilis”为检索名称，通过与其相关性强弱筛选出相关性较高的靶点基因导入String数据库，下载其tsv格式数据文件后导入Cytoscape 3.6.1软件进行PPI拓扑图构建。根据degree值大小筛选出Bacillus subtilis的更具影响力的基因即Bacillus subtilis的核心靶点基因。通过PDB数据库检索并下载Bacillus subtilis的核心靶点基因相对应的蛋白3D结构，根据分子对接蛋白结构选择之六大原则^[9]进行筛选，最终获取可靠性最高的蛋白结构并下载其PDB Format格式。

1.3 分子对接预测结合活性分析

利用 Discovery Studio Client 2019软件，选择View、Graphics，在Small Molecules中选择prepare Ligands进行药物活性分子对接前的准备。将检索出的裂褶菌的主要活性成分和枯草芽孢杆菌的核心靶点基因进行分子对接预测其结合活性。

1.4 生物通路富集分析

利用DAVID数据库（https://david.ncifcrf.gov)，将裂褶菌主要活性成分与枯草芽孢杆菌核心靶点基因结合度较高的靶点基因蛋白导入，设置物种为“Bacillus subtilis”、Identifier选择为“OFFFICIAL-GENE-SYMBOL”分析条件后，进行GO功能和KEGG通路富集分析，设定标准为P < 0.05，并对结果构建桑基图进行可视化的富集分析。

2 结果

2.1 裂褶菌活性成分获取结果

裂褶菌的活性成分研究相关文献较少，相关研究学者通过LC-MS分析、柱层析等得出裂褶菌主要含有6种活性成分^[10,11]，其分别是Schizophyllan、2-甲氧基间苯二酚、N-乙酰基色胺、Schizines B、Schizines A、2-Butenedioic acid。

2.2 枯草芽孢杆菌的核心靶点基因及相应蛋白结构获取结果

利用NCBI数据库中的Gene数据库，以“Bacillus subtilis”为检索名称共计获取5 110个基因，通过与其相关性强弱筛选出相关度较高的靶点基因并导入String数据库，下载其tsv格式数据文件后导入Cytoscape 3.6.1软件进行PPI拓扑图构建，degree值越高靶点越高，颜色越红，见图1。根据分子对接蛋白结构六大原则，共计获取10个核心靶点基因相应的蛋白结构，其相应核心靶点基因分别为 ccpA、ftsZ、spo0A、codY、dnaA、comK、abrB、parB、sigB、walR（由于pksN、amyE两个靶点蛋白结构不符合分子对接蛋白结构六大原则故未纳入此次研究）。

2.3 分子对接预测结合活性结果

将活性分子3D分子结构式，并通过 StoneMIND Collector软件进行结构识别和修饰，利用 Discovery Studio Client2019 对裂褶菌主要活性成分和蛋白进行修饰后完成对接。根据分子对接结果评分，对接效果越好即评分越高图示颜色越红，见图2。从分子对接预测裂褶菌主要活性成分与枯草芽孢杆菌核心靶点结合活性上看，裂褶菌中Schizophyllan的结合活性较高，其次是Schizines B、Schizines A两种活性成分。Schizophyllan与ccpA、ftsZ、parB、walR靶点基因结合度高，其中与ccpA靶点分子对接结果表明，Schizophyllan与ccpA靶标的ASP位点221、249、276处以及THR位点248处、LYS位点197处形成常规氢键，在THR位点223处形成碳氢键，见图3。Schizophyllan与ftsZ靶标的ARG位点191处、ASN位点299处形成常规氢键，在ASN位点301处、ASP位点199处、GLY位点196处形成碳氢键，见图4。Schizophyllan与parB靶标的ASP位点117处、LEU位点118处、ALA位点170处及GLU位点116 122处形成常规氢键，在LEU位点113处、ARG位点115处、HIS位点41处以及SER位点119处形成碳氢键，见图5。Schizophyllan与walR靶标的ASP位点194、ASN位点223处、LEU位点193 处、TYR位点226处等形成常规氢键，见图6。

2.4 生物通路富集分析结果

裂褶菌主要活性成分作用于枯草芽孢杆菌核心靶点基因蛋白导入DAVID数据库进行GO功能和KEGG通路分析，设定标准为P < 0.05，共计获取GO:0045892~negative regulation of DNA-templated transcription（对DNA模板转录的负调控的生物过程）、GO:0006355-regulation of DNA-templated transcription（对DNA模板转录的调控的生物过程）、GO:0045881-positive regulation of sporulation resulting in formation of a cellular spore（对形成细胞孢子的孢子形成的正调控的生物过程）、GO:0045893-positive regulation of DNA-templated transcription（蛋白质-DNA复合物的生物过程）、GO:0032993-protein-DNA complex（转录顺式调控区域结合的生物过程）、GO:0000976-transcription cis-regulatory region binding、GO:0042802-identical protein binding（相同蛋白质的结合的生物过程）、GO:0003677-DNA binding（DNA结合的生物过程）、GO:0001217-DNA-binding transcription repressor activity（DNA结合转录抑制因子活性的生物过程）共计9条GO功能条目并进行可视化分析，见图7。及1条KEGG通路即为bsu02020：Two-component system（双组分调节系统代谢通路）。

3 讨论

近年来有报道表明，一方面，一些养殖户为追求更高的经济效益过量使用枯草芽孢杆菌添加剂，在畜禽业生产加工中产生诸多负面影响。禽畜过量摄入枯草芽孢杆菌后，抑制畜禽消化道内其他有益菌生长，进而引发畜禽腹泻、腹胀肠道炎症等消化系统疾病，甚至对畜禽免疫系统造成抑制，导致禽类抵抗力下降易受疾病侵袭，对畜禽养殖业造成一定损失。更一方面，在牛乳生产及加工过程中，枯草芽孢杆菌对牛乳的食品安全、乳制品的口感及品相、消费者的健康和乳制品行业整体产业结构的稳定构成极大威胁^[4,12,13]。目前抗枯草芽孢杆菌的药物制剂鲜有，如若一些农业生产者一味为提高效益使得枯草芽孢杆菌微生态制剂滥用，将会给畜禽业造成极大影响，然而新药物研发又面临着诸多挑战，迫切需要找到新的解决方案。

从裂褶菌抗枯草芽孢杆菌的核心靶点上看，ccpA与枯草芽孢杆菌菌内分解代谢相关，通过调节枯草芽孢杆菌菌内参与支链氨基酸生物合成的ilv-leu 操纵子对该菌体总体代谢调节起到重要作用^[14,15]。ccpA 是枯草芽孢杆菌碳代谢的全局调节因子，可通过有效利用可用碳源从而控制碳分解代谢物进而确保细菌的快速生长^[16]。ftsZ 是细菌中广泛存在的一种祖先微管蛋白。ftsZ 以GTP依赖性方式形成原丝同时招募必需因子来进行细胞分裂。通过刺激 FtsZ 的 GTP 酶活性^[17]。ftsZ与枯草芽孢杆菌的细胞分裂相关，该菌的细胞分裂受到ftsZ蛋白质的调节，并调节其聚合成Z环结构的能力进而影响着细菌的^[18-20]。spo0A与枯草芽孢杆菌的孢子形成相关，枯草芽孢杆菌基因 spoVG 的转录在孢子形成开始时被诱导，并依赖于0阶段调节基因 spo0A的产物，同时spo0A的突变可导致 abrB 基因产物失活进而影响着该菌的基因表达^[21]。codY与枯草芽孢杆菌的孢子形成和遗传能力发育相关，CodY是枯草芽孢杆菌转录调节因子，可控制多种基因和操纵子的表达。CodY可间接激活dtpT 基因表达寡肽通透酶，寡肽通透酶对该菌的孢子形成和遗传能力发育至关重要^[22,23]。dnaA与枯草芽孢杆菌的细胞分裂相关，该菌DNA 复制的启动需要 dnaA 蛋白，dnaA 在调节该菌生理学方面发挥着重要作用^[24]。dnaA 也间接影响该菌生长过程中调节子的表达，当dnaA 缺失会导致遗传能力发育的下降^[25]。comK与枯草芽孢杆菌的变构与调节蛋白质功能相关，枯草芽孢杆菌中的表型转换需要多个 ComK 蛋白的全或无启动子结合^[26]。AbrB 是参与枯草芽孢杆菌过渡期现象的全局基因调节因子。它参与控制稳定相功能表达的复杂调控网络，同时abrB在3种枯草芽孢杆菌丝氨酸/苏氨酸激酶磷酸化途径中起到重要作用^[27]。parB与枯草芽孢杆菌中广泛采用的质粒分配和染色体分离机制相关，parB严格控制着枯草芽孢杆菌染色体复制和分离的准确性^[28]。sigB是枯草芽孢杆菌中一般应激转录因子，sigB对于阻止成熟生物膜的有害过度生长以及在营养物质有限时触发扩散至关重要，通过控制生物膜来提升在不同环境中的适应性^[29]。walR是枯草芽孢杆菌热休克刺激子的新成员，可以通过位于sigI σ（I）启动子上游的结合位点在热应激下正向直接调节sigI转录，此外walR在协调细胞壁代谢与细胞增殖方面发挥着关键作用^[30]。因此，Schizophyllan与ccpA、ftsZ、parB、walR靶点基因结合度较高，Schizophyllan可能主要通过调节枯草芽孢杆菌菌内参与支链氨基酸生物合成、调控染色体复制和分离的准确性、ftsZ蛋白质的调节以及抑制ftsZ的组装从而抑制了细菌的增殖、细菌生物膜的形成进而影响着细菌的总体代谢、细胞增殖及分裂等进而达到抗枯草芽孢杆菌的效果。

从KEGG、GO功能富集分析上看，裂褶菌主要从通过DNA模板转录调控、细菌孢子形成激活调控、DNA-蛋白质复合物、转录顺式调控区结合、相同的蛋白质结合、DNA 结合及DNA结合转录抑制因子活性和GO功能活性，进而影响细菌DNA 模板转录的频率、速率或程度及孢子形成频率、速率或程度的过程，调控DNA 的特定序列结合以及与抑制或减少特定基因组转录的DNA转录因子活性等以达到抗枯草芽孢杆菌的作用。组氨酸激酶（histidine kinase, HK）与其下游的反应调节子（response regulator, RR）共同组成典型的双组分调节系统（two-component regulatory system, TCS），又名细菌双组分系统，是枯草芽孢杆菌信号转导过程中的主要调节的KEGG代谢通路之一^[31,32]。裂褶菌抗枯草芽孢杆菌可能介导双组分调节系统，通过一步磷酸化或多步级联磷酸化的调节方式完成信号转导过程，调控多种逆境响应相关的基因表达，影响着细菌的孢子形成过程，调控孢子形成的基因表达。通常与发育、耐受性等有关以及适应温度变化、适应抗生素压力、产生毒力、顺应酸性环境和抵抗有机化合物胁迫等过程。

综上所述，裂褶菌可能主要通过Schizophyllan、Schizines B和Schizines A 3种活性成分，通过DNA模板转录调控、细菌孢子形成激活调控、DNA-蛋白质复合物、转录顺式调控区结合、DNA结合转录抑制因子活性等GO功能活性以及组氨酸激酶与其下游的反应调节子共同组成典型的双组分调节系统发挥抗枯草芽孢杆菌的潜在作用机制。本文为抗枯草芽孢杆菌研究提供了一定思路和方向，但本研究结果仍需后续进一步实验验证。

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基金资助

安徽省自然科学基金资助项目(2024AH051493)

安徽省自然科学基金资助项目(2023AH052423)

6种阜阳本土栽培药用菌的药用价值研究

长裙竹荪高效液体菌种的研发与产业化应用