藜麦 SWEET 基因家族鉴定与分析

Identification and Analysis of the SWEET Gene Family in Chenopodium quinoa

摘要

藜麦（Chenopodium quinoa Willd.）属于藜科植物，能在高海拔、干旱、盐碱等恶劣环境中生长，具有较高的研究价值。糖外排转运蛋白在植物糖转运和抗逆性中起关键作用。本研究用生物信息学方法，从藜麦基因组中鉴定出22个Cq SWEET基因，分析了其系统发育树、理化性质及顺式作用元件。系统发育分析显示，多数分支支持率高，22个基因依聚类分为4个亚家族。理化性质上，这些基因编码的氨基酸为74 ~ 428个，分子量为7 758.29 ~ 47 647.77 Da，等电点为5.09 ~ 9.68。基因结构方面，所有基因都有启动子和外显子，多数基序在蛋白序列N末端集中分布。这些基因普遍至少编码MtN3_slv和MtN3_slv superfamily两个核心结构域之一。顺式作用元件分析表明，22个基因含大量与生长发育、激素调节和胁迫响应相关元件，显示了该基因家族在藜麦适应性进化中的重要性。本研究为解析藜麦糖转运机制和抗逆性改良提供了理论依据，并为未来利用这些基因进行藜麦品质改良奠定了基础。

Abstract

Chenopodium quinoa Willd.,is a plant belonging to the family Chenopodiaceae, capable of growing in harsh environments such as high altitudes, arid regions, and saline-alkali soils. The SWEET gene family plays crucial roles in plant sugar transport and stress tolerance. In this study, we used bioinformatics methods to identify 22 CqSWEET genes from the C. quinoa genome and analyzed their phylogenetic tree, physicochemical properties, and cis-acting elements. Phylogenetic analysis revealed that most branches had high support rates, with the 22 genes clustering into four subfamilies. In terms of physicochemical properties, these genes encoded amino acids ranging from 74 to 428 residues, with molecular weights from 7 758.29 to 47 647.77 Da, isoelectric points from 5.09 to 9.68. In terms of gene structure, all genes possessed promoters and exons, with most motifs concentrated at the N-terminal end of the protein sequence. These genes universally encoded at least one of the two core domains, MtN3_slv and MtN3_slv superfamily. Analysis of cis-acting elements revealed that the 22 genes contained numerous elements associated with growth and development, hormone regulation, and stress response, highlighting the importance of this gene family in the adaptive evolution of C. quinoa.This research provides a theoretical basis for understanding the sugar transport mechanism and improving the stress resistance of quinoa and lays a foundation for future quality improvement of quinoa by using these genes.

Graphical abstract

关键词

藜麦 / SWEET基因家族 / 生物信息学

Key words

Chenopodium quinoa / SWEET gene family / Bioinformatics

糖在植物响应非生物胁迫中发挥核心作用。其中，糖外排转运蛋白（SWEET）以低能耗和双向运输的方式介导糖的跨膜转运，广泛参与植株发育、果实积累、抗病性与逆境适应等多种过程^[1,2]。近年来，SWEET基因的功能多样性在作物中不断被揭示：在甜瓜中，17个CmSWEET基因的表达与果实糖积累、枯萎病和白粉病抗性密切相关^[3]；在甘蓝型油菜中，BnaSWEET12.2 通过调控种子糖转运显著影响含油量和蛋白质含量^[4]；在铁皮石斛中，27个DcSWEET基因通过RNA-seq和RT-qPCR，发现了3个基因可以作为铁皮石斛耐旱性潜在基因^[5]；在菠菜中，16个SoSWEET基因在霜霉病胁迫后表达量明显变化^[6]。这些发现凸显了SWEET家族在作物品质形成和抗性调控中的双重价值。但藜麦作为耐盐碱先锋作物，其SWEET家族的系统分析仍属空白。

藜麦（Chenopodium quinoa）是首次由我国西藏农牧大学农学系的贡布扎西、旺姆于1987年由美国引进，1993年在西藏进行培育并获得成功^[7,8]。这是一种起源于南美安第斯山脉的古老伪谷物，因其籽粒富含优质蛋白、必需氨基酸、矿物质、维生素以及无麸质等特性，被联合国粮农组织（FAO）认定为具有巨大潜力的“超级食物”和未来粮食安全作物^[9,10]。藜麦引入至今已有近40年的栽培历史，其种植面积、流行品种在我国逐年增加。藜麦最显著的特征之一是其卓越的抗逆性，尤其对干旱、盐碱、霜冻等恶劣环境具有极强的耐受能力，使其成为边际土地开发和盐碱地农业的理想候选作物^[11-13]。这种强大的抗逆性必然涉及复杂的生理和分子调控网络，其中糖代谢与转运是关键环节。然而，目前关于藜麦如何通过糖转运蛋白（特别是SWEET家族）来协调糖分分配、维持渗透平衡以应对胁迫环境的分子机制，尤其是藜麦SWEET基因家族的全基因组鉴定及其在非生物胁迫下的功能研究，在目前报道的研究较少。因此，本研究基于藜麦的全基因组数据（Assembly v2.0），结合 Blast同源比对和HMM结构域筛选并鉴定到了藜麦22个SWEET（命名为CqSWEET）基因家族成员。在此基础上，对其理化性质、系统发育关系、基因结构、保守基序和顺式作用元件进行分析，揭示其与藜麦抗逆性的分子关联，为利用分子育种手段改良藜麦及高原作物糖转运育种提供靶基因。

1 材料与方法

1.1 藜麦CqSWEET家族基因的鉴定和筛选

从Ensemble Plants（https://plants. ensembl.org/index.html）下载藜麦的全基因组序列及GFF3注释文件，利用TBtools（v2.127）软件中Genome Analsis Init功能获取对应的CDS和蛋白序列。另外从NCBI数据库下载拟南芥和玉米的SWEET家族的蛋白序列，之后用Blastp对藜麦基因组和以上3种作物的SWEET家族基因进行多重序列比对，筛选藜麦潜在的SWEET家族成员。其次，从Pfam数据库（http://pfam-legacy.xfam.org）下载SWEET（pfam number: PF03083）的隐马尔可夫模型（HMM），然后使用HMMER工具进行鉴定。随后将两种方法鉴定结果进行合并，提交至NCBI-CDD(www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/bwrpsb/bwrpsb.cgi），进一步验证其保守结构域完整性及功能分类，得到最终藜麦CqSWEET家族成员。

1.2 藜麦CqSWEET蛋白序列理化性质分析

利用WoLFPSORT（https://wolfpsort.hgc.jp）网站的Prot Param工具对CqSWEET家族成员的氨基酸数、分子量、等电点等理化性质进行预测。

1.3 藜麦CqSWEET基因结构、保守结构域、保守基序分析

基于CqSWEET家族成员的蛋白序列和注释信息，通过NCBI Batch CD-search工具（https://www.ncbi.nlm. nih.gov/Structure/bwrpsb/bwrpsb.cgi）下载保守结构信息，基因结构用TBtools软件的Gene Structure View功能进行可视化，保守基序用TBtools软件的MEME工具对序列进行motif预测，再利用TBtools工具的Visualize MEME/MAST Motif Patter功能进行可视化，保守结构域用TBtools软件的Visualize NCBI CDD Domain Pattern功能进行可视化。

1.4 藜麦CqSWEET基因家族启动子区的顺式作用元件分析

基于TBtools软件从藜麦基因组数据中提取22个SWEET基因的CDS序列上游2000 bp的启动子区域，将获得的启动子区域序列提交到Plant Care数据库（http:/bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plant care/html/）来进行顺式作用元件分析，使用TBtools软件的Basic Biosequence View功能进行可视化。

1.5 拟南芥、玉米和藜麦的SWEET基因家族系统发育树构建

为了解拟南芥、玉米和藜麦的SWEET基因家族成员之间的系统发育关系，我们采用QTREE v.2.1.2软件进行最大似然系统发育树的构建，参数为“-m MFP -bb 1000 -T 20”。最后使用iTOL（https://itol.embl.de/）工具进行系统发育树可视化。

2 结果与分析

2.1 藜麦CqSWEET基因家族成员的鉴定及系统发育

过BLASTP与HMM两种方式进行藜麦全基因组搜索，最终筛选鉴定到了22个藜麦SWEET基因家族成员（图1），并进行随机命名拟南芥的命名与基因库一致，玉米参考了李明等玉米SWEET基因家族的命名^[24]。对藜麦SWEET基因家族22条蛋白序列进行进化树构建，藜麦的SWEET家族可分为4个亚家族。其中，Clade I包含3个基因，分别为CqSWEET9、CqSWEET12和CqSWEET13。Clade Ⅱ包含7个基因，分别为CqSWEET4、CqSWEET1、CqSWEET2、CqSWEET3、CqSWEET5、CqSWEET6和CqSWEET7。Clade ⅡI包含4个基因，分别为CqSWEET8、CqSWEET11、CqSWEET14和CqSWEET15；Clade IV包含8个基因，分别为CqSWEET10、CqSWEET16、CqSWEET17、CqSWEET18、CqSWEET19、CqSWEET20、CqSWEET21和CqSWEET22。

2.2 藜麦CqSWEET蛋白的理化性质分析

对CqSWEET家族编码蛋白进行理化分析，结果见表1。22个CqSWEET蛋白的氨基酸数目为74 ~ 428，且多数处于200 ~ 300的区间。其分子量介于7758.29 ~ 47647.77 Da，蛋白等电点处于5.09 ~ 9.68范围。其中，CqSWEET5、CqSWEET12、CqSWEET14、CqSWEET20这4个蛋白为酸性蛋白（PI < 7），其余18个则为碱性蛋白（PI > 7）。在不稳定指数方面，CqSWEET蛋白的数值范围为27.99 ~ 52.40。其中，CqSWEET6、CqSWEET7、CqSWEET9、CqSWEET10、CqSWEET12、CqSWEET13、CqSWEET14、CqSWEET17、CqSWEET19属于不稳定蛋白，其他的皆为稳定蛋白。溶脂指数处于93.38 ~ 131.95之间，亲水性总平均范围是0.320 ~ 0.983，且数值均大于0。这一结果表明，所有CqSWEET家族成员均为呈疏水特性蛋白。

2.3 藜麦CqSWEET基因结构分析

基因结构分析结果（图2）显示，CqSWEET基因在结构上呈现出一定的多样性。各基因序列长度差异明显，这使得不同成员间的内含子与外显子数目有所不同。CqSWEET基因家族主要包含2 ~ 9个外显子和 1 ~ 8个内含子。其中，序列较长的 CqSWEET14含有8个外显子和7个内含子；CqSWEET15序列并非最长，却拥有最多的外显子和内含子，由9个外显子和8个内含子组成；而序列最短的CqSWEET21和 CqSWEET22仅含有2个外显子和1个内含子。

从图3表明，藜麦CqSWEET蛋白家族的多数基序（motif）在蛋白序列的N末端区域相对集中分布。部分基序在大多数CqSWEET 蛋白中普遍存在，例如 motif1 - 4、motif6、motif7和motif10；然而，也有一些基序的分布具有特异性。CqSWEET1、CqSWEET2、CqSWEET3 和 CqSWEET4不含有 motif5、8、12、14，但共同拥有motif1、2、3、4、6、7、11。不过，进一步细分后，相同类别之间会存在相同的基序。这表明这两类亚族在进化过程中可能保留了某些共同的功能基础，但同时又具备本亚族的独特特征。

保守结构域分析结果如图3所示。CqSWEET20、CqSWEET21和CqSWEET22这3个基因上未检测到明显的保守结构域，可能为假基因。而其他CqSWEET家族成员基因至少编码了MtN3_slv 和 MtN3_slv superfamily这两个核心结构域中的一个，部分基因两个核心结构域都有编码。另外，部分基因编码了2个MtN3_slv核心结构域，如CqSWEET1、CqSWEET2、CqSWEET3 和 CqSWEET4。而CqSWEET11仅编码了1种MtN3_slv核心结构域。此外，部分成员基因除核心结构域外，还编码了其他结构域，例如CqSWEET13基因具有 Retrotran_gag_3 superfamily结构域，CqSWEET9 基因具有Ribosomal_S11 superfamily结构域，CqSWEET14基因具有FHY3 superfamily结构域。

2.4 藜麦CqSWEET顺式调控元件

启动子区域的顺式调控元件在转录因子介导的基因表达调控中起着关键作用。解析这些元件的组成模式，能帮助我们阐明基因的调控机制及其潜在生物学功能。在本研究中，基于藜麦基因组数据，我们截取了22个CqSWEET基因转录起始位点上游2 000 bp的区域作为启动子序列，并利用PlantCARE数据库对其中的顺式作用元件进行分析。随后，将分析所得数据导入TBtools软件进行可视化处理（图4）。分析结果显示，共发现32个顺式作用元件，我们从中选取了17个进行深入分析。这些元件主要涉及多种响应类型，包括赤霉素响应、低温响应、厌氧诱导、谷蛋白代谢调节、胚乳表达、光响应、生长素响应、水杨酸响应、脱落酸响应、缺氧特异性诱导、防御和应激反应、昼夜节律调控以及创伤响应等。具体来看，厌氧诱导元件和光响应元件保留在16个CqSWEET基因中，脱落酸响应元件保留在11个CqSWEET基因中，低温响应元件存在于8个CqSWEET基因中。此外，极少部分CqSWEET基因的启动子还含有与栅栏叶肉细胞、防御及应激等相关的响应元件。综上所述，这些顺式元件对于CqSWEET基因参与调控藜麦的生长发育以及应对各种逆境胁迫过程至关重要。

3 讨论

本研究借助SWEET家族的保守结构域和多种模式植物的SWEET基因序列进行比对分析，成功在藜麦基因组中鉴定出22个CqSWEET基因。这一家族规模相较于其他已研究的作物，如拟南芥（17个）^[14]、高粱（23个）^[15]、小麦（108个）^[16]，处于中等水平。已知SWEET基因是调控糖分从源向库转运的关键开关，且藜麦中的SWEET蛋白均为疏水蛋白，这与前人对甘蓝型油菜和甜瓜等植物的研究结果相符，这些植物的SWEET蛋白都具备典型的MtN3/saliva结构域^[17]，这充分表明SWEET基因家族在藜麦中是一个重要的糖转运调控因子库。在其他植物中，木薯的MeSWEET10 - 8基因经亚细胞定位和糖转运试验，证实其定位在细胞膜上，具备转运木糖的功能，且通过木薯不同部位组织RNA - seq分析，发现该基因在木薯的根、茎、叶均有分布^[18]。玉米的ZmSWEET1a和ZmSWEET1b基因亚细胞定位在细胞膜上，结合RNA - seq分析可知，它们在玉米的根、茎、叶和籽粒等部位都有表达^[19]。由此推测，CqSWEET基因很可能在藜麦的源库部位表达，参与藜麦源-库-流过程，并且可能存在协同运作机制。

根据进化关系，22个CqSWEET基因被分为4个亚族，这种分类模式与已报道的扁蓿豆^[20]、金橘^[21]等模式植物中SWEET家族的进化关系基本一致，这体现了CqSWEET基因在进化上的保守性，同时也暗示其功能可能在不同亚家族间发生了分化。启动子顺式作用元件分析结果表明，CqSWEET基因家族成员主要受植物激素和光响应类元件调控，这与油茶^[22]的研究结果相似，暗示其可能参与光反应和各种胁迫反应，并且与植物体内的生长素、赤霉素等多种激素存在关联。例如，在水稻中，OsSWEET13基因通过介导蔗糖转运参与水稻对干旱胁迫的响应^[23]；在玉米中，转基因玉米经干旱胁迫试验，验证了ZmSWEET12基因在干旱胁迫下会表达^[24,25]。因此可以合理推测，CqSWEET基因也可能通过响应不同胁迫的顺式作用元件，作为胁迫信号转导途径中的关键节点，调节植物生长发育、光反应等过程。另外，与氧气有关的元件在CqSWEET基因中数量较多，这说明CqSWEET基因可能参与有氧和厌氧反应等过程，从而参与藜麦各源库部位的生理反应。

另外，本研究还发现CqSWEET20、CqSWEET21和CqSWEET22这3个基因上未检测到明显的保守结构域。保守结构域通常是蛋白质执行特定功能的关键区域，缺乏这些结构域可能会导致这些基因在功能上出现缺失。从糖转运功能角度来看，由于SWEET基因家族的主要功能是调控糖分转运，这些无结构域的基因可能无法正常编码具有完整糖转运功能的蛋白。正常具有保守结构域的CqSWEET基因可以形成特定的蛋白构象，与糖分分子结合并实现转运，而无结构域的基因所编码的蛋白可能无法形成有效的结合位点，从而丧失转运糖分的能力。从进化角度分析，这些无结构域基因可能是在进化过程中发生了突变或基因重组事件，导致保守结构域丢失。这种改变可能是随机的，也可能是在特定的选择压力下发生的。如果是随机突变，那么这些基因可能逐渐演变为假基因，不再具有生物学功能。但如果是在特定选择压力下发生的，例如藜麦在适应某种特殊环境时，可能不再需要这些基因所编码的功能，从而导致结构域丢失。从调控网络角度考虑，CqSWEET基因受到多种顺式作用元件的调控，参与复杂的基因调控网络。无结构域的CqSWEET基因可能无法正常响应这些调控信号，或者在调控网络中产生异常的反馈，影响整个糖转运调控系统的平衡。例如，它们可能会干扰其他正常CqSWEET基因的表达和功能，导致藜麦在源-库-流过程中出现紊乱，影响其生长发育和对环境的适应能力。

为了深入了解这些无结构域基因的潜在功能和影响，未来可以开展进一步的研究。例如，通过基因编辑技术将这些基因敲除，观察藜麦在生长发育、糖分转运和抗逆性等方面的变化。也可以对这些基因进行改造，尝试恢复其保守结构域，研究其功能是否能够恢复，从而更准确地评估无结构域对基因功能的影响。

4 结论

本研究基于藜麦基因组数据，通过系统分析鉴定出22个CqSWEET家族成员，分为4个亚族。理化性质分析表明，22个SWEET基因的蛋白都是疏水性蛋白，且大部分CqSWEET基因家族蛋白为碱性的稳定蛋白，表明SWEET基因家族蛋白对膜运输有着重要作用。基因结构表明，CqSWEET家族的大多数基序在蛋白序列的N末端区域相对集中，但有3个基因上没有明显保守结构域；顺式元件表明，CqSWEET基因存在大量的生长素、赤霉素及脱落酸等激素元件，显示其对生长素、脱落酸等关键植物激素具有高度敏感性，且大部分基因对厌氧和光响应都有表达。

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