芜菁肉质根表皮花青素合成代谢途径相关基因挖掘

Mining of Genes Associated with Anthocyanin Biosynthesis Pathway in the Fleshy Root Epidermis of Turnips (Brassica rapa)

摘要

本研究旨在解析芜菁肉质根表皮花青素合成代谢的分子机制。选用白色芜菁（GPB）和紫色芜菁（GPZ）为材料，通过表型观察、花青素测定和转录组分析开展研究。结果表明，GPZ的花青素含量是GPB的15倍，鉴定到8 866个差异表达基因，主要富集于代谢途径和信号转导通路。结果说明，查尔酮合成酶（BraA03g007774E）和类黄酮3′-羟化酶（BraA10g047590E）等关键基因的高表达及其启动子变异可能是肉质根紫色表皮形成的重要原因，为芜菁肉质根紫色表皮的形成机制提供理论依据。

Abstract

This study aimed to elucidate the molecular mechanisms underlying anthocyanin biosynthesis in the epidermis of turnip (Brassica rapa) fleshy roots. White-skinned (GPB) and purple-skinned (GPZ) turnip varieties were selected for phenotypic observation, anthocyanin quantification, and transcriptome analysis. The results showed that the anthocyanin content in GPZ was 15-fold higher than in GPB, with 8,866 differentially expressed genes (DEGs) identified, predominantly enriched in metabolic pathways and signal transduction. The findings suggest that the upregulated expression of key genes(BraA03g007774E and BraA10g047590E) and their promoter variations may be critical for purple epidermis formation. These results provide a theoretical foundation for understanding the mechanisms of purple pigmentation in turnip fleshy roots.

Graphical abstract

关键词

芜菁 / 花青素 / 转录组 / 差异表达基因 / 代谢通路

Key words

Brassica rapa / Anthocyanin / Transcriptome / Differentially expressed genes / Metabolic pathway

花青素属于酚类化合物中的黄酮类物质，是一类水溶性色素^[1]。研究表明，自然界中已鉴定出635种以上花青素^[2]。基于3′和5′位点的羟基化或甲基化修饰模式，花青素主要分为六类：天竺葵素、矢车菊素、飞燕草素、芍药素、矮牵牛素和锦葵素^[3,4]。花青素的含量及其组成是决定多种果蔬呈现红、蓝、紫和橙等色泽的关键因素^[5]。此外，植物花青素具有重要的营养价值和药用价值，包括抗氧化、抗癌和预防心血管疾病等生理活性^[6-8]。因此，提高果蔬花青素含量已成为满足消费者对功能性健康食品需求的重要育种目标。

花青素合成代谢通路是植物类黄酮代谢途径的重要分支，其生物合成由多种酶协同调控并通过修饰－转运实现组织特异性积累^[9]。该途径以苯丙氨酸为起始底物，在细胞质内经酶级联反应生成花青苷，最终由谷胱甘肽转移酶（GST）介导转运至靶部位。该代谢过程具有种间保守性，主要包含3个阶段：第一阶段是苯丙氨酸经苯丙氨酸裂解酶（PAL）、肉桂酸4-羟基化酶（C4H）和4-香豆酰辅酶A连接酶（4CL）催化生成4-香豆酰辅酶A（4-coumaroyl-CoA）^[10]；第二阶段是4-香豆酰辅酶A与丙二酰辅酶A（Malonyl-CoA）经查尔酮合成酶（CHS）、查尔酮异构酶（CHI）及黄烷酮3-羟化酶（F3H）催化形成无色花色素（Dihydrokaempferol, DHK），随后通过类黄酮3′-羟化酶（F3′H）和3′5′-羟化酶（F3′5′H）羟基化生成二氢槲皮素（DHQ）与二氢杨梅素（DHM）；第三阶段是花青素特异性合成与修饰，DHK、DHQ及DHM经双氢黄酮醇还原酶（DFR）催化分别生成天竺葵素、矢车菊素和飞燕草素^[11]，再经花青素合成酶（ANS/LDOX）氧化及类黄酮3-葡萄糖基转移酶（3GT/UFGT）糖基化形成花青素3-O-葡糖苷，最终经鼠李糖基转移酶（3RT）、5-葡萄糖基转移酶（5GT/5UFGT）、甲基转移酶（MT）及酰基转移酶（AT）协同完成糖基化、甲基化与酰基化修饰，形成稳定花青苷。

芜菁（Brassica rapa L. 2n=2x=20）是十字花科芸薹属芸薹种下的一个亚种，属于2 a生草本植物^[12]。该植物以其肥大的肉质根和新鲜叶片作为人类食物或牲畜饲料而广泛栽培。作为一种食、饲、药兼用型植物，芜菁的肉质根含有丰富的营养成分，包括多糖、维生素、叶酸以及钙等矿物质^[13,14]。研究表明，芜菁具有多种生物活性，包括抗氧化^[15]、抗肿瘤^[16]和延缓衰老^[17]等功效。Zhuang等通过对紫色和绿色芜菁进行转录组和代谢组学分析，发现DFR基因编码区核苷酸突变导致转录提前终止，这可能是芜菁肉质根表皮呈现紫色的分子基础^[18]。但是，关于芜菁肉质根表皮花青素合成代谢途径相关基因挖掘的研究则未见报道。为此，本研究试图以白色芜菁（GPB）和紫色芜菁（GPZ）为试验材料，系统调查定植后不同天数的农艺性状，并在收获期采集肉质根表皮进行转录组测序，通过生物信息学分析筛选差异表达基因，并对其进行GO功能注释和KEGG通路富集分析，挖掘参与花青素合成代谢通路的关键基因。这些研究结果为深入解析芜菁肉质根紫色表皮形成的分子机制奠定重要的理论基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

以白色芜菁（GPB）和紫色芜菁（GPZ）为试验材料，将种子均匀播种于育苗盘中，约一周后将健壮的幼苗转移到穴播盘中，在25±1 ℃、16 h光照/8 h黑暗条件下培养。7 d后，选取长势一致的幼苗移栽至穴盘，于玻璃温室中缓苗7 d。待幼苗长至2-3真叶期，按50 cm（行距）×30 cm（株距）的规格定植于温室大棚中。自定植日起，每隔7 d（即第14、21、28、35、42、49、56、63、70、77、84和91天）对两种芜菁的表型性状进行调查。于定植后77 d，分别采集GPB和GPZ的表皮组织，其中部分样品立即用于花青素含量测定，其余样品经液氮速冻后，保存于-80℃超低温冰箱，用于后续RNA提取和分子生物学试验。

1.2 农艺性状调查

依据国家农作物种质资源平台《萝卜种质资源描述规范》（标准编号：NY/T 2232-2012），对芜菁表型性状进行调查，采用格尺（精度0.1 cm）测定株高、根长、肉质根高和肉质根宽，使用电子天平（精度0.01g）测定地上和地下生物量。试验设置3次生物学重复，每个重复5株，共计15株样本。具体测定指标及方法如下：（1）株高：自肉质根顶部至植株最高叶尖的垂直距离，单位cm；（2）根长：自肉质根顶部至主根末端的直线距离，单位cm；（3）地上生物量：齐地面剪取地上部分，测定其鲜重，单位g；（4）地下生物量：去除地上部分后肉质根的鲜重，单位g；（5）肉质根高：肉质根膨大部位的最大垂直高度，单位cm；（6）肉质根宽：肉质根膨大部位的最大水平宽度，单位cm。

1.3 花青素含量分析

花青素测定方法参照DB12/T 885-2019标准，具体步骤如下：

标准曲线绘制：量取原花青素储备液（1.0 mg/mL），配制成系列浓度的原花青素标准工作液；精密加入6 mL盐酸-正丁醇溶液和0.2 mL硫酸铁铵溶液，混匀后密封；将混合液置于沸水浴中加热40 min，随后立即转移至冰水中冷却；使用紫外分光光度计在546 nm波长处测定吸光度；以吸光度为纵坐标，原花青素浓度为横坐标，绘制标准曲线。

样品处理与测定：准确称取100 mg芜菁样品，置于50 mL容量瓶中；加入30 mL甲醇，在功率250 W、频率50 kHz条件下超声处理20 min；待样品冷却至室温后，用甲醇定容至50 mL，摇匀后离心；吸取1 mL上清液，按照标准曲线绘制步骤进行处理；以甲醇溶液为空白对照，在546 nm波长处测定吸光度；根据标准曲线计算试样中花青素的含量。

试样中花青素含量按以下公式计算：

x=\frac{c\times V\times V_{\mathrm{2}}\times \mathrm{1}\mathrm{000}}{m\times V_{\mathrm{1}}\times \mathrm{1}\mathrm{000}\times \mathrm{1}\mathrm{000}}\times \mathrm{100}(1)

式中：x：试样中原花青素的含量，单位g/100 g；c：反应混合物中原花青素的浓度，单位μg/mL；V：待测样液总体积，单位mL；V₁ ：样液反应体积，单位mL；V₂ ：样液反应后总体体积，单位mL；m：样液所代表的试样质量，单位mg。

试验数据以3次生物学重复的均值±标准差表示，保留3位有效数字。采用Excel 2016软件进行数据处理，使用Student's t检验分析GPB和GPZ两组间花青素含量的差异显著性（P < 0.05）。

1.4 总RNA的提取及文库构建

采用植物总RNA提取试剂盒对GPB和GPL的RNA进行提取，并对提取的RNA质量进行检测。挑选出质量合格的RNA样品，利用特异性结合mRNA的Oligo（dT）磁珠去除其中的rRNA，之后加入片段化缓冲液对mRNA进行随机打断。在逆转录酶体系中，以片段化的mRNA为模板，使用六碱基随机引物合成cDNA的第一条链；随后于DNA聚合酶体系中，以dNTPs为原料合成cDNA的第二条链。将纯化后的双链cDNA进行加A尾操作，之后连接测序接头，采用AMPure XP beads筛选出长度约为200 bp的cDNA，进行PCR扩增，再使用AMPure XP beads纯化PCR产物，最终获得cDNA文库。对质检合格的样品进行Illumina测序。

1.5 测序结果统计

为确保后续分析的准确性，利用fastp软件对下机测序数据进行过滤处理^[19]。首先剔除以下几类低质量数据：一是含有接头的reads，这类reads可能会引入非目标序列信息，干扰后续分析；二是包含N（未知碱基）的reads，N的存在增加了序列解读的不确定性；三是全部由A碱基组成的reads，此类reads通常不具有生物学意义；四是质量值Q ≤ 20的碱基在整个reads碱基数中所占比例超过50%的低质量reads。通过上述过滤操作可有效去除噪声数据，获取高质量的测序数据。在此基础上，进一步计算其质量评估指标，包括Q20值（测序数据中碱基识别准确率在99%以上的比例）、Q30值（测序数据中碱基识别准确率在99.9%以上的比例）以及GC含量（序列中鸟嘌呤G和胞嘧啶C碱基的相对含量）。

1.6 转录组数据分析及差异表达基因分析

运用HISAT2软件将高质量测序数据比对到芜菁ECD04参考基因组（ECD04.v0）上，之后借助Stringtie软件重构转录本，再通过RSEM软件计算各样本中所有基因的reads数与FPKM（Fragments per kilobase of transcript per million fragments mapped）值^[20,21]。在此基础上，利用DESeq2软件分析GPB和GPL之间的差异表达基因（differentially expressed genes，DEGs），以基因表达变化倍数的绝对值（|FoldChange|） ≥ 2且错误发现率（False Discovery Rate，FDR） < 0.05作为筛选标准^[22]；最后，采用R脚本对筛选得到的DEGs开展基因本体论（GO，Gene Ontology）和KEGG富集分析，以P value < 0.05为阈值，若满足该条件表明相应的GO功能注释条目或KEGG富集通路存在显著富集。

1.7 实时荧光定量RT-qPCR验证

根据南京诺唯赞生物科技股份有限公司生产的HiScript II Q RT SuperMix for qPCR（+gDNA wiper）产品说明书完成cDNA反转录过程；引物设计借助NCBI（National Center for Biotechnology Information）平台开展，具体引物序列详见表1；以该公司生产的AceQ® qPCR SYBR Green Master Mix为基础建立PCR体系并确定反应程序，使用CFX Connect实时荧光定量PCR系统开展RT-qPCR试验。试验过程中选取芜菁Actin作为内参基因，通过△Ct方法计算目标基因的相对表达量^[23]。

1.8 基因序列变异分析

采用CTAB法提取GPB和GPZ的基因组DNA，通过酶随机打断将其处理为短DNA片段，随后实施平末端修复，并于DNA片段两端连接dA尾和测序接头，接着利用AMPure XP磁珠纯化这些DNA片段，进而针对300 ~ 400 bp片段进行扩增。完成文库构建后，对所建文库予以纯化与库检操作，随后交由广州基迪奥生物科技有限公司使用Hiseq X10 PE150测序平台开展测序。待测序结束后，借助bwa软件把测序获得的reads比对至芜菁ECD04参考基因组，以此开展双亲之间SNP和InDel的分析工作^[24]。基于测序结果，初步剖析花青素代谢通路上差异表达基因的启动子、外显子和内含子区域在GPB和GPZ之间的序列差异。

2 结果与分析

2.1 农艺性状调查分析

为探究芜菁生长趋势及其农艺性状的变化规律，本研究分别于定植后第14、21、28、35、42、49、56、63、70、77、84和91天对芜菁植株进行取样观察，（如图1所示），并测定其株高、根长、地上生物量、地下生物量、肉质根高及肉质根宽（如图2所示）。研究结果表明：随着定植天数的增加，株高呈现逐渐增长的趋势，尤其在定植初期增长较快，后期增长趋于平缓（图2A）；根长在定植初期增长较慢，随着天数的增加，根长逐渐增长，但增长速度逐渐减缓，部分天数出现小幅下降（图2B）；地上生物量随定植天数的增加而显著增加，增长趋势在定植63 d之后加快（图2C）；地下生物量随定植天数的增加而增加，定植63 d后增长速度加快且幅度较大（图2D）。在肉质根形态特征方面，随着定植天数的增加，肉质根高呈现逐渐增长的趋势，定植14 d时2.03 cm缓慢增长至77 d时7.87 cm，此后增长速度加快（图2E）；定植后肉质根宽也表现出随时间增长的趋势，从14 d时的约1.96 cm增长至91 d时的约15.55 cm，增长速度在后期加快（图2F）。

2.2 芜菁肉质根花青素含量分析

以定植后77 d的白色芜菁和紫色芜菁肉质根表皮为试验材料，测定其花青素含量。结果发现GPZ的花青素含量远高于GPB，大约是GPB的15倍以上。如图3所示。

2.3 样品相关性分析

为评估样本间的重复性，本研究采用R语言进行主成分分析（PCA，Principal Component Analysis）。分析结果显示，GPB和GPZ组内样本具有较高的重复性，且组间样本差异显著。具体而言，第一主成分对样本差异的贡献率为65.7%，第二主成分的贡献率为33.9%，表明样本重复性良好，且GPB与GPZ样本间存在明显差异，如图4所示。

2.4 转录组测序数据的过滤及比对

为降低无效数据对分析结果的干扰，本研究对原始数据进行严格过滤。首先，使用fastp软件对244 082 810条原始reads进行质量控制，最终从6个样本中获得242 771 338条高质量reads（表2）。经数据过滤后，共获得36 252 816 271 bp的高质量碱基序列，其中Q20（碱基识别准确率 ≥ 99%）的高质量reads占比为97.24%、Q30（碱基识别准确率 ≥ 99%）的高质量reads占比为92.50%，GC含量分布在46.43% ~ 46.64%之间。通过去除比对到核糖体的reads，最终保留241 819 266条unmapped reads。随后，利用HISAT2软件将RNA-Seq测序数据中的spliced reads进行比对，结果显示样本中比对到芜菁参考基因组的reads比例为2.2% ~ 2.5%，而所有可定位到基因组上的reads比例达到85.4% ~ 86.8%，表明所获得的转录组数据质量良好。

2.5 差异表达基因筛选

本研究采用FPKM值对GPB和GPZ表皮的基因表达差异进行分析，以评估转录组中基因的表达水平。差异表达基因的筛选标准设定为log2（Fold change）> l且FDR < 0.05，筛选结果如图5所示。基于转录组数据分析，在GPB和GPZ样本间共鉴定到8 866个差异表达基因（DEGs），其中显著上调基因4 309个，显著下调表达基因4 557个。

2.6 差异表达基因GO功能注释和KEGG富集通路分析

为系统解析芜菁肉质根表皮颜色形成的分子机制，本研究对GPB和GPZ表皮的差异表达基因开展GO功能注释及KEGG通路富集分析（图6A-D）。GO分析结果表明：在生物过程分类中，细胞过程（2 268个上调，2 234个下调）和代谢过程（2 027个上调，1 989个下调）的DEGs数量最为显著（图6 A）；在分子功能层面中，结合功能（1 971个上调、1 857个下调）和催化活性（1 757个上调，1 832个下调）相关的DEGs占主导地位（图6 B）；细胞组分中差异基因主要富集于细胞结构组件（1 746个上调，1 546个下调）和含蛋白复合体（581个上调，399个下调）两类（图6 C），

进一步通过KEGG通路富集分析发现，差异基因显著富集于19个代谢通路，其中代谢途径富集程度最高，包含1 027个DEGs。在代谢通路分类中：碳水化合物代谢（326个）、氨基酸代谢（222个）和能量代谢（202个）的差异表达基因数量最为显著；在遗传信息处理方面翻译（129个）和蛋白质折叠、分类和降解（126个）相关通路发挥重要作用；环境信息处理中信号传导通路（191个）尤为突出。值得注意的是，富集程度前5个通路依次是代谢途径、碳水化合物代谢、氨基酸代谢、能量代谢和信号转导（详见图6 D）。

2.7 花青素合成代谢途径中基因表达分析及转录组数据验证

在花青素代谢通路（MapID:map00940、map00941、map00942）中，共鉴定到22个DEGs。与GPB相比，GPZ中有8个基因表达上调，有14个基因表达下调。具体而言，在类苯基丙烷途径中，有2个基因（BraA03g009236E和BraA09g001272E）表达上调，而13个基因（如BraA03g009235E和BraA04g043691E等）表达下调；在类黄酮生物合成阶段，4个基因（BraA02g029008E和BraA03g007774E等）表达上调，1个基因（BraA09g005263E）表达下调；在花青素生物合成途径中，2个基因（BraA08g038814E和BraA10g045994E）表达上调（表3）。

为验证转录组数据的可靠性，随机选择4个差异表达基因进行实时荧光定量PCR检测。BraA07g035497E、BraA09g005088E、BraA05g015303E和BraA04g043691E在GPZ中的相对表达量显著低于GPB中的相对表达量，实时定量PCR的结果与转录组数据的结果一致（图7），说明转录组数据可靠。

2.8 花青素合成代谢途径中差异表达基因序列分析

比对分析花青素合成代谢通路中22个差异表达基因在GPB和GPZ之间的DNA序列，结果表明11个基因无序列差异，BraA03g009236E和BraA03g011104E仅在内含子上有一个单碱基变异，BraA09g001946E在启动子区域有一个SNP，另外8个基因的序列差异如图8所示。BraA03g007774E有2外显子和1个内含子，共包含32个变异位点，其中12个位于启动子区域，19个位于外显子区域，1个位于内含子区域。BraA03g011103E有3个SNPs和2个InDels，其中2个SNP位于内含子区域，1个SNP于外显子，2个InDels位于启动子区域。BraA05g014760E有2个InDels位于启动子和17个SNPs位于外显子。BraA10g047590E有4外显子和3个内含子，共包含51个变异位点，其中28个位于启动子区域，16个位于外显子区域，7个位于内含子区域。

3 讨论

芜菁定植株高呈现迅速生长的趋势，主要是因为芜菁通过增强光合作用以促进营养生长，进而获得更多的光能资源，并为植株生长积累能量。定植63 d后，株高增长速率逐渐减缓，表明芜菁植株生长进入相对稳定的阶段。根长在定植初期增长缓慢，反映芜菁在移苗定植后存在缓苗适应过程；随后根系进入快速生长期以高效汲取土壤养分；个别时间点根长呈现小幅度下降，可能与取样造成的机械损伤有关。定植第63天后地上生物量和地下生物量均呈现加速增长趋势，表明此时芜菁进入生物量快速积累阶段，特别是肉质根开始显著膨大。肉质根高度随定植天数的增加而增长，定植77 d后增长速度加快，芜菁扁形的肉质根比较受市场欢迎，因此根据肉质根的高度数据，需要在定植77 d之前完成采收。肉质根宽度在定植63 d后增长速率加快，表明肉质根膨大属于发育后期的特征，且在63 ~ 91 d期间表现尤为突出。综合考虑肉质根的高度、宽度和产量，建议将定植后77 d作为适宜采收期。

以定植后77 d白色芜菁（GPB）和紫色芜菁（GPZ）肉质根表皮为材料进行分析，发现GPZ的花青素含量显著高于GPB达15倍。主成分分析（PCA）显示GPB和GPZ组内样本重复性良好，且组间分离明显（PC1=65.7%，PC2=33.9%），说明试验数据可靠。转录组测序数据经过严格质控后，共获得242 771 338条高质量reads（Q30 ≥ 92.5%），参考基因组比对率85.4% ~ 86.8%，数据质量符合要求。共鉴定到8 866个DEGs（上调4 309个，下调4 557个）。GO功能注释表明，DEGs主要富集于细胞代谢、催化活性及细胞结构调控等过程，表明花青素积累涉及多层次细胞结构与分子功能调控。KEGG富集通路分析显示，DEGs显著富集于代谢途径、碳水化合物代谢、氨基酸代谢及信号转导等通路，表明这些通路可能对花青素积累具有重要调控作用。特别鉴定出22个差异表达基因参与花青素合成代谢通路，其中BraA03g007774E（查尔酮合成酶）在GPZ中的相对表达量显著高于GPB，与其启动子区域存在的12个变异位点（10个SNPs和2个InDels）可能相关，该结果与Xie等^[25]关于BrCHS正调控花青素含量的报道一致。另一关键基因BraA10g047590E（类黄酮3'羟化酶）在GPZ中同样显著高表达，其启动子区存在28个变异位点（20 SNPs+8 InDels），与Jia等^[26]报道的CYP75B1促进花青素合成机制相符。后续将通过启动子活性试验验证这些变异对基因表达的调控作用，为阐明芜菁肉质根紫色表皮的形成机制提供理论支撑。

4 结论

本研究通过对白色芜菁（GPB）和紫色芜菁（GPZ）肉质根表皮的比较分析，揭示了花青素积累的分子机制。研究发现，GPZ的花青素含量显著高于GPB（约15倍），且转录组分析鉴定出8 866个差异表达基因（DEGs），其中4 309个上调，4 557个下调。GO和KEGG分析表明，这些基因主要富集于代谢途径、碳水化合物代谢及信号转导等通路。关键基因如查尔酮合成酶（BraA03g007774E）和类黄酮3'羟化酶（BraA10g047590E）在GPZ中显著高表达，其启动子区域的序列变异可能调控基因表达。这些结果为解析芜菁肉质根紫色表皮的形成机制提供了重要依据。

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基金资助

“新农科”高原植物生产类专业提升实践创新能力平台建设(533323003)

温州市基础性公益科研项目(N2023014)