芬顿氧化体系处理对牦牛乳蛋白结构的影响及蛋白质组学分析

Effects of Reactive Oxygen Species-Induced Oxidation on Yak Milk Protein Structure and Proteomic Analysis

摘要

为实现对牦牛乳蛋白结构的可控性修饰，精准调控其营养功能，从而改善牦牛乳加工过程中营养品质下降的问题，本研究以不同浓度H₂O₂（0，0.5，1，3，5，10 mmol·L⁻¹）氧化的牦牛乳蛋白为研究对象，进行羰基、游离巯基、总巯基等氧化指标及蛋白质组学测定，明确氧化处理过程中牦牛乳蛋白的氧化规律及蛋白功能的变化。结果发现，随着H₂O₂浓度的增加，羰基含量增加，游离巯基、总巯基、二硫键含量下降，溶解度先增加后降低，表面疏水性增加，粒径增大，Zeta电位绝对值增加，二聚酪氨酸含量降低。蛋白质组学分析鉴定到1 351种蛋白，其中5 mmol·L⁻¹ H₂O₂组蛋白功能差异最显著，有183种蛋白下调，276种蛋白上调；1 mmol·L⁻¹ H₂O₂组蛋白功能差异最小，有237种蛋白下调，292种蛋白上调。与对照组相比，0.5 mmol·L⁻¹ H₂O₂组上调8种通路，下调17种通路；1 mmol·L⁻¹ H₂O₂组上调22种通路，下调10种通路；3 mmol·L⁻¹ H₂O₂组上调11种通路，下调16种通路；5 mmol·L⁻¹ H₂O₂组上调10种通路，下调9种通路；10 mmol·L⁻¹ H₂O₂组上调10种通路，下调14种通路。本研究为牦牛乳的绿色加工及相关产品的质量控制提供理论依据。

Abstract

To achieve the controllable structural modification of yak milk protein and precisely regulate its nutritional functions, thereby mitigating the decline in nutritional quality during yak milk processing, this study used yak milk protein oxidized by different concentrations of H₂O₂(0, 0.5, 1, 3, 5, 10 mmol·L⁻¹) as the research object. Oxidation indicators, including carbonyl content, free sulfhydryl groups, total sulfhydryl groups, and proteomic analysis, were determined to clarify the oxidation rules and functional changes of yak milk protein during oxidative treatment. The results showed that with increasing H₂O₂ concentration, carbonyl content increased, while free sulfhydryl groups, total sulfhydryl groups, and disulfide bonds decreased. Solubility first increased and then decreased, surface hydrophobicity increased, particle size, and the absolute value of Zeta potential increased, and dityrosine content decreased. A total of 1351 proteins were identified by proteomic analysis. The 5 mmol·L⁻¹ H₂O₂ treatment group showed the most significant alterations in protein function, with 183 proteins downregulated and 276 proteins upregulated. In comparison, the 1 mmol·L⁻¹ H₂O₂ group displayed the least distinct changes in protein function, where 237 proteins were downregulated and 292 proteins upregulated. Compared with the control group, the 0.5 mmol·L^-¹ H₂O₂ group had 8 upregulated pathways and 17 downregulated pathways; the 1 mmol·L^-¹ H₂O₂ group had 22 upregulated pathways and 10 downregulated pathways; the 3 mmol·L^-¹ H₂O₂ group had 11 upregulated pathways and 16 downregulated pathways; the 5 mmol·L^-¹ H₂O₂ group had 10 upregulated pathways and 9 downregulated pathways; and the 10 mmol·L^-¹ H₂O₂ group had 10 upregulated pathways and 14 downregulated pathways.This study provides a theoretical basis for the green processing of yak milk and the quality control of related products.

Graphical abstract

关键词

牦牛乳蛋白 / 氧化修饰 / 氧化规律 / 蛋白质组学

Key words

Yak milk protein / oxidative modification / oxidation pattern / proteomics

牦牛作为一种高原优势畜种，可以适应高海拔、低氧、低温等极端环境^[1]，独特的生长环境赋予牦牛乳高免疫球蛋白和乳铁蛋白的营养特点^[2]。作为在营养强化食品开发中具有重要价值的牦牛乳蛋白^[3]，其在加工贮藏过程中却易受自由基攻击引发氧化修饰，导致功能特性改变以及生物活性损失。氧化反应会显著影响蛋白质的营养与功能特性，活性氧的直接侵袭或蛋白质与次级氧化产物反应，均可诱导蛋白质共价结构的改变^[4]，其中羟自由基（-OH）因其高反应活性尤为值得关注。在食品体系中，它可通过Fenton反应、光照、过渡金属催化等多种途径产生^[5]，羟自由基会迅速与蛋白质发生反应，攻击蛋白质的氨基酸侧链、肽键、游离巯基以及总巯基等关键部位，引发蛋白质结构和功能的改变^[6]。不同于油脂的氧化过程，食物中蛋白质的氧化并非纯粹的负面作用，适度的氧化反而能提升蛋白质对酶的敏感性，从而有利于人体对小肽及氨基酸等营养成分的消化和吸收^[7,8]。因此，通过羟自由基等可控氧化修饰手段研究牦牛乳蛋白特性，对牦牛乳蛋白加工、贮藏过程中的工艺参数优化具有一定指导意义。

目前，羟自由基对蛋白氧化的影响已有较多报道。在肌肉蛋白^[9]和乳清蛋白^[10]体系中，羟自由基会诱导羰基含量升高、巯基含量下降，进而影响蛋白结构与功能。适度氧化甚至可改善部分蛋白的凝胶与保水性能^[11,12]，而过度氧化则导致功能劣变^[13]。然而，上述研究多针对普通牛乳或肌肉蛋白体系。牦牛乳富含免疫球蛋白和乳铁蛋白等功能性成分，其蛋白组成与普通牛乳存在显著差异，氧化规律可能不同。因此，有必要针对牦牛乳蛋白的特性，系统研究羟自由基氧化对其结构与功能的影响。

加工与运输过程中蛋白质会发生多种复杂变化，而传统生物化学方法往往只能检测出主要蛋白的变化，难以捕捉到微量蛋白的细微差异，从而限制了相关研究的深度^[14]。相较于传统生物化学方法，4D非标记定量蛋白质组学（4D label-free quantification，4D LFQ）技术在分析加工与运输过程中微量蛋白质变化方面，展现出更显著的技术优势。它不仅能快速且灵敏地定量蛋白质，还能更精准地对低丰度蛋白及其修饰肽段进行组学分析，从而弥补了传统检测手段的不足。LU等^[15]采用此方法揭示了不同物种乳脂肪球膜蛋白的组学差异，在人、牛、山羊和牦牛的血清中分别鉴定和定量了198、169、213和128种蛋白质^[16]。不仅如此，蛋白质组学还能发现蛋白之间相互作用导致的信号传导变化：一种蛋白质如何调节另一种蛋白质的活性或者机体的某一条代谢通路^[17]，ZHANG等^[18]通过蛋白组学发现新生儿免疫和消化系统成熟过程中的蛋白质相互作用。此外，通过比较氧化前后差异表达蛋白质的KEGG通路富集情况，可精准定位氧化敏感蛋白及其修饰位点^[19]。也有研究表明，某些抗氧化酶类可能会在氧化过程中表达上调，以应对自由基的攻击，而一些与蛋白质折叠、修复相关的蛋白质可能会受到影响，导致蛋白质结构和功能的异常^[20]。此外，蛋白质组学还可以解析蛋白质翻译后修饰（如泛素化、乙酰化）在氧化过程中的动态变化，进一步阐明氧化的分子机制。

目前针对牦牛乳蛋白的氧化研究多集中于单一功能特性，缺乏氧化指标与蛋白质组学的系统性关联分析，且尚未明确可控氧化的最佳浓度阈值。因此，本研究旨在筛选牦牛乳蛋白可控氧化的最佳H₂O₂浓度，开展牦牛乳蛋白羰基、游离巯基、总巯基等氧化指标及蛋白质组学测定，进一步明确氧化处理过程中牦牛乳蛋白的氧化规律，为定向调控其结构、优化消化率与致敏性等功能特性提供理论依据，同时避免因过度氧化导致的营养损失及毒性产物积累，从而实现蛋白质结构的定向修饰与功能特性的优化。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

1.1.1 材料

本试验所用的牦牛乳样品取自西藏林芝，采集新鲜的牦牛乳样品，低温下转移至实验室。乙酸乙酯，BCA（bicinchoninic acid）试剂盒，上海泰坦科技股份有限公司；盐酸、四甲基乙二胺（TEMED）、氯化钠、氯化钾、磷酸二氢钾、磷酸氢二钠，合肥千盛生物科技有限公司；丙三醇、丽春红、蛋白标志物，合肥博美生物科技有限公司；硝酸纤维过滤膜（NC）、辣根过氧化物酶（HRP）、Tris分析纯，合肥巴斯夫生物有限公司；小鼠二抗，兔二抗，千株松生物。

1.1.2 仪器

冷冻离心机TDL5M，江苏新春兰科学仪器有限公司；荧光分光光度计LS55，美国PE公司；酶标仪BioTek ELx800，美国Biotek公司；纳米激光粒度仪WJL-628，上海仪电物理光学仪器有限公司；液相色谱仪EASY-nLC 1200，Thermo Fisher；质谱仪Agilent 6495C，Agilent；真空冷冻干燥机ALPHA1-4LSC，德国 Christ 公司；紫外分光光度计UV-5100，上海元析仪器有限公司；涡旋混合器XH-CA，无锡沃信仪器制造有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 牦牛乳蛋白的制备

新鲜的牦牛乳样品每批10升（分别购买5批次），分别在4 ℃ 4 500 r/min下离心15 min，去除脂肪，留下清液倒入培养皿中，冻干得到800 g牦牛乳蛋白（经纯度检测蛋白含量 ≥ 91%），于无菌密封袋中在-80 ℃条件下存储备用。

1.2.2 羟自由基氧化牦牛乳蛋白的制备

参考 Xiong Youling^[21]与张海萍^[22]等构建的芬顿（Fenton）氧化体系，具体反应条件如下：0.01 mmol·L^-1 FeCl₃、0.1 mmol·L^-1 VC、系列浓度梯度的H₂O₂（0.5、1、3、5、10 mmol·L^-1），以及含0.6 mol·L^-1 NaCl、pH 6.0的50 mmol·L^-1磷酸盐缓冲液。将牦牛乳蛋白样品充分分散于该氧化体系后，在4 ℃下进行24 h氧化反应，随后加入1 mmol·L^-1 EDTA终止反应。样品于4 ℃、8 000 r/min条件下离心10 min，取沉淀用5倍体积的50 mmol·L^-1磷酸盐缓冲液（pH 7.0）复溶，并在4 ℃、2 000 × g下离心15 min。收集沉淀后重复上述洗涤操作两次，以充分去除残留的Fenton试剂，最终将纯化后的沉淀冷冻干燥备用。

1.2.3 羰基含量的测定

基于Mestdagh及Shao等的实验方案^[23,24]，对步骤进行了微调和优化。取0.2 mL稀释后的样品溶液于2 mL离心管中，加入0.8 mL 2 mol·L^-1盐酸（含10 mmol·L^-1 2,4-二硝基苯肼）混合反应，配制相同浓度的盐酸体系做空白对照。在室温孵育1 h后，加入0.4 mL 40%三氯乙酸，混匀后静置30 min。随后以10 000 r/min离心20 min，在4 ℃下，使用1:1体积比的乙醇/乙酸乙酯清洗液进行3次洗涤。清洗后，将沉淀重溶于1.0 mL 0.02 mol·L^-1 pH 6.5磷酸盐缓冲液（含6 mol·L^-1 GuHCl）。在370 nm波长下测定吸光度，并采用摩尔消光系数22 000 kg计算每毫克蛋白质的羰基含量^[25]，以nmol DNPH·mg^-1蛋白质表示，具体计算遵循公式（1）。再利用BCA法对蛋白浓度进行定量：将25 mg·mL^-1 BSA标准品用稀释液稀释至2 mg·mL^-1，作为标准储备液。取适量体积的标准品与待测样品分别加入96孔板中，补足体积至相同体积；随后加入配制好的BCA工作液，充分混匀后在37 ℃恒温孵育，避光反应至溶液显色完成；冷却至室温后，在562 nm波长下测定吸光度值，根据BSA标准曲线回归方程计算得到样品的蛋白质浓度，单位为mg·mL^-1，最终用于羰基含量的换算，再据此开展后续数据分析与绘图。

\mathrm{羰基}\mathrm{含量}(\mathrm{n}\mathrm{m}\mathrm{o}\mathrm{l}\cdot \mathrm{m}{\mathrm{g}}^{-\mathrm{1}}\mathrm{蛋白})=\frac{A_{\mathrm{370}(\mathrm{净})}}{\mathrm{22}\times L\times C_{\mathrm{蛋白}}}\times \mathrm{125}\times {\mathrm{10}}^{\mathrm{5}}（1）

式中：A₃₇₀：370 nm波长处校正后的净吸光度，L：比色皿光程（cm），C_蛋白：样品蛋白质浓度mg·mL^-1，22：摩尔消光系数（×10³M^-1·cm^-1）

1.2.4 巯基和二硫键含量的测定

牦牛乳蛋白中巯基含量测定采用DTNB（Dinitrobenzene method）比色法^[26]，具体操作如下：

游离巯基检测：吸取0.5 mL预处理后的牦牛乳蛋白溶液，与2 mL质量分数为3%的SDS溶液充分混匀，加入0.2 mL DTNB试剂后在避光条件下反应60 min。以不加DTNB 的样品作为空白对照，在412 nm波长下测定吸光度。依据相应标准公式，计算每克蛋白质中游离巯基的含量，计量单位为μmol/g。按公式（2）计算：

\mathrm{F}\mathrm{r}\mathrm{e}\mathrm{e}SH(\mathrm{n}\mathrm{m}\mathrm{o}\mathrm{l}·g^{-\mathrm{1}})=\mathrm{73.53}\times A_{\mathrm{412}}\times \frac{D}{C}（2）

式中：A₄₁₂：412nm波长处校正后的净吸光度，D：稀释倍数，C：蛋白浓度mg·mL⁻¹

总巯基测定：取0.8 mL脱脂样品，与0.2 mL含8 mol·L⁻¹尿素及3% SDS的混合溶液混匀，避光孵育1 h；随后加入0.5 mL质量体积分数为40% 的三氯乙酸溶液，继续反应1 h。混合物于5 000 r/min条件下离心10 min后收集沉淀，并用40%三氯乙酸重复洗涤沉淀3次。最终将沉淀用1 mL 3% SDS溶液重溶，后续检测步骤与游离巯基测定一致，按公式（3）计算。二硫键含量由总巯基含量减去游离巯基含量后再除以2计算得到，所有结果均以每克蛋白质中巯基的物质的量计，单位为nmol·g⁻¹。公式（4）计算：

\mathrm{T}\mathrm{o}\mathrm{t}\mathrm{a}\mathrm{l}SH(\mathrm{n}\mathrm{m}\mathrm{o}\mathrm{l}·g^{-\mathrm{1}})=\mathrm{73.53}\times A_{\mathrm{412}}\times \frac{D}{C}（3）

式中：A₄₁₂：412nm波长处校正后的净吸光度，D：稀释倍数，C：蛋白浓度mg·mL⁻¹

DSB(\mathrm{n}\mathrm{m}\mathrm{o}\mathrm{l}\cdot \mathrm{m}{\mathrm{g}}^{-\mathrm{1}})=\frac{\mathrm{T}\mathrm{o}\mathrm{t}\mathrm{a}\mathrm{l}SH-\mathrm{F}\mathrm{r}\mathrm{e}\mathrm{e}SH}{\mathrm{2}}（4）

式中：DSB：二硫键含量，Total SH：总巯基含量，Free SH：游离巯基含量

1.2.5 溶解度的测定

参照Wang等^[27]的方法，并结合本研究实际需求稍作调整。将牦牛乳蛋白样品与20 mmol·L⁻¹磷酸盐缓冲液（含0.6 mol·L⁻¹ NaCl，pH 6.0）充分混合，调节样品蛋白质浓度至2 mg·mL⁻¹，随后在5 000×g条件下离心10 min，收集上清液备用。通过考马斯亮蓝法分别检测原始溶液和离心上清液的蛋白浓度，以两者比值表征蛋白溶解度。其中，溶解度按照公式（5）计算：

\mathrm{溶解}\mathrm{度}=\frac{\mathrm{上清}\mathrm{液蛋}\mathrm{白浓}\mathrm{度}}{\mathrm{原溶}\mathrm{液蛋}\mathrm{白浓}\mathrm{度}}\times \mathrm{100}\mathrm{\%}（5）

1.2.6 表面疏水性的测定

本试验参照Chelh等^[28]的方法，并结合本研究实际需求稍作调整。将牦牛乳蛋白溶液用含0.6 mol·L^-¹ KCl的20 mmol·L⁻¹磷酸盐缓冲液（pH 6.0）稀释至1 mg·mL⁻¹，吸取1 mL该稀释液与80 µL 1 mg·mL⁻¹溴酚蓝溶液混匀，室温条件下搅拌10 min后，于7 000 r/min转速下离心15 min。收集离心后的上清液，采用相同组分的磷酸盐缓冲液对其进行10倍稀释，随后在595 nm波长下测定吸光度值。试验设置空白对照组：采用1 mL磷酸盐缓冲液（含0.6 mol·L⁻¹ KCl，pH 6.0）与80 µL溴酚蓝溶液混合，经相同离心处理后作为空白基准。所有操作均保持缓冲体系pH稳定在6.0。表面疏水性按公式（6）计算：

\mathrm{表面}\mathrm{疏水}\mathrm{性}(\mathrm{\mu }\mathrm{g}·\mathrm{m}{\mathrm{g}}^{-\mathrm{1}})=\mathrm{80}\mathrm{\mu }\mathrm{g}\times \frac{A_{\mathrm{空白}}-A_{\mathrm{样品}}}{A_{\mathrm{空白}}}（6）

1.2.7 粒径和Zeta电位的测定

参照范丽丽等^[29]的方法，结合本研究试验条件稍作修改。将不同处理组的牦牛乳样品用蒸馏水进行梯度稀释，使样品中蛋白质的最终浓度维持在0.3 ~ 0.6 mg·mL⁻¹之间。采用纳米激光粒度仪对样品中蛋白质的平均粒径及Zeta电位进行检测，为确保试验数据的稳定性与准确性，每组检测均重复操作3次。

1.2.8 二聚酪氨酸的测定

参考Xian等^[30]的方法，使用pH 6.0的磷酸盐缓冲液（其中含有2 mmol·mL⁻¹的KCl）将乳样品稀释，调节乳蛋白浓度至1 mg·mL⁻¹左右，使用荧光分光光度计测定样品中二聚酪氨酸水平，检测参数设置如下：激发波长325 nm、发射波长420 nm、狭缝宽度10 nm。二聚酪氨酸含量以每毫克蛋白质对应的吸光度值表示。

1.2.9 羟自由基氧化后的牦牛乳蛋白质组学试验

(1) 蛋白提取：从-80 ℃超低温冰箱中取出样品，将适量样品加入4倍体积的粉末裂解缓冲液（8 M尿素，1%蛋白酶抑制剂）中并超声处理，功率为300 W，超声3 s停5 s，总时长10 min。4 ℃，12 000 r/min离心10 min，除去细胞碎片，将上清液转移至新的离心管中，利用BCA试剂盒进行蛋白浓度测定。

(2) 胰酶酶解：取等量样品蛋白质，经酶解处理后，用相应裂解液将反应体系总体积调节至一致。随后缓慢加入三氯乙酸（TCA），使其终浓度达到20%，用涡旋振荡器充分混匀后，4 ℃条件下静置沉淀4 h。沉淀完成后，以4 500 ×g的离心力离心5 min，小心弃去上清液；沉淀用预冷丙酮反复洗涤2 ~ 3次，以去除残留杂质及TCA。洗涤后的沉淀置于通风处自然干燥，向干燥沉淀中加入终浓度为200 mM的三羟甲基氨基甲烷-乙腈缓冲液（TEAB），通过超声破碎方式使沉淀充分分散。按胰蛋白酶与样品蛋白质1:50（质量比）的比例加入胰蛋白酶，混匀后4 ℃过夜酶解。酶解结束后，向体系中加入二硫苏糖醇（DTT），使其终浓度为5 mM，56 ℃水浴加热30 min以实现蛋白质的还原反应。还原完成后，加入碘乙酰胺（IAM）至体系终浓度11 mM，室温、避光条件下温育15 min，完成蛋白质的烷基化处理^[31,32]。

(3) 液相色谱-质谱联用分析：将1 μg肽段样品溶解于流动相A中，以完成样品复溶处理。其中，流动相A配制为含0.1%甲酸与2%乙腈的水溶液，流动相B则为含0.1%甲酸与90%乙腈的水溶液，两种流动相协同用于肽段的液相色谱分离。液相色谱梯度洗脱参数设定如下：洗脱时间0 ~ 26 min期间，流动相B的体积分数由9%线性提升至25%；26 ~ 34 min期间，流动相B体积分数进一步由25%梯度升至35%；34 ~ 37 min期间，流动相B体积分数快速升至80%；37 ~ 40 min期间，维持80%的流动相B进行洗脱，全程洗脱流速稳定控制在500 nL/min。经液相色谱分离后的肽段样品，立即进入质谱仪进行后续检测分析。质谱检测参数设置如下：离子源电压调节为2.2 kV，补偿电压（CV）分别设定为-45 V与-70 V；一级质谱扫描范围设定为400 ~ 1 500 m/z，扫描分辨率调整为60 000；二级质谱扫描起始质荷比固定为100 m/z，扫描分辨率设置为15 000，且TurboTMT功能设置为关闭状态（Off），以确保质谱检测的准确性与可靠性。

1.3 数据处理

数据源自每个独立牧区采集的牛乳样本（N=5），这些样本经不同浓度的羟自由基处理。通过计算相同浓度下技术重复的平均值，获得每个浓度对应的5个独立数据。数据通过Excel 2016整理，以均值±标准差（N=5）形式呈现。试验数据采用SPSS 22.0软件进行单因素方差分析及邓肯显著性检验，其中P < 0.05视为具有统计学意义。比较图由Origin 8.5绘制。4D非标记定量蛋白质组学数据分析是基于质谱Raw文件，构建牦牛特异性蛋白数据库并通过DIA-NN进行数据库检索，经MaxQuant、Perseus完成肽段和蛋白水平质控及蛋白定量与重复性分析，利用Metascape和R语言包开展鉴定蛋白的GO、KEGG、COG/KOG功能注释，以P < 0.05、FC > 1.5为上调阈值、FC < 1为下调阈值，计算差异倍数与P 值并筛选差异蛋白，绘制柱状图、火山图等差异统计图，对差异蛋白进行GO二级、COG/KOG、KEGG通路分类统计，采用费希尔精确检验完成GO、KEGG富集分析，对比多试验组富集结果分析差异蛋白功能关联，并基于STRING数据库构建PPI网络筛选关键调控蛋白。

2 结果与分析

2.1 氧化程度分析

在蛋白质氧化过程中，羰基的产生是最明显的变化之一，通常被用作衡量氧化程度的核心指标^[33]。如图1（A）所示，羟自由基氧化体系中，羰基含量随H₂O₂浓度升高而增加，当H₂O₂浓度从0 mmol·L⁻¹升至10 mmol·L⁻¹时，牦牛乳蛋白的羰基含量显著增加（P < 0.05），这可能是由于-OH直接攻击氨基酸侧链基团，生成羰基衍生物^[34]。由图1（B）可知，处理组牦牛乳蛋白的总巯基含量与对照组相比显著下降（P < 0.05），且随着H₂O₂浓度的增加，总巯基含量呈现出先下降后上升的趋势，但差异不显著。原因可能是在低浓度H₂O₂处理下，H₂O₂与总巯基直接反应，导致总巯基含量显著降低。随着浓度增加，总巯基含量回升，可能是H₂O₂通过诱导抗氧化防御机制或形成稳定的加合物，从而减少总巯基的进一步消耗^[35]。游离巯基含量如图1（C）所示，所有处理组的游离巯基含量均显著低于对照组（P < 0.05），这表明 -OH 在强氧化作用下能够显著消耗游离巯基并促进其重排形成二硫键^[36]。与此同时，二硫键的含量随H₂O₂浓度的增加呈现出先下降后上升的变化趋势（图1（D））。游离巯基含量减少的主要原因是氧化诱导游离巯基形成分子内/分子间二硫键，与二硫键含量的变化趋势相吻合。

2.2 羟自由基氧化对牦牛乳蛋白溶解度的影响

蛋白质的可溶性与蛋白质的功能特性密切相关^[37]。由图2可知，随着H₂O₂浓度的增加，牦牛乳蛋白的溶解度呈现出先上升后下降的趋势。在低浓度H₂O₂（0 ~ 3 mmol·L⁻¹）阶段，溶解度升高可能是因为游离巯基被氧化形成分子内二硫键，引起蛋白质部分展开，暴露出更多亲水性基团（如羧基、氨基），增强水合作用；而在高浓度H₂O₂（5 ~ 10 mmol·L⁻¹）阶段，溶解度下降可能是因为过度氧化导致氨基酸侧链（如赖氨酸、精氨酸）生成羰基衍生物，增强蛋白质分子刚性，难以与水分子有效结合^[38]，这与羰基含量变化现象一致。

2.3 羟自由基氧化对牦牛乳蛋白表面疏水性的影响

蛋白质的疏水作用力是其空间构象稳定的核心驱动力，其反映的是蛋白质中暴露的疏水氨基酸残基含量，与蛋白质凝胶、乳化和起泡性等功能特性密切相关^[39]。如图3所示，随着H₂O₂浓度的增加，牦牛乳蛋白的表面疏水性整体出现上升趋势。这可能是 -OH促使游离巯基转化为二硫键，导致亲水性巯基数量减少，二硫键的疏水性强于巯基，其形成会降低蛋白质表面的亲水性。此外，氧化作用引发蛋白质构象改变，原本包埋于分子内部的疏水基团暴露于表面，导致疏水性增强。

2.4 羟自由基氧化对牦牛乳蛋白粒径和Zeta电位的影响

蛋白质聚集程度通常以其平均粒径作为表征指标，平均粒径的变化也能反映蛋白质空间构象的改变^[40]。在较低的H₂O₂浓度下，蛋白质的粒径与对照组相比并无显著差异；然而在较高浓度（≥5 mmol·L^-1）条件下，蛋白质粒径显著增大（P < 0.05）。研究表明，高浓度H₂O₂诱导的氧化可能通过增强疏水相互作用来促进蛋白质分子间的缔合，形成更松散的大尺寸聚集体^[41]。Zeta电位是描述胶体体系表面电荷密度及双电层性质的关键参数。当Zeta电位绝对值较低时，体系内蛋白质分子表面的电荷相对较少，导致体系稳定性下降，分子间更易靠近并发生聚集甚至沉淀；反之，Zeta 电位绝对值较高时，体系内蛋白质分子表面的电荷相对较多，静电斥力增强，体系稳定性提升，分子间不易发生聚集^[42]。在本研究中，Zeta电位绝对值随H₂O₂浓度的增加而呈上升趋势[图4（B）]，尤其在5 mmol·L⁻¹ H₂O₂处理组中变化最为显著（P < 0.05）。这表明在高浓度氧化条件下，牦牛乳蛋白部分发生变性，分子结构去折叠展开，疏水基团被暴露出来。它们之间通过疏水相互作用互相靠近。在静电相互作用和疏水相互作用下，展开的多肽链间和暴露出来的疏水基团间很容易在这两种作用力的共同作用下形成聚集体。带电氨基酸在聚集体表面重新排布^[43]，导致其聚集程度增加和稳定性提高。综合粒径与Zeta电位的变化，均说明高浓度氧化促使蛋白质发生交联与聚集，同时改变其表面电荷分布，进而影响其功能性质。

2.5 羟自由基氧化对牦牛乳蛋白二聚酪氨酸含量的影响

酪氨酸经自由基、脂质过氧化物等氧化可转化为相对稳定的二聚酪氨酸，导致广泛的蛋白间和蛋白内的交联。如图5所示，在H₂O₂浓度为1 ~ 5 mmol·L⁻¹时，二聚酪氨酸含量下降可能与羟自由基氧化下蛋白质发生聚集、交联，导致酪氨酸残基包埋于聚集体内，阻碍其二聚化荧光检测有关。但当浓度为10 mmol·L⁻¹时，二聚酪氨酸含量显著下降（P < 0.05），这可能是高浓度的氧化导致 -OH进一步攻击二聚酪氨酸中的芳香环或交联键，使其氧化分解为单酪氨酸或小分子片段（如醌类、醛类）^[44]。

2.6 羟自由基氧化后牦牛乳蛋白质组学分析

2.6.1 蛋白质的鉴定和定量

在对数据进行过滤处理后，图6（A）展示了最终获得的肽段和蛋白质鉴定结果。分别为Identified peptides（鉴定肽段数）、Unique peptides（鉴定unique肽段数）、Identified proteins（鉴定蛋白数）以及Comparable proteins（可定量比较的蛋白数）：鉴定到的肽段总数为4 789条，unique肽段数为4 645条，鉴定到的蛋白质总数为1 351种，其中具有可比性的蛋白质数量为1 217种，为从分子层面阐释氧化损伤机制提供了系统依据。图6（B）表明，蛋白质主要由1 ~ 2个肽段组成，肽段长度分布和数量分布均符合质控标准。样本点在图中的分布情况能够反映各组样本的重复性，理想情况下，同一组内的样本点应该紧密聚集。图6（C）显示，被鉴定出的肽段长度主要集中在7 ~ 20个氨基酸之间。这一范围恰好与酶切后肽段的常规长度相吻合，且与质谱仪器在该范围内对肽段的检测灵敏度最高的区间相符。如图6（D）、（E）、（F）所示，各组样本在相关性和重复性方面均表现出色，整体数据质量良好。

2.6.2 差异蛋白的筛选

为了研究不同浓度H₂O₂对牦牛乳蛋白功能影响的差异性，对定量分析后的样本进行了差异蛋白分析。将蛋白在两组样本中的相对定量值的均值之比作为差异倍数（Fold Change，FC），P < 0.05，FC > 1.5作为显著上调的变化阈值；把P < 0.05，FC < -1作为显著下调的变化阈值。基于先前的数据整理和设定的阈值，统计了各组间的差异蛋白，并利用柱状图直观呈现了不同组别间差异蛋白的分布。如图7（A）所示，对照组与5 mmol·L⁻¹ H₂O₂处理组之间的蛋白功能差异最为显著，其中183种蛋白显著下调，而276种蛋白显著上调；对照组与1 mmol·L⁻¹ H₂O₂处理组之间的蛋白功能差异最小，分别有237种和292种蛋白表现显著下调和上调。在图7（B-F）差异蛋白火山图中，横轴为比较组差异表达变化Ratio值经过Log2转换后的值；纵轴为统计检验P value经过-Log10转换后的值。红色点代表显著上调的差异蛋白，蓝色点代表显著下调的差异蛋白，而灰色点表示无显著差异。此外，图中还特别标注了上调和下调中各前5位（按Log2 Ratio绝对值大小排序）的差异蛋白名称。在0.5 mmol·L⁻¹ H₂O₂组中，乳铁蛋白（LF）和κ-酪蛋白（CSN3）表达显著上调，其中乳铁蛋白具有抗菌、抗炎及免疫调节功能，κ-酪蛋白则维持酪蛋白胶束稳定性、改善蛋白溶解性与结构完整性。两者的上调与氧化初期防御机制激活相关，同时解释了该组别中巯基含量开始下降但溶解度仍保持较高的现象。在1 mmol·L⁻¹ H₂O₂组中，β-乳球蛋白（BLG）和α-乳白蛋白（LALBA）表达上调，这两种蛋白与乳清蛋白的功能特性密切相关，其中β-乳球蛋白可结合疏水性小分子、维持乳清蛋白结构与乳化特性，α-乳白蛋白则能调节蛋白折叠与胶体稳定性，参与乳清蛋白功能特性调控。上述蛋白变化与表面疏水性开始增加、但粒径变化不显著的表现一致。3 mmol·L⁻¹ H₂O₂组中，血清白蛋白（ALB）和免疫球蛋白（IG）家族蛋白显著下调，前者负责维持胶体稳定、结合转运及抗氧化保护，后者作为牛乳核心免疫活性蛋白，参与机体防御与结构稳定。这两种蛋白的下调表明氧化损伤加剧、蛋白功能受损，这与氧化程度加深的趋势相符，也解释了该组中羰基含量显著升高、溶解度开始下降的现象。5 mmol·L⁻¹ H₂O₂组中，酪蛋白家族（CSN1S1，CSN2）和乳过氧化物酶（LPO）显著下调，酪蛋白是牛乳的主要结构蛋白，决定体系稳定性、溶解性与胶束结构；而乳过氧化物酶具有抗氧化、抑菌及保护蛋白结构的功能。它们下调直接导致蛋白结构崩溃与抗氧化防御失效，这与高浓度氧化引发的蛋白聚集和功能丧失密切相关，也解释了该组粒径显著增大、二硫键含量异常的原因。10 mmol·L⁻¹ H₂O₂组中，分子伴侣（HSP）家族蛋白和白酶体亚基（PSMB）表达异常。分子伴侣辅助蛋白正确折叠，减少错误聚集与氧化损伤；蛋白酶体负责识别并降解受损蛋白。二者的异常表达表明蛋白修复与降解系统失衡，损伤无法及时纠正，反映了蛋白降解系统的激活，这与该组别中二聚酪氨酸含量显著下降和抗氧化能力急剧降低的表现完全一致。

2.6.3 差异蛋白基因本体分析

经过筛选差异蛋白，发现不同浓度H₂O₂处理后，牦牛乳蛋白的功能受到了影响。为更直观地揭示差异蛋白对生物学功能的具体作用，本研究对引发功能改变的差异蛋白开展了GO（Gene Ontology）及COG/KOG（Clusters of Orthologous Groups/Eukaryotic Orthologous Groups）功能注释与分类分析，其中GO功能注释包含生物过程（Biological Process，蓝色）、细胞组分（Cellular Component，黄色）和分子功能（Molecular Function，绿色）3个本体类别；COG/KOG功能注释则将差异蛋白划分为四大类别，红色代表细胞过程与信号（cellular processes and signaling），绿色代表信息存储与加工（information storage and processing），蓝色代表代谢（metabolism），黄色代表特征不明确 poorly characterized（poorly characterized），并分别统计了各一级GO条目及COG/KOG功能分类下的差异蛋白数量。由图8结果可见，各组样本中的差异蛋白主要富集于参与生物过程调节（regulation of biological process）、有机物的代谢过程（organic substance metabolic process）、初级代谢过程（primary metabolic process）、氮复合代谢过程（nitrogen compound metabolic process）、细胞代谢过程（cellular metabolic process）、解剖结构发育（anatomical structure development）、多细胞生物的发育（multicellular organism development）、细胞对刺激的反应（cellular response to stimulus）、细胞成分的组织或生物发生（cellular component organization or biogenesis）、生物质量调节（regulation of biological quality）、应激反应（response to stress）、细胞通讯（cell communication）、囊泡介导的运输（vesicle-mediated transport）、细胞发育过程（cellular developmental process）、信号转导（signal transduction）等过程。

2.6.4 差异蛋白通路富集分析

为深入解析各组间差异表达蛋白质的功能特征，本研究系统开展了KEGG（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes）通路富集分析。研究重点考察差异蛋白在特定通路中的显著富集趋势，并着重展示显著富集的KEGG通路及其关联蛋白。圈图右侧为富集得到的KEGG通路，与之相连的为各通路中的差异表达蛋白，蛋白按Log₂FC值由高到低排序，可清晰地展示各通路内差异蛋白的构成，直观揭示其在重要生物学通路中的分布特征。通过两种可视化分析结果的结合，可明确差异蛋白的功能富集特征及其在关键生物学通路中的具体作用，为后续功能机制研究提供重要线索与方向。0.5 mmol·L⁻¹ H₂O₂组：该组呈现轻度氧化特征，主要表现为抗氧化防御系统的早期激活。精氨酸和脯氨酸代谢通路（map00330）显著上调（P < 0.05，富集倍数1.6），其中吡咯啉-5-羧酸还原酶（PYCR）和精氨酸琥珀酸合酶（ASS）表达增加2.1 ~ 3.3倍，这两种酶在脯氨酸生物合成和抗氧化中起关键作用。N－聚糖生物合成通路（map00510）同步上调，糖基转移酶ALG12和ST6GAL1表达升高，提示蛋白质可能通过糖基化修饰增强稳定性。与此同时，钙信号通路（map04020）和神经活性配体－受体相互作用通路（map04080）显著下调（P < 0.05，富集倍数1.4），其中钙调蛋白（CALM）和多种G蛋白偶联受体表达降低，表明低浓度氧化已开始影响细胞信号转导。1 mmol·L⁻¹ H₂O₂组：此浓度下氧化应激响应更为显著。内质网中的蛋白质加工通路（map04141）显著上调（P < 0.05，富集倍数1.12），分子伴侣HSPA5和PDI表达量分别增加4.2倍和3.8倍，印证了氧化环境下内质网应激的激活和二硫键重排的增强。氨基酰基tRNA生物合成通路（map00970）同步上调，特别是酪氨酸-tRNA合成酶（YARS）和精氨酸-tRNA合成酶（RARS）表达显著增加，反映了细胞试图维持翻译准确性的努力。值得注意的是，PI3K-Akt信号通路（map04151）（P < 0.05，富集倍数0.91）和cGMP-PKG信号通路（map04022）显著下调（P < 0.05，富集倍数1.25），AKT3和PRKG1表达降低，提示氧化应激已开始影响细胞增殖和生存信号。3 mmol·L⁻¹ H₂O₂组：中等浓度氧化导致代谢重编程显著。戊糖和葡糖醛酸盐相互转化通路（map00040）上调，UDP-葡萄糖脱氢酶（UGDH）和β-葡萄糖醛酸酶（GUSB）表达增加，表明细胞试图通过戊糖磷酸途径提供NADPH以应对氧化应激。药物代谢-细胞色素P450通路（map00982）显著下调（P < 0.05，富集倍数1.4），CYP2J2和CYP4F2表达降低40% ~ 60%，反映氧化损伤对代谢酶活性的抑制。NF-κB信号通路（map04064）和磷脂酶D信号通路（map04072）也明显下调（P < 0.05，富集倍数1.32），REL和PLD2表达减少，表明炎症相关信号通路受到抑制。5 mmol·L⁻¹ H₂O₂组：此浓度下氧化损伤最为严重，导致蛋白严重聚集，粒径显著增大，即使Zeta电位绝对值升高增强了静电斥力，也无法阻止蛋白分子间的疏水相互作用，最终导致蛋白功能丧失。自然杀伤细胞介导的细胞毒性通路（map04650）显著下调（P < 0.05，富集倍数1.54），穿孔素（PRF1）和颗粒酶（GZMB）表达降低，提示免疫识别功能受损。B细胞受体信号通路（map04662）同样下调，CD79和BLNK表达减少，反映适应性免疫响应受到抑制。补体和凝血级联通路（map04610）中C3和凝血因子F2表达下降，表明天然免疫机制受损。与此同时，细胞自噬相关蛋白LC3和p62表达上调，提示细胞试图通过自噬清除氧化损伤蛋白。10 mmol·L⁻¹ H₂O₂组：高浓度氧化导致细胞防御系统全面激活。吞噬体通路（map04145）显著上调（P < 0.05，富集倍数1.33），Rab5和LAMP1表达增加3.5 ~ 4.2倍，表明细胞加强了对氧化蛋白的清除能力。Apelin信号通路（map04371）明显下调（P < 0.05，富集倍数1.4），APJ受体表达降低，提示血管调节功能受到影响。内质网应激相关蛋白CHOP和ATF4表达显著上调，表明内质网功能已严重受损。值得注意的是，泛素-蛋白酶体系统中多个组分表达上调，包括E3泛素连接酶（TRAF6）和蛋白酶体亚基（PSMB），反映了细胞通过泛素化途径降解氧化损伤蛋白的尝试。这些精细的通路分析结果与前期氧化指标高度吻合：早期氧化（0.5 ~ 1 mmol·L⁻¹ H₂O₂）主要引发防御性通路激活和信号通路调节；中等氧化（3 mmol·L⁻¹ H₂O₂）导致代谢重编程和酶活性抑制；而重度氧化（5 ~ 10 mmol·L⁻¹ H₂O₂）则引起免疫相关通路抑制和细胞清理机制全面激活，与氧化程度指标（羰基含量、巯基损失、溶解度下降等）呈现良好的剂量－效应关系。

2.6.5 KEGG富集通路图

基于富集分析的结果，选取了部分显著富集的KEGG通路，通过图10进行了详细的可视化展示。在通路图中，采用红色填充标记差异上调蛋白，蓝色填充标记差异下调蛋白，以直观呈现蛋白表达水平的变化特征。通过分析发现，经过不同浓度H₂O₂氧化修饰后的牦牛乳蛋白，其代谢途径以及蛋白的消化和吸收功能均受到显著影响。0.5 mmol·L⁻¹ H₂O₂组与Control组相比较会上调精氨酸和脯氨酸代谢（map00330 Arginine and proline metabolism）、N－聚糖生物合成、各种类型的N-聚糖的生物合成等8种通路，下调造血细胞系、钙信号通路（map04020 Calcium signaling pathway）、神经活性配体-受体相互作用（map04080 Neuroactive ligand-receptor interaction）等17种通路。1 mmol·L⁻¹ H₂O₂组与Control组相比较会上调精氨酸和脯氨酸代谢、内质网中的蛋白质加工（map04141 Protein processing in endoplasmic reticulum）、氨基酰基tRNA生物合成（map00970 Aminoacyl-tRNA biosynthesis）等22种通路，下调PI3K-Akt信号通路（map04151 PI3K-Akt signaling pathway）、cGMP-PKG信号通路（map04022 cGMP-PKG signaling pathway）、钙信号通路等10种通路。3 mmol·L⁻¹ H₂O₂组与Control组相比较会上调戊糖和葡糖醛酸盐的相互转化（map00040 Pentose and glucuronate interconversions）、精氨酸和脯氨酸代谢、内质网中的蛋白质加工等11种通路，下调药物代谢-细胞色素P450（map00982 Drug metabolism - cytochrome P450）、NF-kappa B信号通路（map04064 NF-kappa B signaling pathway）、磷脂酶D信号通路（map04072 Phospholipase D signaling pathway）等16种通路。5 mmol·L⁻¹ H₂O₂组与Control组相比较会上调精氨酸和脯氨酸代谢、戊糖和葡糖醛酸盐的相互转化、N-聚糖生物合成、各种类型的N-聚糖的生物合成等10种通路，下调自然杀伤细胞介导的细胞毒性（map04650 Natural killer cell mediated cytotoxicity）、B细胞受体信号通路（map04662 B cell receptor signaling pathway），表明免疫功能相关蛋白受到显著影响，这与该组别中蛋白聚集严重、功能显著丧失的表现完全一致。补体和凝血级联下调进一步证实了免疫功能的损伤（map04610 Complement and coagulation cascades）等9种通路。10 mmol·L⁻¹ H₂O₂组与Control组相比较会上调精氨酸和脯氨酸代谢、N－聚糖生物合成、各种类型的N-聚糖的生物合成、吞噬体（map04145 Phagosome）等10种通路，表明细胞试图通过大分子降解机制清理严重氧化的蛋白质聚合体，这直接解释了该组别中二聚酪氨酸含量显著下降的现象。下调Apelin信号通路（map04371 Apelin signaling pathway）、补体和凝血级联、磷脂酶D信号通路等14种通路。Apelin信号通路的下调则反映了血管调节功能的障碍，表明氧化损伤已经影响到细胞的正常信号转导。蛋白质作为细胞功能的核心分子，其结构和功能的改变会直接影响细胞代谢和生理活动^[45]。在本研究中，1 mmol·L⁻¹ H₂O₂组上调了内质网中的蛋白质加工（map04141）和氨基酰基tRNA生物合成（map00970），这可能是由于氧化应激通过调控代谢通路和蛋白质加工过程来影响乳蛋白的功能。各组精氨酸和脯氨酸代谢通路在氧化应激条件下被上调，精氨酸代谢在心血管疾病中具有重要作用，能够调节血管张力和炎症反应^[46]。此外，脯氨酸可以作为信号发挥作用，调节基因表达和某些代谢过程，与不同细胞中的各种代谢途径协调，并整合了氧化还原和能量平衡、生长和防御调节^[47]。部分氧化组同样上调了N－聚糖生物合成通路，N -聚糖生物合成通过糖基化修饰调控蛋白质功能、细胞行为及代谢网络，在农业领域有重要意义。姚文豪等人^[48]研究发现在低温贮藏的玉米种子中，可能是由于N－聚糖生物合成通路上调，通过调节应激反应和代谢通路增强了种子活力。1 mmol·L⁻¹ H₂O₂处理能够激活有益的应激防御通路，在分子层面提升蛋白的折叠能力和稳态维持，是潜在可用于改善蛋白功能特性的较优条件；而高于5 mmol·L⁻¹ H₂O₂的浓度则会导致蛋白结构的不可逆损伤和功能的显著劣变，在实际加工中应予以避免。

3 讨论与结论

通过建立芬顿氧化体系模拟羟自由基氧化对牦牛乳蛋白中蛋白质结构、功能特性的影响，并进行蛋白组学分析，结果发现：随着H₂O₂浓度从0 mmol·L⁻¹增加到10 mmol·L⁻¹，牦牛乳蛋白氧化损伤加剧，牦牛乳蛋白溶解度下降，伴随疏水性和粒径增加，这是蛋白质变性聚集的典型特征，对牦牛乳质量和功能有重要影响。但在低浓度H₂O₂（≤ 1 mmol·L⁻¹）诱导氧化牦牛乳蛋白时，蛋白质溶解度略有提高，这与该组内质网蛋白质加工通路上调、分子伴侣HSPA5表达增加，促进蛋白正确折叠，暴露出更多亲水性基团密切相关。同时，β-乳球蛋白和α-乳白蛋白表达稳定上调，有效维持了乳蛋白胶体结构与界面特性，使得表面疏水性未显著上升，粒径与Zeta电位变化较小，蛋白聚集程度较低。牦牛乳蛋白中乳铁蛋白、免疫球蛋白等抗氧化蛋白含量较高，使其在低浓度H₂O₂下的氧化防御能力强于普通牛乳，这是1 mmol·L⁻¹ H₂O₂组蛋白功能差异较小的重要原因。从蛋白质组学结果来看，1 mmol·L⁻¹ H₂O₂处理组上调了22条通路，包括内质网中的蛋白质加工（map04141）、氨基酰基tRNA生物合成（map00970）等，这些通路与蛋白质正确折叠、翻译准确性维持和应激响应密切相关，表明该浓度可激发细胞修复与防御机制，有助于维持蛋白功能完整性。高浓度氧化（5 ~ 10 mmol·L⁻¹ H₂O₂）导致牦牛乳蛋白发生显著结构损伤和功能劣变，羰基含量大幅上升，巯基严重损失，二硫键异常交联，溶解度显著下降，表面疏水性急剧增加，蛋白发生严重聚集（粒径增大），即使Zeta电位绝对值升高增强了静电斥力，也无法阻止蛋白分子间的疏水相互作用，最终导致蛋白功能丧失但仍无法阻止聚集；二聚酪氨酸含量下降提示芳香氨基酸氧化降解；同时，5 mmol·L⁻¹ 和10 mmol·L⁻¹ 组分别出现183和207种蛋白下调，涉及免疫通路（如自然杀伤细胞介导的细胞毒性、B细胞受体信号通路）、代谢通路（药物代谢-细胞色素P450）和信号转导通路（如Apelin信号通路、磷脂酶D信号通路）的广泛抑制。本研究说明，1 mmol·L⁻¹ H₂O₂为牦牛乳蛋白可控氧化的最适浓度，该条件可有效激活相关防御通路，并改善牦牛乳蛋白部分功能特性；而当H₂O₂浓度 ≥5 mmol·L⁻¹时，会显著诱导牦牛乳蛋白发生不可逆氧化损伤，在实际生产加工过程中应予以规避。本研究究为牦牛乳蛋白氧化调控及高值化利用提供分子水平的理论支撑与科学参考，但仅在体外芬顿体系中探究了牦牛乳蛋白的氧化规律，后续可结合牦牛乳实际加工工艺（如热加工、冷藏），研究复合氧化条件下的蛋白变化，并通过动物实验验证氧化修饰牦牛乳蛋白的体内消化特性与生物活性。

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基金资助

中国农业大学支援西藏农牧学院专项资金项目(2024CT083)

国家自然科学基金项目(32160561)