砂生槐实生无菌苗获得方法研究

A Study of the Method of Obtaining Solid Sterile Seedlings of Sophora moorcroftiana

摘要

为建立砂生槐外植体消毒、组织培养快繁体系，本研究以砂生槐成熟种子为外植体，通过分析氯化汞（HgCl₂）和次氯酸钠（NaClO）两种常用消毒剂在不同浓度不同时间对砂生槐种子外植体萌发指数、污染率的影响，得到砂生槐实生无菌苗的优化方案。结果显示，氯化汞（HgCl₂）处理组的表现最优，发芽率为52.6%、发芽势9.20%、污染率为20%，但种苗长势一般；次氯酸钠（NaClO）处理组中污染率较高，但发芽率、发芽指数、发芽势均高于氯化汞处理组。结果表明，氯化汞（HgCl₂）溶液对砂生槐种子的萌发具有抑制作用，次氯酸钠（NaClO）溶液的腐蚀作用则促进砂生槐种子的萌发。

Abstract

To establish a disinfection and tissue culture rapid propagation system for explants of Sophora moorcroftiana, this study used mature seeds of S. moorcroftiana as explants. By analyzing the effects of two commonly used disinfectants, mercury chloride (HgCl₂) and sodium hypochlorite (NaClO), at different concentrations and times on the germination index and contamination rate of S. moorcroftiana seed explants, an optimized scheme for S. moorcroftiana seedling without bacteria was obtained. The results showed that the mercury chloride (HgCl₂) treatment group performed best, with a germination rate of 52.6%, a germination potential of 9.20%, and a contamination rate of 20%, but the growth of the seedlings was average. The contamination rate was relatively high in the sodium hypochlorite (NaClO) treatment group, but the germination rate, germination index, and germination potential were all higher than those in the mercury chloride treatment group. The results showed that the mercuric chloride (HgCl₂) solution had an inhibitory effect on the germination of S. moorcroftiana seeds, while the corrosive effect of sodium hypochlorite (NaClO) solution promoted the germination of S. moorcroftiana seeds.

关键词

砂生槐 / 消毒剂 / 氯化汞 / 次氯酸钠

Key words

Sophoramoorcroftiana / Disinfectant / Mercuric chloride / Sodium hypochlorite

砂生槐（Sophora moorcroftiana）是西藏特有豆科苦参属多年生观赏矮灌木，因其蓝紫色的花序，又被称为“高原薰衣草”。多分布于西藏米林、林芝、波密、山南及日喀则诸县。砂生槐具有抗旱、耐瘠薄、防风固沙、保持水土等生态学特性，对西藏生态修复和植被建设具有重要价值^[1]，作为藏医常用药材，砂生槐所含生物碱还具有消炎、抗病毒、抗肿瘤、抑菌、杀虫等作用^[2]，但现阶段砂生槐植物资源仍存在开发利用率低、种群破坏严重的问题。

在组织培养过程中，外植体的污染问题一直是制约植株大规模推广应用的重要因素^[3]。外植体污染主要来源于外植体表面及植株内部微生物的入侵，若处理不当，污染微生物会导致组织培养的失败，严重时会使大量外植体死亡。因此，如何有效消除外植体表面的微生物污染，同时确保外植体的生理状态良好，是植物组织培养过程中的重要步骤。消毒是植物组织培养中必不可少的一环，消毒剂的种类、浓度及浸泡时间直接影响消毒效果及外植体的生长发育^[4]。对于同种植物而言，使用不同的消毒剂进行外植体消毒，效果不同，目前HgCl₂^[5]和NaClO^[6]是最常用的消毒剂^[7]，H₂O₂^[8]、氯气^[9]次之。HgCl₂以其杀菌效果好、适用范围广而成为消毒剂的常用选择，但因其具有较强的毒性，对使用浓度和使用时间的掌控至关重要。NaClO由于其温和的氧化性和较低的毒性，逐渐成为植物组织培养中常用的消毒剂，尤其是在对环境要求较为严格的研究中。不同种类的消毒剂在不同植物外植体消毒过程中表现出不同的效果，目前砂生槐外植体的消毒效果尚缺乏系统研究，相关研究多集中在其他植物种类上如蓝莓^[10]、山莨菪^[11]、毛红椿^[12]。

目前，砂生槐多数处于野生状态，有关砂生槐的研究大多集中于引种栽培、播种育苗、病虫害防治及种群分布调查^[13]等方面，而对组织培养方面的研究较少，且对通过组织培养技术如何高效获得砂生槐无菌实生苗更是无相关研究。因此，本研究旨在探索不同消毒剂对砂生槐种子消毒效果及实生无菌苗质量的影响，通过试验探讨不同消毒剂的优劣，寻找出最适宜的消毒方法，旨在提高种子发芽率及种苗质量，降低污染率，提供大量无菌外植体用于组培快繁，为砂生槐在生态恢复和大规模高效无菌培养的应用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

该试验所用材料于2024年10月在西藏农牧大学苗圃基地（E 94°20′40″；N 29°40′24″）植株健康且无病虫害的5 a生砂生槐上采集。采集的种子自然干燥后脱壳，置于4 ℃储存备用。

1.2 试验设计

本研究选用了氯化汞（HgCl₂）和次氯酸钠（NaClO）2种常见消毒剂。通过设置不同的浓度梯度和处理时间，氯化汞：浓度梯度分别为0.1%、0.2%、0.3%（单位：g/L），处理时间分别为5 min、10 min、15 min；次氯酸钠：浓度梯度分别为1%、3%、5%（单位：g/L），处理时间为5 min、10 min、15 min。

1.3 试验方法

选取大小相近、无病虫害的砂生槐种子，用砂纸打磨破除硬实状态，用流动清水冲洗1 h。置于超净工作台上，先将砂生槐种子用75%酒精浸泡30 s消毒，用无菌水反复清洗5次后，在不同消毒处理的容器中浸泡不同的时间。在这期间，将盛有砂生槐种子消毒溶液的容器连续振荡。消毒后，用无菌水浸泡24 d得到的砂生槐种子接种在不添加任何植物激素的pH=5.8的MS基本培养基上，培养条件：组培室温保持23 ℃±2 ℃，光照时间14 h/d，光照强度1 500 ~ 2 000 lx。4 d后开始统计数据。共设置18个处理，每个处理共120粒种子，3次重复，

1.4 数据分析

试验主要通过对污染率、萌发率的统计分析来评估不同消毒方法的效果。数据的统计与分析使用SPSS 19.0软件，采用单因素方差分析（ANOVA）来比较不同处理组之间的差异，选定P < 0.05为显著性标准。

发芽率（%）=（种子发芽数／供试种子总数）×100%；

发芽势（%）=（规定天数内发芽种子总数／供试种子总数）×100%；

发芽指数（GI）=∑（G _t ／D _t ）（式中：D _t 为发芽日数，G _t 为与D _t 相对应的每天发芽种子数）；

种子污染率=（污染种子数/接种种子总数）×100%；

2 结果与分析

2.1 不同HgCl₂浓度及消毒时间对砂生槐种子萌发的影响

用HgCl₂处理的消毒方式如表1所示，其中0.1% HgCl₂消毒5 min砂生槐发芽率、发芽指数、发芽势最高，分别为62.6%、3.85、9.63%，其次为0.2%的HgCl₂消毒5 min。0.3% HgCl₂消毒15 min萌发率为0。0.1% HgCl₂消毒5 min和10 min的发芽率无显著差异，但均显著高于消毒15 min，0.1% HgCl₂消毒5 min的发芽指数及发芽势显著高于消毒时间为10 min、15 min；0.2% HgCl₂消毒10 min、15 min的发芽率、发芽指数、发芽势无显著性差异，均显著低于消毒5 min的发芽率；0.3% HgCl₂消毒5 min的发芽率、发芽指数、发芽势显著高于消毒时间为10 min、15 min，消毒10 min和15 min间的发芽率无显著差异，消毒10 min的发芽指数、发芽势显著高于消毒15 min。0.1%、0.2%、0.3%的HgCl₂消毒5 min的发芽率、发芽指数、发芽势间均具有显著差异性；0.1%的HgCl₂消毒10 min的发芽率、发芽指数、发芽势均显著高于浓度为0.2%、0.3%的HgCl₂，而0.2%、0.3%的HgCl₂消毒间无显著差异；0.1%的HgCl₂消毒15 min的发芽率、发芽指数、发芽势显著高于浓度为0.2%、0.3%的HgCl₂，而0.2%、0.3%的HgCl₂消毒后发芽率、发芽指数、发芽势间无显著差异。由表1可见，HgCl₂溶液对砂生槐种子具有抑制作用，砂生槐种子消毒随HgCl₂浓度增加萌发率、发芽指数、发芽势下降，相同浓度下，随消毒时间增长萌发率下降，但消毒效果越好，综上所述，在0.2%HgCl₂消毒5 min处理下砂生槐发芽率较高为52.6%，是砂生槐的最佳消毒方式。

2.2 不同NaClO浓度及消毒时间对砂生槐种子萌发的影响

表2中分别用（1%、3%、5%）NaClO溶液灭菌5 min、10 min、15 min，共有9种消毒方式，其中5% NaClO溶液消毒10 min砂生槐发芽率、发芽指数最高，分别为92.5%、5.22。1% NaClO溶液消毒5 min和3% NaClO溶液消毒10 min的砂生槐发芽率达到90%；3% NaClO溶液消毒5 min和3%溶液消毒15 min，砂生槐发芽率达87.5%，且消毒15 min发芽势最高，为30%，萌发率较高。1% NaClO溶液消毒5 min的发芽率显著高于消毒10 min、15 min，发芽指数间无显著差异，消毒5 min和15 min的种子发芽势显著高于消毒10 min；3%、5%的NaClO溶液不同消毒时间其发芽率、发芽指数、发芽势间均无显著差异。1%、3%、5%的NaClO溶液消毒5 min的发芽率均无显著差异性；1%的NaClO溶液消毒10 min的发芽率、发芽指数显著低于3%、5%，发芽势间无显著差异；1%、3%、5%的NaClO溶液消毒15 min的发芽率均无显著差异性；由表2可以看出，NaClO对砂生槐种子的萌发具有促进作用，这是因为砂生槐坚硬的种皮抑制萌发，而NaClO的腐蚀作用能削弱种皮，促进萌发。但浓度过大、消毒时间过长的情况下，NaClO也会损伤种胚，严重抑制萌发。综上所述，选取3% NaClO溶液消毒15 min最为合适。

2.3 HgCl₂对砂生槐种子污染率及无菌苗质量的影响

由表3可知，0.1% HgCl₂溶液消毒15 min和0.2% HgCl₂溶液消毒15 min的种子发芽后长势均较弱，0.3% HgCl₂溶液消毒5 min长势较好，0.1% HgCl₂溶液消毒不同时间，种子污染率均存在显著差异；0.2% HgCl₂溶液消毒10 min、15 min的污染率间无显著差异，均显著低于消毒5 min的种子污染率；0.3% HgCl₂溶液消毒5 min和10 min的污染率显著高于消毒15 min。0.1%、0.2%、0.3%的HgCl₂溶液消毒5 min的污染率间均具有显著差异；0.1%的HgCl₂溶液消毒10 min的种子污染率均显著高于浓度为0.2%、0.3%的HgCl₂，而0.2%、0.3%的HgCl₂溶液消毒间无显著差异；0.1%、0.2%、0.3%的HgCl₂溶液消毒15 min的种子污染率间均具有显著差异性。由表3可以看出，砂生槐种子消毒随HgCl₂浓度增加，污染率下降；相同浓度下，随消毒时间增长，消毒效果越好。综上所述，选取0.3% HgCl₂溶液消毒5 min 最为合适，污染率较低为10%，且无菌苗生长质量状况较好。

2.4 NaClO溶液对砂生槐种子污染率及无菌苗质量的影响

由表4可以看出3% NaClO溶液消毒10 min和15 min的种子发芽后无菌苗长势较好，5% NaClO溶液消毒10 min和15 min长势一般，其余消毒时间及浓度的长势均较弱。3% NaClO溶液消毒5 min、10 min的种子污染率间无显著差异，且显著高于消毒15 min；5% NaClO溶液消毒10 min、15 min的种子污染率无显著差异，但显著低于消毒5 min；5% NaClO溶液不同消毒时间种子污染率间均有显著差异。1%的NaClO溶液消毒5 min的污染率显著高于浓度为3%、5%的NaClO溶液；1%的NaClO溶液消毒10 min的污染率显著高于3%、5%的NaClO溶液；1%的NaClO溶液消毒15 min的污染率显著高于3%、5%。综上所述，选取3% NaClO溶液消毒15 min最为合适。

3 讨论与结论

污染是组织培养过程中比较常见的问题，引起污染的原因很多，大部分是由细菌、真菌、酵母菌及放线菌等微生物引起的^[14]，严重的污染会影响组培苗的正常生长。在植物组织培养过程中，对外植体进行消毒处理是确保其健康生长的关键步骤^[15]。有研究表明，通过种子消毒得到无菌苗的过程中，消毒受到诸多因素的影响，如消毒剂种类、浓度、消毒时间、种皮厚度、种子休眠程度等，因此，根据种子自身特性选择合适的消毒方法至关重要^[16]。砂生槐种子由于种皮质地坚硬，导致种子不透水、不透气且萌发受到机械阻碍，造成自然状态下砂生槐种子萌发率低^[17]。在组织培养中，为获得砂生槐种子低污染率且高萌发率的双重效果，在砂纸打磨破除种子硬实的前提下，本研究分析了不同的消毒剂和消毒时间对砂生槐种子消毒和萌发的影响，结果表明HgCl₂对砂生槐发芽率存在抑制现象，低浓度短时间的HgCl₂处理后的砂生槐发芽率均低于NaClO溶液消毒后的萌发率；而NaClO消毒在不同时间、不同浓度下砂生槐发芽率均较高，说明NaClO消毒对砂生槐种子萌发具有促进作用，与谭顺旺等^[11]人对山莨菪种子消毒结论一致，这是因为NaClO溶液具有强氧化性和腐蚀性，能够有效破除种子硬实状态。HgCl₂溶液处理后的种苗长势均一般，可能是其含有的重金属元素造成了种胚受损的现象，抑制了其种子萌发和生长；低浓度短时间的NaClO溶液消毒，会造成种子污染率过高，从而导致种子发芽后的种苗生长状况较差，而污染率较低，种苗生长状态较好。在单因素方差分析试验的基础上，综合考虑染菌率和萌发率，得到砂生槐种子的最佳消毒方式为75%乙醇消毒30 s+3% NaClO消毒15 min，在该消毒方式下，砂生槐种子的萌发率可达87.5%，染菌率最低为10%。通过沙藏层积法^[18]、刺破种皮、硫酸浸泡腐蚀种皮^[19]等方法破除砂生槐硬实状态进行催芽是目前利用率较高的，而NaClO具有腐蚀砂生槐坚硬种皮的作用^[15]，利用NaClO溶液对砂生槐种子进行预处理，砂生槐种子胚根也更容易突破处理后的种皮，萌发率会更高。

消毒方法不仅关乎种子的染菌率，同样对种子的萌发率也具有较大的影响^[20]。消毒剂的选择不仅和种子的染菌率有关，更关系着种子的发芽指标。目前，砂生槐的种子外植体消毒试验还在摸索阶段，该研究以消毒效果和萌发率为依据，获得了砂生槐种子的最佳消毒方法，但砂生槐种皮较厚容易消毒并不彻底，后期可用超声作为一种杀菌手段，将超声处理与消毒剂共同使用以期起到更好的杀菌效果。无菌砂生槐种子于培养基中萌发，得到的无菌苗，不同部位均可作为组培外植体，可获得更多优质砂生槐组织培养的无菌材料，为大规模生产砂生槐优质种苗及砂生槐资源保护奠定基础。

参考文献

[1] 李玉祥.西藏砂生槐的生物学特性及综合利用[J].自然资源,1993(05):75-79.

[2] 赵年寿,纪鹏,魏彦明 等.砂生槐生物碱成分测定,提取工艺及生物活性研究进展[J].天然产物研究与开发,2020,32(09): 1614-1620.

[3] 曲芬霞.田口方法在西藏砂生槐种子组培诱导试验中的应用[J].湖北农业科学,2011,50(16):3.

[4] 杨爽,方江平,唐佳,等.西藏砂生槐丛生芽的诱导[J].吉林农业大学学报,2011,33(4):4.

[5] 陈爽,李叶华,赵冰.两种野生绣球花组培及快繁技术研究[J].种子,2020,39(04):60-63+70.

[6] 李换丽,上官小霞,杨琴莉,等.一种新的组培大豆种子的消毒方法[J].现代农业研究,2024,30(08):109-113.

[7] 欧阳英,刘燕.海南蝴蝶兰种子无菌萌发研究[J].种子,2019,38(08):97-99.

[8] 杨晨星,李晶,穆立蔷.不同消毒方法对组织培养中大岩桐叶片生长状况的影响[J].西北林学院学报,2020,35(4):89-94.

[9] 江涛,李晨曦,陈磊,等.毛竹组织培养中成熟种子消毒方法[J].江苏农业科学,2017,45(04):103-106.

[10] 赵慧颖."优瑞卡"蓝莓外植体组培试验[J].农业工程技术,2024,44(10):45.

[11] 覃顺旺,王跃华,俸世洪,等.不同消毒方法对山莨菪种子消毒及萌发的影响[J].安徽农业科学,2023,51(04):185-188.

[12] 晏家祥,郭晓燕,谭小林,等.不同消毒剂对毛红椿种子的消毒效果及成苗的影响[J].种子,2018,37(10):93-97.

[13] 南吉斌,李耀海,旦增尼玛,等.砂生槐天然种群结构及物种多样性研究[J].高原农业,2021,5(06):592-597.

[14] 祁永琼,许邦丽,李开云,等.植物组织培养中污染的原因分析及控制[J].云南农业科技,2010,38(4):14284-14285.

[15] 张晶华,马亚丽,兰海燕.不同灭菌方法对烟草和拟南芥种子萌发及无菌苗生长的影响[J].新疆农业科学,2016,53(9): 1683-1691.

[16] 李欣瑞,张建波,白史且,等.不同物理方法处理对武陵假俭草种子萌发影响的研究[J].种子,2019,38(10):83-86.

[17] 马志杰.不同处理方式下砂生槐种子萌发及生长规律研究[J].中国农业文摘-农业工程,2021,33(06):34-37.

[18] 赵玉文,郑雨,段少荣,等.不同催芽方法对西藏砂生槐种子发芽的影响[J].高原农业,2018,2(01):66-71.

[19] 安毅鹏,侯潇棐,黄一凡,等.西藏砂生槐种子休眠及解除方法研究[J].高原农业,2020,4(03):244-248.

[20] 郭丽,索素敏,徐明辉.组织培养中不同消毒处理对野生薄皮木种子萌发的影响[J].分子植物育种,2022,20(4):1325-1330.

基金资助

西藏自治区科技计划项目(XZ202401YD0026)

国家自然科学基金(31960304┫。国家重点研发计划┣2023YFD2201100)

林芝市林下科技园项目

林芝市林草局林木良种培育资助