四种提取青稞种子DNA方法的比较研究

Comparative Study of Four Methods for DNA Extraction from Highland Barley Seeds

摘要

为验证项目组自主研发的一种保持种子活力的玉米单粒胚乳DNA提取方法（简称“专利法”）在青稞种子中的适用性，本研究以不同青稞品种为材料，分别采用传统CTAB法、改良CTAB法、碱煮法及专利法提取种子DNA，并通过琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度法对所得DNA的浓度和纯度进行检测。同时，以提取的DNA为模板，进行普通PCR、多重PCR及实时荧光定量PCR检测，扩增了与淀粉合成、抗旱性和抗病性相关的5个基因。结果表明，利用专利法提取的青稞种子DNA浓度较高、纯度良好，在目标基因扩增中表现出优良的扩增效果，完全满足后续分子生物学实验的要求。同时，切除部分胚乳的种子仍可正常萌发与生长，可用于后续相关研究。本研究拓展了专利法在作物种类中的应用范围，并为青稞分子生物学研究提供了一种可保持种子活力的高质量单粒胚乳DNA提取方法。

Abstract

To verify the applicability of a self-developed maize single-seed endosperm DNA extraction method that preserves seed viability (referred to as the "patented method") in barley seeds, this study used different barley varieties as materials. DNA was extracted from the seeds by the traditional CTAB method, the modified CTAB method, the alkaline boiling method, and the patented method, respectively. The concentration and purity of the obtained DNA were detected by agarose gel electrophoresis and ultraviolet spectrophotometry. Furthermore, wiht the extracted DNA as a template, conventional PCR, multiplex PCR, and real-time fluorescent quantitative PCR were performed to amplify five genes related to starch synthesis, drought resistance, and disease resistance. The results showed that the DNA extracted from barley seeds by the patented method had a high concentration and good purity and exhibited excellent amplification efficiency in the target gene amplifications, fully meeting the requirements for subsequent molecular biology experiments. Meanwhile, seeds that had undergone partial endosperm excision could still germinate and grow normally and could be used for subsequent related research. This study expands the application range of the patented method to other crop types and provides a high-quality single-seed endosperm DNA extraction method that preserves seed viability for molecular biology research in barley.

Graphical abstract

关键词

青稞品种 / DNA提取方法 / CTAB法 / 碱煮法

Key words

Highland barley varieties / DNA extraction method / CTAB method / Alkaline boiling method

青稞（Hordeumvulgare var. coeleste ）即裸大麦（Hulless barley），主要种植在我国青藏高原及辐射边缘区，是高海拔地区少数能正常结实成熟的作物之一，是藏族人民的主粮及牲畜饲料的主要来源^[1,2]。随着分子生物学的发展，与其相关的实验技术在青稞优良种质筛选、遗传多样性的研究以及性状改良等方面发挥越来越重要的作用，尤其对不同青稞品种基因资源的挖掘与利用提供新的方法与手段^[3-5]。在利用PCR方法对青稞资源遗传多样性进行分析和其他分子生物学研究时，青稞不同组织基因组DNA的提取方法是决定后续实验能否成功的关键。目前，从植物组织材料中提取DNA的方法通常有碱煮法、CTAB法、改良CTAB法等多种不同的方法^[6-9]，且这些方法均会破坏种子结构。对于不同青稞品种的组织材料，由于其中所含的代谢产物不同，DNA的提取方法也不尽相同。本研究以本课题组发明的一种玉米籽粒DNA提取的专利法^[10]为依托，与传统CTAB法、改良CTAB法和碱煮法分别提取了3种青稞材料的籽粒基因组DNA，并对DNA质量进行了检测，同时利用专利法提取了其他几种青稞材料，以便进一步明确该方法的应用效果，以期找到一种既能保留种子活性又能高质量提取青稞籽粒基因组DNA的方法，从而为进一步开展青稞的分子生物学研究提供技术支持。

1 材料与方法

1.1 材料

以青稞品种藏青2000、5171、拉柳改作为4种DNA提取方法的试验材料。查玉紫、蓝青稞为后期随机挑选的用于验证专利法的试验材料，所有青稞材料由青岛蔚蓝生物集团有限公司搜集提供。

1.2 DNA提取方法

1.2.1 碱煮法快速提取青稞籽粒胚乳DNA

参考周丽娟等^[2]碱煮法稍作修改，向离心管中加入400 μL的1 mol/L NaOH，沸水中水浴10 ~30 min。冷却后，再分别加入200 μL的1 mol/L Tris-HCl（pH=8.0）和TE8.0；10 000 r/min，4 ℃离心15 min，取上清液至新的离心管，4 ℃保存用于后续检测。

1.2.2 传统CTAB法快速提取青稞籽粒胚乳DNA

参考李艺等^[11]的CTAB法提取青稞籽粒胚乳DNA。

1.2.3 改良CTAB快速提取青稞籽粒胚乳DNA

参照熊发前^[12]的CTAB 法并稍作调整，将提取缓冲液配比进行调整（0.1 mol/L Tris-HCl （pH8.0），0.1 mol/L EDTA (pH8.0），0.5 mol/L NaCl，2% CTAB，3% PVP，2% DTT），最后加入-20 ℃预冷的等体积的异丙醇。

1.2.4 一种保持种子活力的方法提取青稞籽粒胚乳DNA

参考郭新梅^[10]方法提取青稞籽粒胚乳DNA。

1.3 检测方法

1.3.1 DNA质量检测

用1%的琼脂糖凝胶电泳检测其质量；再使用超微量分光光度计NanoDrop检测青稞籽粒DNA，分别记录其DNA浓度、A260/A280比值和 A260/A230比值。

1.3.2 普通PCR与多重PCR产物检测

淀粉合成相关基因、抗旱相关基因以及抗病相关的基因的引物信息参见文献^[13-17]，引物由青岛擎科生物有限公司合成。

按照表1的引物信息加入25 μL PCR反应体系^[18]：2×TaqPCR 预混液13 μL，引物混合物（正反向引物各50 μmol/L）1.5 μL，DNA 模板1.5 μL，灭菌水补足25 μL。反应程序为：95 ℃ 3 min，95 ℃ 20 s，58 ℃ 20 s，72 ℃ 45 s（35个循环），72 ℃ 5 min，1%琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物。多重PCR反应体系：在普通PCR的基础上多加入1 ~ 2对的引物，其他成分和用量不变。反应程序与普通PCR相同。

1.3.3 实时荧光定量（qRT-PCR）检测

先取2 μL的DNA原液，再稀释为5倍的浓度梯度，用蓝青稞和查玉紫为样品扩增青稞SSS基因片段。设计特异性引物和SSS-F和SSS-R，作为上、下游引物进行SSS片段的相对定量PCR检测 (以β-Tubulin基因作为内参基因，扩增引物为Tubulin-F和Tubulin-R（表1）。实时荧光定量检测SSS基因扩增^[19]，反应总体系为75 μL：2×SYBR Green Premix荧光结合染料的混合液37.5 μL，模板DNA 3 μL，上、下游引物各1.5 μL，加水至总体积75 μL。扩增反应条件是：98 ℃，3 min；57 ℃，30 s；72 ℃，30 s；40个循环。扩增在Roter-Gene实时荧光定量PCR仪上进行，用于内参基因扩增的体系同上，采用“2^（-ΔΔCt）”法（Livak法）计算基因的相对表达量。每个样品设置3个技术重复，3个生物学重复。

1.4 种子发芽试验

随机选取切去部分胚乳的青稞种子25粒，以正常的青稞种子作为对照，参照国家农作物种子检验规程并进行调整^[20]。在播种后14 d，进行拍照观察记录（每个样品设3次重复）。

2 结果与分析

2.1 不同提取方法获得的DNA浓度和纯度分析

4种提取方法所提取到的青稞籽粒DNA的质量，结果如图1，表2。从图1可知，专利法、碱煮法和改良CTAB法电泳检测时均出现清晰、明亮的电泳条带，表明这3种方法所获得的DNA的浓度和纯度相对较高，质量佳，而传统CTAB法提取的DNA电泳条带相对不明亮、不清晰，表明该方法提取的DNA浓度可能偏低，并且很可能含有多糖或多酚类杂质。

同时利用超微量分光光度计对所获取的DNA进行质量浓度和纯度的检测，结果与电泳结果基本一致（图2，表2）。传统CTAB法提取的DNA的A260/A280与A260/A230两者均偏低，表明样品可能同时存在蛋白质和小分子污染物；专利法提取DNA的A260/A280均值为1.75，A260/A230偏低，表明样品主要为盐或小分子杂质污染，但通常不会影响后续分子生物学试验。

2.2 淀粉合成、抗旱、抗病基因的PCR检测

因DNA样品的纯度、浓度直接影响后续分子实验结果的准确性^[21]，为了验证不同方法提取的DNA样品能否满足后续分子实验要求，本研究以4种不同方法提取的DNA为模板，以青稞β-Tubulin基因作为对照进行PCR扩增，并进行琼脂糖凝胶电泳检测。同时，另外选择了3个青稞品种作为测试品种分别提取DNA进行PCR检测，结果如图3所示，β-Tubulin，淀粉合成相关的BMY、SSS基因，抗旱相关的Dhn6-1、HAV-1基因以及抗病相关的SCQ基因均扩增出目标片段，但使用专利法提取的DNA扩增出的目的条带更清晰。

2.3 不同DNA提取方法的多重PCR检测

本研究以不同方法提取的青稞籽粒DNA为模板，选择查玉紫青稞品种作为测试品种，分别提取其DNA进行多重PCR检测，并进行琼脂糖凝胶电泳检测。多重PCR^[22]采用β-Tubulin、SSS基因以及SCQ基因组合进行扩增，由3对引物同时在同一个体系中进行PCR扩增，在电泳图中扩增条带会分成3层。从图4可以看到电泳条带的清晰程度并不一样，位于上层的SCQ条带和位于下层的β-Tubulin条带比较清晰，而位于中间位置的SSS产生的条带相对于在普通PCR中形成的条较为模糊(图3)，但明显可以看出浸泡36 h的青稞籽粒DNA条带明亮、清晰、单一，且多重PCR实验结果再次提供了一个有力证明，即专利法在提取高质量、无抑制剂、可用于复杂下游分析的DNA方面具有明显优势。

2.4 不同DNA提取方法相对表达量分析

为了进一步明确4种不同方法提取的DNA的质量及在后续分子生物学研究中的应用情况，本试验选用蓝青稞与查玉紫用4种不同方法提取的DNA为模板，以淀粉合成相关基因SSS作为扩增目的基因，用青稞β-Tubulin为对照基因进行qRT-PCR扩增。由图5可知，淀粉合成相关基因SSS在用专利法提取的青稞籽粒DNA中的表达量明显高于其他方法提取的青稞籽粒DNA中的表达量，特别是在浸泡36 h的青稞籽粒中提取的DNA表达量最高，其次是在浸泡24 h的青稞籽粒中表达量高。进一步说明用专利法提取青稞籽粒DNA能够成功获得高质量DNA。

2.5 不同DNA提取方法所需的浸泡时间以及胚乳大小对提取效果的影响

专利方法涉及不同浸泡时间的处理，因此，本试验将不同青稞品种分别浸泡24 h、36 h、42 h、48 h后再进行切胚，观察不同青稞品种在不同浸泡时间下种子吸胀以及种子胚乳切胚的重量以及DNA提取的效果。结果如图6所示，青稞种子在36 h所提取DNA的浓度以及条带相比其他时间较好（图6A），并且种子吸胀速率快（图6B），随着浸泡时间的延长，会出现种子发霉的情况，影响种子后续生长发育。青稞籽粒在不完善粒^[23]占比中间接说明种子在浸泡36 h的效果相比其他时间段好（图6C）。

2.6 青稞种子切除部分胚乳后的生长实验

将青稞种子无胚的一端切去部分胚乳用于提取DNA后（大约为种子粒重的1/2），将含有胚芽的一半均匀播撒于土壤中，放在温暖通风的地方进行培养。结果显示（图7）切去胚乳后的青稞种子均能正常生根发芽，根系与幼苗生长均未受明显影响，表明青稞种子不仅可以在实验室内完成胚乳DNA的提取，还可以利用有胚半粒种子直接进行萌发培养，开展其他后续的研究，如特定基因的跟踪筛选，自交系纯化等。

3 结论与讨论

随着分子生物学的快速发展，探究如何高效快速提取不同类型植物DNA的方法至关重要，近几年报道了大量DNA提取方法^[24-26]，但针对青稞种子DNA提取方法的较少。本试验在课题组前期研究的基础上，采用专利法和其他3种常用的DNA提取方法提取了青稞籽粒DNA，并进行分析。碱煮法步骤简单^[26]，但是由于省去了纯化步骤，所提取的DNA有杂质且浓度偏低（图1，图2），表明提取的DNA中含杂质，提取质量差。两种CTAB法从干湿青稞种子中都能够成功提取到 DNA且结果并无显著差异，但是A260/A280与A260/A230不太理想，表明有部分杂质和RNA残留未去除干净。而专利法与两种CTAB法相比的优势在于从不同青稞品种籽粒中均可获得符合更高要求的DNA，且能保证经过验证的种子能够正常生长，以便于开展后期的试验。

干扰DNA提取的因素很多。根据青稞的化学组成可知，青稞种子中蛋白质含量为10.1%，高于小麦、玉米和水稻，且含有多种矿质元素^[28]。从青稞种子中提取到高质量的DNA就需要去除其他物质的干扰。在使用专利法时，先用提取液将种子浸泡，水浴加热，然后进行研磨，不仅可以使接下来的研磨更充分，而且提取液中高浓度盐可以使植物DNA中的多糖去除得比较彻底，EDTA、SDS 等可以及时与蛋白质、糖类物质等反应，进而保护DNA，得到较为完整纯度较高的DNA。其次，用专利法能在研磨时省去使用液氮研磨的步骤，不仅节省了时间成本和人力物力消耗，更重要的是避免了液氮使所有组织破碎而增加杂质含量^[26]使得提取物的纯度更高。这与紫外分光光度检测结果一致，A260/A280相对更接近1.8，说明小分子物质去除干净，蛋白质与多糖类污染较少；并且提取的DNA浓度不低于其他3种方法。另外，PVP可防止种子中的酚类氧化为醌类，必须注意的是，PVP不可以长期放置，应现用现配。采用多次离心有利于杂质的彻底去除，与以往方法相比，能避免提取到的DNA含有较多糖类等杂质的问题^[27-31]。

另外，用qRT-PCR法可作为检测不同方法提取青稞籽粒DNA品质的可信方法，从图5可获得相对较准确的检测结果。实时荧光PCR技术是DNA定量技术的一次突破，它有效地解决了传统定量只能终点检测的局限，实现了每一轮循环检测一次荧光信号的强度，并记录在电脑软件中，实现对整个过程的实时监测。其次，能减少因污染而产生假阳性的情况。目前，qRT-PCR法对作物DNA含量的定量检测在实际应用中有一定适用性。但在实际生产条件下，由于试验样品采集的误差，或不同品种的作物混合后，因两者物理性质不同而引起粉碎粒度的差异，从而导致DNA抽提不均一，都将造成检测结果的巨大误差，所以还需进一步研究探讨^[32]。此外，利用多重PCR检测来验证不同方法提取青稞籽粒DNA的质量，也从侧面反映出多重PCR相较于单标记PCR，一次可以检测多个基因，方便快捷，节约成本，可用于多基因聚合品种的选择。在实际应用中，引物序列、浓度、退火温度等因素对多重PCR结果都会产生较大影响。本研究采用Piemer 5.0软件中的Multiplex primer功能，对引物二聚体、引物质量等进行检验，设计了差异明显、特异性强的检测标记，本反应体系选用含有高质量重组Taq DNA聚合酶的Master Mix，能提高扩增效率。对引物退火温度的选择，根据多重PCR产生非特异性条带适当提高退火温度，反之降低退火温度的原则，最终将退火温度确定为57 ℃^[33]。本研究通过采用多重PCR这一严格的功能性验证方法，对不同提取方法获得的青稞籽粒DNA质量进行了评估。结果表明，专利法提取的DNA表现出最高的质量，其多重PCR条带清晰、明亮、无杂带，所有目标位点均能高效扩增，这证明该方法能有效去除青稞组织中的PCR抑制剂（如多糖和多酚），并保持良好的DNA完整性。因此，对于后续需要进行多基因位点同步分析的下游应用（如基于PCR的分子标记辅助选择或病原多重检测），专利法是首选方法。且专利法通常操作更简单、耗时更短、更适合高通量提取，这也是其巨大优势。最后，在选取种子时，要尽量选取颗粒饱满的种子，而且在切胚乳时，要注意既不能伤到胚，也不能因为胚乳取样太少而影响DNA提取效果。结果表明，36 h左右的浸泡时间处理最适宜青稞籽粒胚乳DNA的提取。结合图7可知切除部分胚乳的半粒青稞可以正常地萌发、生根发芽，生长发育正常，这对将来开展很多针对青稞单株选择的研究具有重要意义。

参考文献

[1] 冯格格,佘永新,洪思慧,等.青稞中主要功效成分最新研究进展[J].农产品质量与安全,2020,2:82-89.

[2] 周丽娟,李桂萍,蔡士兵,等.黑糯玉米基因组DNA的提取方法[J].淮北师范大学学报(自然科学版),2015,36(3):69-72.

[3] 陈婧,杨引福,郭强.利用SSR标记分析40个糯玉米自交系遗传多样性[J].玉米科学,2009,17(4):32-35.

[4] 高文伟,李晓辉,李新海.玉米单粒和单叶片DNA快速提取及SSR标记分析[J].玉米科学,2004,12(2):111-113.

[5] 王芳,王化俊,王汉宁.玉米基因组DNA的提取及SSR分析[J].玉米科学,2006,14(2):30-32.

[6] 易红梅,张芳,王凤格,等.不同取样方式对DNA快速提取效果的影响[J].华北农学报,2007,5:114-116.

[7] 雷开荣,石春焱,李明顺,等.一种玉米叶片基因组DNA快速提取新方法的初步研究[J].华北农学报,2006,2:10-12.

[8] 穆春华,张发军,李文才,等.玉米叶片基因组快速提取方法研究[J].玉米科学,2010,18(3):170-172.

[9] 央金拉姆,刘祥玺,冯浩铭,等.TaGW2在JM22遗传背景下遗传效应的研究[J].高原农业,2022,6(2):116-121.

[10] 郭新梅,宋希云,徐瑞斌,等.一种保持种子活力的玉米单粒胚乳DNA的提取方法:中国,CN104004746B[P].

[11] 李艺,铁双贵,朱卫红,等.快速CTAB法提取玉米种子胚基因组DNA[J].河南农业科学,2008,2:17-20.

[12] 熊发前,刘俊仙,刘菁,等.花生DNA的五种改良CTAB提取方法的比较分析及其应用[J].分子植物育种,2019,17(7):2207-2216.

[13] 龙有,赵珂,侯璐.青稞种质资源抗条纹病鉴定及抗病基因分子检测[J].四川农业大学学报,2024,42(2):296-305.

[14] 李恒.青稞种质抗旱鉴定与抗旱相关转录因子鉴定[D].西藏林芝:西藏农牧学院,2023.

[15] 杨智敏.青稞AGPase胞质型亚基编码基因的克隆和表达分析[D].四川雅安:四川农业大学,2013.

[16] 郑许光.不同品种青稞籽粒灌浆期淀粉代谢酶活性及基因表达模式的研究[D].新疆石河子:石河子大学,2017.

[17] 钱刚.不同抗旱性青稞LEA2/LEA3蛋白基因的克隆与表达[D].四川成都:中国科学院研究生院(成都生物研究所),2007.

[18] 高玉峰,张攀,郝晓敏,等.一种快速提取玉米大群体基因组DNA的方法[J].中国农业大学学报,2011,16(06):32-36.

[19] 林波,谭支良,肖国樱,等.稻谷中转Bar基因水稻含量的实时荧光定量检测[J].农业现代化研究,2008,5:618-621.

[20] 张毅,王建林,杨洋,等.青稞种子活力测定方法研究[J].高原农业,2018,2(03):237-241+306.

[21] 李慧敏,汪洋,王楠希,等.DNA提取方法对实时荧光定量PCR检测花生过敏原Ara h 2基因的比较研究[J].中国粮油学报,2023,38(07):221-227.

[22] 马增凤,韦敏益,黄大辉,等.多重PCR技术可鉴定杂交水稻种子纯度[J].分子植物育种,2022,20(02):442-447.

[23] 肖学彬,王小庆,符云勇,等.青稞不完善粒检测方法探讨[J].粮食储藏,2018,47(02):55-56.

[24] 孙雨晴,陈立,杨亚会,等.葱属蔬菜作物叶绿体DNA提取及其质量评价体系的建立[J].分子植物育种,2018,16(20): 6802-6807.

[25] 李琳,罗淋淋,罗光宇,等.一种植物基因组DNA快速提取方法的建立与评估[J].深圳大学学报(理工版),2020,37(01):1-8.

[26] 王沙沙,王芳,张涵,等.滤纸法快速提取中药材DNA方法的研究[J].中国现代中药,2020,22(02):213-218.

[27] 袁芳,王靖,王昭凤,等.喜马拉雅紫茉莉不同组织总RNA提取方法的比较分析[J].高原农业,2021,5(05):485-489+523.

[28] 楼巧君,陈亮,罗利军.三种水稻基因组DNA快速提取方法的比较[J].分子植物育种,2005,5:749-752.

[29] 王景雪,孙毅,高武军.一种简便实用的植物总DNA提取方法[J].山西大学学报(自然科学版),2000,3:271-272.

[30] 祝亚辉,闫海亮,金思源,等.青稞多糖对大米淀粉糊化、流变、结构和体外消化特性的影响[J].高原农业,2024,8(05):511-519.

[31] 吕远平,熊茉君,贾利蓉,等.青稞特性及在食品中的应用[J].食品科学,2005,7:266-270.

[32] 李葱葱,王青山,李飞武,等.用实时荧光PCR方法定量检测Bt176转基因玉米[J].吉林农业科学,2007,(05):24-27.

[33] 尹全,李忆,宋君,等.四种转基因玉米多重PCR检测方法的建立[J].湖北农业科学,2016,55(06):1540-1544.

基金资助

山东省重点研发计划（农业良种工程）玉米两高三抗绿色相关基因的克隆与种质创新及品种选育项目(2022LZGC0063)

山东省技术创新引导计划青稞高活性浓浆绿色高效制备技术与高端产品创制项目(YDZX2024004)