褐变抑制剂对苹果酒发酵过程中品质的影响

Influence of Browning Inhibitors on the Quality of Apple Wine during Fermentation Process

摘要

以西藏林芝华硕苹果为原料，探究了褐变抑制剂对苹果果浆褐变抑制情况以及褐变抑制剂对苹果酒发酵过程中品质的影响，旨在为西藏林芝苹果果酒品质提升提供理论依据。试验以褐变抑制率为指标，通过单因素和正交试验优化褐变抑制剂的最佳复合配方；在此基础上，以总酯、酒精、多酚、总黄酮等的含量为评价指标，比较苹果酒发酵前后添加复合褐变抑制剂对其品质的影响。结果表明，复合褐变抑制剂中谷胱甘肽、L-半胱氨酸、抗坏血酸的浓度分别为2、8、20 mmol/L，苹果果浆的褐变抑制率最高。发酵第7 d时，处理组的苹果酒褐变值显著低于对照组（P < 0.05），与对照组相比，褐变值由0.25 52降低至0.2 286；可溶性固形物（TSS）、总糖、总酸、pH值、总酯、乙醇含量均无显著性差异（P > 0.05）；处理组多酚、总黄酮在苹果酒发酵过程中极显著高于对照组（P < 0.01），与对照组相比，多酚、总黄酮含量分别由0.1 430 mg/mL提高至0.3 872 mg/mL、0.0 985 mg/mL提高至0.5 527 mg/mL；处理组L*值显著高于对照组（P < 0.05），L*值由3.44提高至7.24，a*、b*值显著低于对照组（P < 0.05），分别由1.75降低至-1.72、12.98降低至7.36。综上所述，苹果酒发酵前添加复合褐变抑制剂可保持苹果果浆色泽、显著提高苹果果酒功能活性成分。

Abstract

Taking the apples from Linzhi, Xizang as raw materials, this study investigated the inhibitory effect of browning inhibitors on the browning of apple pulp and their influence on the quality of apple wine during fermentation, aiming to provide a theoretical basis for improving the quality of apple wine from Linzhi, Xizang. The browning inhibition rate was used as an indicator to optimize the best compound formula of browning inhibitors through single-factor and orthogonal experiments. On this basis, the contents of total esters, alcohol, polyphenols, and total flavonoids were used as evaluation indicators to compare the effects of adding compound browning inhibitors before and after apple wine fermentation on its quality. The results showed that when the concentrations of glutathione, L-cysteine, and ascorbic acid in the compound browning inhibitor were 2, 8, and 20 mmol/L respectively, the browning inhibition rate of apple pulp was the highest. On the 7th day of fermentation, the browning value of the treated group was significantly lower than that of the control group (P < 0.05), and the browning value decreased from 0.2552 to 0.2286 compared with the control group. There were no significant differences in soluble solids (TSS), total sugar, total acid, pH value, total esters, and ethanol content between the treated group and the control group (P > 0.05). The contents of polyphenols and total flavonoids in the treated group were significantly higher than those in the control group during the fermentation process of apple wine (P < 0.01), and the contents of polyphenols and total flavonoids increased from 0.1430 mg/mL to 0.3872 mg/mL and from 0.0985 mg/mL to 0.5527 mg/mL, respectively, compared with the control group. The L* value of the treated group was significantly higher than that of the control group (P < 0.05), and the L* value increased from 3.44 to 7.24. The a* and b* values of the treated group were significantly lower than those of the control group (P < 0.05), and decreased from 1.75 to -1.72 and from 12.98 to 7.36, respectively. In conclusion, adding compound browning inhibitors before apple wine fermentation can maintain the color of apple pulp and significantly increase the functional active components of apple wine.

Graphical abstract

关键词

褐变抑制剂 / 苹果酒发酵 / 色泽 / 功能活性成分

Key words

Browning inhibitor / Apple wine fermentation / Color / Functional active components

苹果（Malus pumila Mill）属于蔷薇科（Rosaceae）苹果属（Malus domestica Borkh.）。富含多酚类、黄酮类化合物、维生素类、矿物质类及膳食纤维等功能性成分，对人体健康有延缓衰老、防癌、提高免疫力等功效^[1]。林芝地区尼洋河畔为干热河谷型气候^[2]，土壤呈微酸性^[3]，适宜苹果、光核桃^[4]、梨^[5]、草莓^[6]和葡萄^[7]等水果种植。林芝地处藏东南，受水果运输难度大、物流成本高等因素限制，难以以鲜果形式销售，急需进行精深加工赋予其高附加值^[8]。果酒是一种能更有效地保留果浆原始风味和营养的产品^[9]，不仅可以拓展不耐贮藏的林芝水果开发新途径，还能满足不同消费者的追求和喜好，具有广阔的发展前景。

林芝苹果因独特的高原生长环境，其营养成分丰富，但在储存和酿造苹果酒的过程中极易因大量的酚类物质氧化导致产品褐变，造成果酒品质和商品价值下降。现有研究发现，在果酒中添加抗氧化剂可有效抑制产品褐变^[10]。抗坏血酸（VC）是一种天然抗氧化剂，具有强还原性，其强酸性还可降低产品pH，是良好的果浆护色剂，其不仅能消耗反应体系中的氧，还可将体系中的醌类及其衍生物还原成酚，阻止醌类物质进一步自发聚合形成色素物质，从而抑制酶促反应的进行^[11]。谷胱甘肽是一种具有重要生理功能的活性三肽，具有抗氧化、抑制褐变等功能；在食品加工领域，它可以起到改善食品风味和增加营养价值的作用，不仅可通过分子中的巯基（-SH）直接中和自由基，减少氧化应激对果酒成分的破坏，还能减少产品不良风味，改善产品风味和香气^[12,13]。L-半胱氨酸是含硫氨基酸，具有还原功能，通过自身的氨基、羧基和巯基等基团与醌作用生成稳定的无色化合物，阻断褐变^[14]。此外，L-半胱氨酸还能防止反应物的氧化作用于褐变中间体α-β-不饱和烯醇基性化合物，使其处于非活化状态，从而阻止黑色素的生成，减少褐变^[15]。

陈坚生等^[16]研究了果酒中酚类物质及其非酶褐变，结果表明谷胱甘肽（GSH）对果酒的氧化褐变有良好的抑制作用。朱志方等^[17]研究了谷胱甘肽添加对蓝莓果酱品质的影响，结果表明，谷胱甘肽的添加可减缓持水力、多酚及花色苷含量的下降程度，还能显著提升样品的亮度L*值（P < 0.05），保护蓝莓果酱的色泽。林巧等^[18]研究了VC对樱桃酒的抗氧化性试验，结果表明，VC添加量为110 mg/L，多酚和黄酮含量以及清除羟自由基能力最好。薛楚然等^[14]研究了荔枝酒褐变抑制工艺，结果表明，荔枝酒褐变抑制剂的最佳配方为L-半胱氨酸8.46 mmol/L、谷胱甘肽1.16 mmol/L、EDTA-Na 21.87 mmol/L、柠檬酸1.89 mmol/L，在此条件下，预测褐变抑制率为47.89%，实际值为50.18%，实际值与预测值吻合率达95.44%。近年来许多研究采用复合抑制剂控制果蔬褐变，目前已在安梨^[19]、紫番薯^[20]和百合^[21]等果蔬植物中取得了良好的褐变控制效果。

本研究以西藏林芝华硕苹果作为原料，采用VC、谷胱甘肽和L-半胱氨酸对苹果进行褐变抑制处理，通过单因素和正交试验优化最佳褐变抑制参数，对褐变未处理组（对照组）和处理组（处理组）苹果进行酵母菌发酵，测定苹果果酒不同发酵时间的品质指标和褐变值，旨在为提高林芝苹果褐变抑制控制提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

苹果：9月采摘于西藏林芝市巴宜区嘎啦农场，糖浓度为32.3 496 mg/g；VC：西格玛奥德里奇（无锡）生化科技有限公司；谷胱甘肽、L-半胱氨酸：建达生物科技有限公司；食品级白砂糖：营口太古食品有限公司；食品级发酵酵母BV818：安琪酵母股份有限公司。

1.2 仪器与设备

JYZ-V18A榨汁机：九阳股份有限公司；ReadMax1900光吸收型全波长酶标仪：上海闪谱生物科技有限公司；HWS-24恒温水浴锅：上海齐欣科学仪器有限公司；XS105DU电子天平：瑞士Mettler公司。

1.3 试验方法

1.3.1 复合褐变抑制剂配比单因素试验

谷胱甘肽浓度为0.4、0.8、1.2、1.6、2.0 mmol/L，L-半胱氨酸浓度为2、4、6、8、10 mmol/L，VC浓度为5、10、15、20、25 mmol/L的褐变抑制剂；将褐变抑制剂与苹果以质量比为1:2进行混合、打浆、过滤，静置48 h后测定抑制褐变率。

1.3.2 复合褐变抑制剂配比正交试验

在单因素试验基础上，以谷胱甘肽浓度、L-半胱氨酸浓度、VC浓度为因素，以抑制褐变率为评价指标，设计L₉（3⁴）正交试验，每组平行测定3次，因素水平表见表1。

1.3.3 苹果果酒发酵过程

清洗→去皮→护色处理→榨汁→酶解→高温灭菌→酵母活化→加入酵母→发酵→成品

操作要点：清洗苹果表面，放置阴凉处晾干去皮，然后将苹果去核后切成规则的小块，将苹果与护色剂溶液以质量比为1:2混合，使用榨汁机打浆。称取适量酵母，按照1:10溶于蒸馏水中，于37 ℃隔水活化20 min。添加7%蔗糖，常温下发酵一周。

1.4 苹果浆不同发酵阶段理化指标及微生物的测定

1.4.1 理化指标的测定

pH值：采用PHS-3C pH计测定pH值；总糖、总酸按照《葡萄酒、果酒通用分析方法》（GB/T 15038—2006）进行测定；可溶性固形物：采用手持糖度计测定；总酯按照《白酒中总酯的试验方法》（GB 10345.5—1989）进行测定；多酚、黄酮含量参考冯雨的方法进行测定^[22]。

1.4.2 褐变值的测定

参考李阔等^[19]的方法，取发酵的苹果果酒的上清液20 μL作为待测样。利用酶标仪，以蒸馏水和未处理组作对照，于波长420 nm处测定苹果果酒上清液的吸光度值，用吸光度值反映苹果果酒褐变值。试验重复3次。

1.4.3 褐变抑制率的测定

参考李阔等^[19]的方法测定褐变抑制率，用分光光度计于420 nm处测定48 h后苹果浆的褐变度，计算褐变抑制率。见公式：

\mathrm{褐变}\mathrm{抑制}\mathrm{率}(\mathrm{\%})=(A_{\mathrm{1}}-A_{\mathrm{2}})/A_{\mathrm{1}}\times \mathrm{100}\mathrm{\%}(1)

A₁为未添加褐变抑制剂在420 nm测得的吸光度值；A₂为添加褐变抑制剂在420 nm测得的吸光度值。

1.4.4 乙醇含量的测定

参照贺慧琳等^[23]的方法，取发酵的苹果果酒的上清液1 mL作为待测样。将待测样装入25 mL比色管中，再加入浓度为50.0 g/L重铬酸钾溶液5 mL和硫酸溶液（50:50，v/v）2.5 mL，再用蒸馏水定容至25 mL于100 ℃水浴15 min，后利用酶标仪，以蒸馏水和处理组作对照，于波长585 nm处测定吸光度值，用吸光度值表示乙醇含量。

1.4.5 色泽指标测定

参考范昊安等^[24]的方法，以透射模式10°观察模式测定样品L*、a*、b*值；其中L*表示亮度值（0为黑色，100为白色），a*值表示绿红值（a* > 0为红色，a* < 0为绿色），b*表示蓝黄值（b* > 0为黄色，b* < 0为蓝色）；用ΔE（色差值）描述样品的颜色变化。计算公式如下：

\mathrm{\Delta }E=[(\mathrm{\Delta }{L}^{\mathrm{*}}{)}^{\mathrm{2}}+(\Delta a^{\mathrm{*}}{)}^{\mathrm{2}}+(\Delta b^{\mathrm{*}}{)}^{\mathrm{2}}{]}^{\mathrm{1}/\mathrm{2}}(2)

1.5 数据统计

Microsoft Excel 2021软件进行数据整理，采用SPSS 23.30软件进行单因素ANOVA分析和正交试验设计，数据结果使用Origin 2021对数据进行制图。

2 结果与分析

2.1 苹果浆褐变抑制剂单因素分析

由图1可知，随着谷胱甘肽浓度的增加，褐变抑制率呈逐渐上升趋势，当浓度达到1.6 mmol/L时，褐变抑制率最大；谷胱甘肽（Glutathione）是由L-谷氨酸、L-半胱氨酸和甘氨酸缩合而成的生物活性三肽化合物^[25]，L-半胱氨酸的浓度在4 mmol/L后就不随浓度的增加而增加，当浓度达到8 mmol/L时，褐变抑制率最大；L-半胱氨酸和谷胱甘肽均具有巯基官能团，能够抑制PPO的活性，进而抑制果蔬褐变。VC抑制褐变是通过将由PPO形成的邻醌还原为前体邻二酚，随后邻二酚再次被氧化。这种氧化还原循环持续至 VC 耗尽棕色色素仍会形成。VC是食品加工过程中常用的抗氧化剂，VC的浓度在5 mmol/L时褐变抑制率最低，后期随着VC浓度的增加，褐变抑制率无显著性变化。综上所述，选择谷胱甘肽为1.2、1.6、2.0 mmol/L，L-半胱氨酸为4、6、8 mmol/L，VC为10、15、20 mmol/L进行后期正交试验。

2.2 苹果防褐变试验正交试验

在单因素试验基础上，选用VC、L-半胱氨酸、谷胱甘肽作为苹果酒复合护色剂的组成成分，并进行正交试验。以苹果浆褐变抑制率为考察指标，确定复合护色剂的最佳配比组合，正交试验因素与水平见表2。

由表2分析可知，通过极差分析得出3种不同添加量褐变抑制剂主次影响为C>B>A，即VC>L-半胱氨酸＞谷胱甘肽，根据表3方差分析中的F值，同样得出对褐变抑制率影响最大的是VC，其次是L-半胱氨酸，最后是谷胱甘肽。其中VC对苹果褐变抑制率具有显著性影响（P < 0.01），而谷胱甘肽和L-半胱氨酸对苹果褐变抑制率不存在显著影响（P > 0.05）。最优组合为A₃B₃C₃，谷胱甘肽、L-半胱氨酸、VC的最优浓度分别为2、8、20 mmol/L。因此，选择2 mmol/L谷胱甘肽、8 mmol/L L-半胱氨酸、20 mmol/L VC对苹果果浆处理后发酵，得到如图3所示的处理组和未处理组苹果酒。

2.3 苹果果酒发酵过程中的品质分析

为了全面了解褐变抑制剂对于果酒发酵品质的影响，测定7 d发酵过程中褐变度、TSS、总糖、总酸、总酯、乙醇含量、pH值、色差、多酚、总黄酮等相应指标。

2.3.1 苹果果酒发酵过程中褐变值的变化

从图4可知，在发酵期间添加褐变抑制剂的处理组，其褐变值先小范围上升后又恢复到与原果浆褐变值相似的水平；而未添加褐变抑制剂的对照组，随着发酵时间的延长，褐变值一直在增大，两者具有显著性差异。原因是破碎后PPO活性极高，未加抑制剂时褐变值快速上升；加入抑制剂后，酶促褐变被迅速抑制，褐变值增幅显著降低。而处理组在第3 d到第5 d褐变值略有上升，可能是微氧环境下多酚发生缓慢氧化所致。

2.3.2 苹果果酒发酵过程中总糖含量和TSS的变化

从图5可知，在发酵过程中，总糖含量和TSS呈现下降后趋于稳定的趋势。总糖含量和TSS下降是由于在果酒发酵过程中，酵母菌在初期进行有氧呼吸大量繁殖并消耗糖分；随着发酵进行，糖分又转化为CO₂和酒精以及少量的发酵副产品。

2.3.3 苹果果酒发酵过程中总酸含量和pH值的变化

从图6可知，总酸含量从发酵初期就开始呈现下降趋势，最后逐步趋于稳定；而pH总体呈现上升趋势。从处理组与对照组的数据对比来看，是否加入褐变抑制剂对总酸含量的影响不大。而加入了褐变抑制剂会降低果酒pH但总体趋势不变，是由于复合型褐变抑制剂中的VC具有酸的性质，能降低体系pH。总酸含量降低是由于一些酸类物质在微生物的作用下被分解及利用，如乙酸乙酯的合成途径，酵母在酯化酶的作用下，催化乙酸和乙醇直接合成乙酸乙酯，从而导致总酸含量逐渐降低，pH值升高^[26]。

2.3.4 苹果果酒发酵过程中总酯含量和乙醇的变化

从图7可知，在发酵过程中，总酯含量呈现上升后下降，再持续上升，最后趋于稳定的状态。而乙醇含量呈先下降后上升，最后趋于稳定的趋势。处理组在发酵前3 d总酯含量呈现上升状态，是由于酵母发生代谢，以及苹果本身含有的一些脂肪酶、酯酶等发生酶促反应，它们能够催化苹果中的脂肪酸与醇类发生酯化反应，从而生成酯类物质，使总酯含量逐渐增加。而在第3 d到第5 d，随着发酵过程中酯类发生水解与降解，酵母衰亡或底物耗尽，体系中残留的酯酶、脂肪酶或微生物产生的水解酶会催化酯类逆反应，导致酯类分解为酸和醇，尤其在酸性环境中，水解速率加快。氧化反应（如酯类与多酚氧化酶作用）可能导致酯类结构破坏，生成醛、酮等异味物质，总酯含量降低。而发酵后期，总酯含量又升高，是由于pH趋于稳定、厌氧环境抑制酯类氧化等原因，导致总酯含量有小范围上升，最后趋于稳定。乙醇含量先下降，是由于在发酵前期，酵母菌进行有氧呼吸不产生酒精；到第5 d之后，开始进行无氧呼吸产生酒精，酒精度升高，直到发酵结束，乙醇含量趋于稳定。

2.3.5 苹果果酒发酵过程中色泽指标的变化

色泽也是衡量果酒品质的重要物理指标之一，同时也可以反映苹果果酒在发酵过程中的褐变状况。从图8可知，L*值小范围波动后呈现上升趋势，可以直观反映苹果果酒加工过程中褐变抑制剂防止褐变的发生。在发酵过程中，a*总体变化不大，没有颜色加深的趋势；而b*在发酵前期下降，说明果酒发酵过程中发生了褐变，后续呈现上升趋势，反映了褐变抑制剂起作用，褐变过程被抑制。从结果来看，苹果果酒总体呈现淡黄色，与原果浆对比颜色变化不大，复色、护色效果明显。ΔE代表色差值，发酵过程中ΔE先下降后上升最后趋于稳定。色差值ΔE下降说明褐变抑制剂刚加入就得到了明显效果，随着发酵时间延长，色差值ΔE逐渐上升，说明在发酵过程中发生了褐变，并逐步趋于稳定状态，说明在果浆发酵为果酒的过程中褐变抑制剂保持了其综合色度，起到有效的护色复色效果。

2.3.6 苹果果酒发酵过程中多酚含量和黄酮含量的变化

从图9可知，果酒发酵过程中多酚含量先上升后下降再短暂上升。而黄酮含量先骤降后上升最后持续下降至稳定状态。处理组和对照组在发酵过程中多酚和黄酮含量有明显差异，原因在于添加的复合型褐变抑制剂可以抑制多酚氧化酶（PPO）活性，保护多酚。并且低温发酵可以抑制氧化酶活性，保留更多多酚。

在发酵前期苹果破碎后，果肉细胞结构被破坏，原本存在于液泡和细胞壁中的游离态多酚及结合态多酚释放到果浆中，导致总多酚含量短暂上升。在第3 d到第5 d，苹果中天然存在的PPO和过氧化物酶（POD）在有氧条件下催化多酚氧化，生成邻苯醌类中间产物，进而发生分子间聚合形成黑色素或聚合物，导致多酚含量下降。发酵到第5 d后，随着乙醇浓度升高，多酚的溶解度增加，部分不溶于水的疏水多酚因乙醇的助溶作用释放，含量略微增加。

在发酵前期苹果中的PPO优先催化邻苯二酚结构的黄酮类化合物氧化，生成邻苯醌中间体，进而聚合形成不溶性黑色素或高聚物，导致黄酮含量快速下降。在第2 d到第4 d，部分酵母分泌的β-葡萄糖苷酶可水解黄酮糖苷，释放游离苷元，可能使单一黄酮含量短暂升高。并且随着乙醇浓度升高，黄酮苷的溶解度提高，而黄酮苷元可能因乙醇的助溶作用导致部分溶解，抵消部分吸附损失，导致黄酮含量暂时升高。发酵到第4 d后，总体环境稳定，由于酒精含量升高促进蛋白质、多糖的相互作用，形成黄酮—蛋白复合物沉淀；pH值降低加剧黄酮氧化，同时促进黄酮与金属离子的螯合等原因，黄酮含量持续下降直至达到稳定的状态。

3 结论

本研究以林芝华硕苹果为原料，采用BV818酵母菌发酵果酒，在复合褐变抑制剂配比单因素试验基础上进行正交试验确定复合护色剂最佳组合为谷胱甘肽2 mmol/L、L-半胱氨酸8 mmol/L、VC 20 mmol/L，此配方下苹果果浆放置2 d后测得褐变度最低；在前述苹果果浆褐变抑制试验基础上，添加质量分数为7%的白砂糖、2%的酵母常温条件下进行发酵，以未加护色剂为对照组对果酒发酵过程中褐变值、黄酮、多酚，以及产品L*、a*、b*、ΔE等相关指标进行测定发现，处理组和对照组间具有显著差异，说明复合型褐变抑制剂不仅护色性能优良，还可抑制PPO的活性，通过保留更多黄酮、多酚类物质从而提高果酒品质，且对总酯、乙醇、总糖、总酸、pH、TSS 等指标无显著影响。综上所述，在苹果果酒发酵过程中加入褐变抑制剂不仅能维持果酒自身色泽，还能保留产品多酚、黄酮含量，从而提高果酒的综合品质。

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基金资助

西藏农牧学院青年科学基金项目(NYQNKY2023-03)

西藏自治区科技计划重点研发项目(XZ202401ZY0039)

西藏林芝科技计划项目(2023-XYQ-006)

研究生教育创新计划项目(YJS2025-38)